Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52262

⸱

4 lutego 2015

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego raportu jest opisanie protokołów pozyskiwania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) przy użyciu różnych rozmiarów ciał embrionalnych.

Streszczenie

Pluripotencjalne komórki macierzyste posiadają zdolność do nieograniczonego namnażania się i różnicowania w prawie każdy typ komórek. Ponadto rozwój technik przeprogramowywania komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) wzbudził zainteresowanie i podekscytowanie możliwością spersonalizowanej osobistej medycyny regeneracyjnej. Jednak skuteczność różnicowania komórek macierzystych w kierunku pożądanej linii pozostaje niska. Celem tego badania jest opisanie protokołu wyprowadzania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z komórek iPS (iPS-RPE) poprzez zastosowanie podejścia inżynierii tkankowej w celu wygenerowania jednorodnych populacji ciał zarodkowych (EB), powszechnego produktu pośredniego podczas różnicowania in vitro. W protokole stosuje się tworzenie określonej wielkości EB przy użyciu technologii płytek mikrodołkowych. Wyjaśniono również metody identyfikacji markerów białkowych i genowych RPE za pomocą immunocytochemii i reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Na koniec opisano skuteczność różnicowania w różnych rozmiarach EB monitorowaną za pomocą analizy markerów RPE za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Techniki te ułatwią różnicowanie komórek iPS w RPE do przyszłych zastosowań.

Wprowadzenie

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) to rodzaj pluripotencjalnych komórek macierzystych uzyskanych przez przeprogramowanie dorosłych komórek za pomocą czynników zewnętrznych1. Natomiast embrionalne komórki macierzyste (ESC), inny rodzaj pluripotencjalnych komórek macierzystych, są generowane z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty2-3. Pomimo swojego odmiennego pochodzenia, komórki iPS i ESC są porównywalne pod względem nieograniczonej zdolności do replikacji in vitro oraz zdolności do różnicowania się w dowolny typ komórek4-5. Te cechy komórek iPS sprawiają, że są one idealnymi kandydatami do zastosowań w spersonalizowanej medycynie regeneracyjnej. Ostatnie wysiłki badawcze koncentrują się na opracowaniu solidnych protokołów różnicowania do wytwarzania wyspecjalizowanych dorosłych komórek, w tym nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE)6-11.

Dla potencjalnych zastosowań klinicznych komórek pochodzących z iPS, niezbędne jest ukierunkowane różnicowanie dla tego konkretnego typu komórek. Opublikowano różne metody ukierunkowanego różnicowania zarówno komórek ESC, jak i iPS w RPE, które różnią się znacznie pod względem wydajności6-7, 12-16. Nadal nie znamy wielu zdarzeń molekularnych, które rządzą losem komórki/tkanki podczas rozwoju lub różnicowania. W ostatnich latach podjęto wysiłki w celu opracowania protokołu różnicowania, który może w jak największym stopniu naśladować rozwój embrionalny. Podczas fazy blastocysty niezaangażowana populacja komórek macierzystych znajduje się razem w trójwymiarowym mikrośrodowisku. W związku z tym zastosowano różne strategie, aby komórki ESC/iPS zostały połączone ze sobą i wyhodowane w trzech wymiarach. Te agregaty komórek macierzystych nazywane są ciałami embrionoidalnymi (EB). Badania wykazały, że różnicowanie komórek macierzystych EB naśladuje wczesny etap rozwoju zarodka i może spontanicznie prowadzić do powstania prymitywnej endodermy na jego zewnętrznej powierzchni. Później, wraz z postępem rozwoju EB, pojawiają się zróżnicowane fenotypy komórek wszystkich trzech linii zarodkowych17-18. W związku z tym protokoły różnicowania oparte na EB przyciągnęły wiele uwagi w zakresie różnicowania in vitro komórek ESC/iPS i są dobrym kandydatem do generowania RPE z pluripotencjalnych komórek macierzystych13.

EBs można tworzyć za pomocą kilku metod z komórek ESC/iPS. Początkowo EB wytwarzano poprzez zeskrobywanie przylegających kolonii i utrzymywanie ich w nieprzylegającej kulturze zawiesinowej. Jednak takie podejście daje niejednorodną populację EB, która powoduje niską odtwarzalność. Hodowla komórek opadowych w zawieszeniu i tworzenie EB na bazie mikrostudzienek to inne popularne techniki tworzenia EB, które dają jednorodne EB o określonych rozmiarach, które są wysoce powtarzalne. Co więcej, technika mikrostudzienki może dać dużą liczbę kruszyw przy mniejszym wysiłku.

Różnicowanie komórek w obrębie EB jest regulowane przez multipleks morfogennych sygnałów z zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego mikrośrodowiska. W przeciwieństwie do różnicowania w formacie jednowarstwowym, EB stanowią platformę do złożonego składania komórek i zachodzenia sygnalizacji międzykomórkowej17. Co ciekawe, zaobserwowano, że liczba pluripotencjalnych komórek macierzystych wykorzystywanych do wytwarzania pojedynczych EB wpływa na losy komórek. Na przykład w badaniu różnicowania układu krwiotwórczego ludzkich ESC zaobserwowano, że 500-komórkowa EB promowała różnicowanie w kierunku linii szpikowej, podczas gdy 1000-komórkowa EB przesuwała się w kierunku linii erytroidalnej20. W innym badaniu mniejsze EB sprzyjały różnicowaniu endodermy, podczas gdy większe EB sprzyjały różnicowaniu neuroektodermy1, 17.

Te wcześniejsze badania zdecydowanie sugerują, że liczba komórek ESC/iPS używanych do wytwarzania indywidualnych EB wpływa na różnicowanie EB na podstawie dowolnych typów komórek. Jednak, zgodnie z naszą wiedzą, nie ma obecnie żadnych badań, które wyjaśniłyby wpływ wielkości EB na jej skłonność do różnicowania w kierunku RPE. Celem pracy jest scharakteryzowanie wpływu wielkości EB na różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) - nabłonka barwnikowego siatkówki (iPS-RPE) oraz określenie optymalnej liczby komórek do wytworzenia EB do ukierunkowanego różnicowania w kierunku linii RPE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników do hodowli i płytek hodowlanych

  1. Przygotuj pożywkę do hodowli komórek macierzystych bez karmy, dodając 100 ml 5x suplementu bez surowicy do 400 ml pożywki bazowej dla komórek macierzystych. Pożywka jest stabilna w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni i w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy.
  2. Dodać 10 μM roztworu związanego z rho, zwiniętego zwoju zawierającego inhibitor kinazy białkowej (Rock) (Y-27362) do dostępnej w handlu pożywki do tworzenia ciał zarodkowych (EB).
  3. Przygotować pożywkę różnicującą, dodając 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 2 mM L-glutaminy, 10% zamiennika surowicy nokautującej (KSR) i 10 μg/ml gentamycyny do zmodyfikowanej mieszanki Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12).
  4. Przygotuj pożywkę iPS-RPE, dodając 1x suplement N1, 0,1 mM aminokwasów endogennych, 250 μg/ml tauryny, 13 ng/ml soli sodowej trójjodo-L-tyroniny, 20 ng/ml hydrokortyzonu, 5 μg/ml gentamycyny i 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) 21 do minimum niezbędnego orła (MEM). Dostosować pH do 7,4.
  5. Przygotować roztwór podstawowy soli sodowej trijodo-L-tyroniny. Rozpuścić 1 mg soli sodowej trijodo-L-tyroniny w 1 N wodorotlenku sodu, delikatnie obracając. Dodać 49 ml MEM, aby uzyskać 50 ml 20 μg/ml soli sodowej trójjodo-L-tyroniny. Przygotować porcje i zamrozić w temperaturze -20 °C do czasu, aż będą potrzebne. Użyj odpowiedniej objętości, aby osiągnąć pożądane stężenie w końcowej pożywce hodowlanej.
  6. Przygotować roztwór podstawowy hydrokortyzonu. Rozpuścić 1 mg hydrokortyzonu w 1 ml 100% etanolu przez delikatne mieszanie. Dodać 19 ml MEM, aby uzyskać 20 ml roztworu podstawowego hydrokortyzonu o stężeniu 50 μg/ml. Porcjować i zamrażać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebna. Użyj odpowiedniej objętości, aby osiągnąć pożądane stężenie w końcowej pożywce hodowlanej.
  7. Przygotować roztwór roboczy dypazy o stężeniu 1 mg/ml w DMEM/F12.
  8. Przygotowanie płyt pokrytych matrycą
    1. Przygotować matrycę białkową ekstrahowaną z komórek mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) w DMEM/F12 do 0,08 mg/ml. Pokryj każdą studzienkę płytki 6-dołkowej 1 ml roztworu matrycy. Inkubować powlekane płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Po 1 godzinnej inkubacji odessać nadmiar DMEM/F12. Dodać 0,5 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych bez podajnika, aby zapobiec wysuszeniu studzienek. Płyty pokryte matrycą są gotowe do użycia.
  9. Przygotować płytki mikrodołkowe, przepłukując każdą studzienkę 2 ml DMEM/F12. Usunąć DMEM/F12 i dodać 0,5 ml pożywki do tworzenia EB uzupełnionej inhibitorem skał do każdej studzienki. Odwirować płytkę o masie 2 000 x g przez 5 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
  10. Przygotować bufor barwiący FACS, mieszając 2% FBS i 0,09% azydku sodu w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS). Dostosować bufor do pH 7,4.
  11. Przygotuj roztwór neutralizujący trypsynę, dodając 10% FBS do DMEM/F12.

2. Kultura iPS

  1. Przed wysiewem komórek iPS należy podgrzać pożywkę do hodowli komórek macierzystych bez karmnika do temperatury 37 °C i przygotować płytki pokryte matrycą.
  2. Szybko rozmrozić ogniwa IMR90-1 iPS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Następnie wyjąć kriofiolkę z łaźni wodnej i przetrzeć fiolkę 70% etanolem. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 2 ml, aby zminimalizować pękanie grudek komórek.
  3. Kroplami dodaj 5 ml ciepłej pożywki do hodowli komórek macierzystych bez karmnika do komórek i delikatnie wymieszaj. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
  4. Ostrożnie ponownie zawiesić grudki komórek w 2 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych bez podajnika i wysiać grudki komórek w dołkach płytki pokrytej matrycą. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C o wilgotności 5%CO 2 i wilgotności 95%.
  5. Codziennie zmieniaj pożywkę do hodowli komórek iPS. Obserwuj niezróżnicowane kolonie od pięciu do siedmiu dni po wysianiu. Sprawdź, czy pod mikroskopem świetlnym nie ma niezróżnicowanych kolonii, które są gotowe do przejścia (kolonie o gęstym środku).

3. Pasażowanie komórek iPS

  1. Przed rozpoczęciem pasażu komórek iPS należy ogrzać roztwór dispazy, DMEM/F12 i pożywkę do hodowli komórek macierzystych bez podawania do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
  2. Przed pasażowaniem komórek iPS należy usunąć wszelkie obszary różnicowania, zeskrobując obszar i odsysając pożywkę. Ostrożnie przepłucz komórki iPS za pomocą 2 ml DMEM/F12.
  3. Dodać 1 ml 1 mg/ml dypazy do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 minut. Odessać dypazę i delikatnie przepłukać kolonie komórkowe 2 ml DMEM/F12 dwa razy. Po wypłukaniu dodaj 2 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych bez podawania do każdego dołka.
  4. Za pomocą pipety o pojemności 5 ml delikatnie zeskrobać kolonie płytki, aby utworzyć grudki komórek. Przenieść oderwane grudki komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj wystarczającą ilość pożywki do hodowli komórek macierzystych bez karmienia, aby zasiać następne pasaże komórek.

4. Generowanie EB za pomocą płytek Microwell

  1. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki iPS
    1. Usunąć pożywkę z komórek iPS i przepłukać komórki iPS 2 ml DMEM/F12. Dodać 750 μl akutazy do komórek iPS w każdym dołku płytki 6-dołkowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby umożliwić oderwaniu się komórek od płytki (około 5-10 min).
    2. Za pomocą pipety delikatnie oddzielić pozostałe komórki i odłączyć wszelkie pozostałe komórki na powierzchni płytki. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać płytkę 5 ml DMEM/F12 i połączyć przepłukany DMEM/F12 z komórkami w stożkowej probówce. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm, aby usunąć wszelkie możliwe resztki skrzepów komórek.
    3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia akutazy. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do tworzenia EB tak, aby stężenie komórek wynosiło około 0,5-1,0 x 107 komórek/ml.
    4. Określ liczbę żywotnych komórek, licząc komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
  2. Regulacja gęstości komórek w mikrostudzienkach w celu utworzenia EB o kontrolowanej wielkości
    1. Dostosuj liczbę komórek do każdego dołka płytki mikrodołkowej, aby wygenerować pożądane rozmiary EB. Dodaj komórki do mikrostudzienek płytek przygotowanych w kroku 1.9, równomiernie rozprowadź komórki, delikatnie pipetując komórki kilka razy.
      UWAGA: Liczba komórek wymaganych na studzienkę = żądana liczba komórek na EB x liczba mikrodołków na studzienkę.
    2. Doprowadzić pożywkę do tworzenia EB uzupełnioną inhibitorem skały w studzienkach do końcowej objętości 2,0 ml. Rozprowadzić komórki, delikatnie pipetując każdą studzienkę. Odwirować płytki mikrodołkowe o masie 100 x g przez 3 minuty. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 95% przez 24 godziny.
  3. Pobieranie EB z płytek mikrodołkowych
    1. Zebrać EB z mikrostudzienek, pipetując pożywkę w studzience w górę i w dół za pomocą mikropipetora o pojemności 1 ml w celu usunięcia większości EB. Przepuścić zawiesinę EB przez odwrócone sitko o wielkości 40 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml w celu usunięcia pojedynczych komórek.
    2. Umyj płytkę mikrodołkową 5 razy 1 ml DMEM/F12, aby usunąć wszystkie EBs. Zebrać popłuczyny i przepuścić przez sitko z odwróconymi komórkami. Obróć sitko do komórek prawą stroną do góry do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zebrać EBs, przemywając pożywką do tworzenia EB. Policz EBs, aby określić wydajność.

5. Poszycie EB i inicjowanie różnicowania

  1. Płytkować EB na matrycy białkowej pokrytej sześciodołkowymi płytkami (jak w kroku 1.8.1) o gęstości < 1,000 EB/studzienkę w pożywce do tworzenia EB plus 10 μM Inhibitor skały. Inkubować EB w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% przez 24 godziny.
  2. 24 godziny po posiewie EB zastąp pożywką różnicującą, aby zainicjować różnicowanie. Zmieniaj połowę pożywki różnicującej co drugi dzień, aż komórki zostaną zebrane do dalszej analizy.
  3. Pobrać próbki w 6, 17, 29 i 60 dniu, aby przeprowadzić RT-PCR, immunocytochemię i FACS w celu walidacji ekspresji charakterystycznych genów i białek RPE.

6. Ekstrakcja RNA i PCR

  1. Ekstrahować RNA z próbek EB zgodnie z instrukcjami zawartymi w dostępnym na rynku zestawie. Określ stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
  2. Wykonaj odwrotną transkrypcję na 100 ng całkowitego RNA zgodnie z dostępnym na rynku zestawem odwrotnej transkrypcji RNA do cDNA.
  3. Przeprowadzić PCR z 10 ng cDNA przy użyciu następujących starterów (Tabela 1) w stężeniu 10 μmol / 10 ng cDNA. Ustawić PCR w następujący sposób: denaturować DNA w temperaturze 95 °C przez 5 minut, amplifikować w 35 cyklach w temperaturze 95 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 1 minutę, a następnie cykl końcowy w temperaturze 72 °C przez 10 minut. Uruchom produkt PCR na 1% żelu agarozowym.

7. Immunocytochemia

  1. Przemyć EBs za pomocą PBS dwa razy w temperaturze pokojowej skutków. Utrwalić EBs w temperaturze pokojowej w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut. Spłukać raz PBS w temperaturze pokojowej stężenia. Przechowywać próbki w PBS w temperaturze 4 °C do momentu użycia do barwienia.
  2. W dniu barwienia potraktuj utrwalone komórki odczynnikami do utrwalania i przepuszczalności. Próbki inkubować z roztworem blokującym (10% surowica kozia w roztworze przepuszczalnym) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Przeprowadzić immunochemię w 10% surowicy koziej w roztworze przepuszczalnym, stosując następujące przeciwciała pierwszorzędowe we wskazanych rozcieńczeniach: anty-Pax6 (1:10), anty-RX (1:200), anty-MITF (1:30) i anty-ZO1 (1:100). Inkubować próbki z odpowiednimi przeciwciałami O/N w temperaturze 4 °C.
  4. Następnego dnia usuń pierwotne przeciwciało z komórek i trzykrotnie przepłucz próbki PBS. Próbki inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Usunąć przeciwciało drugorzędowe z komórek i przepłukać próbki trzykrotnie w PBS. Zamontować szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych z medium montażowym zawierającym DAPI i pozostawić próbki do zastygnięcia O/N w ciemnej komorze. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby uwidocznić barwienie.

8. Barwienie do analizy FACS

  1. Umyj wyhodowane EB w PBS dwa razy. Inkubować EB z 0,5 ml 0,25% trypsyny przez 5-10 minut, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Zneutralizować trypsynę roztworem neutralizującym trypsynę (1 ml/studzienkę).
  2. Przenieść zawiesinę jednokomórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 600 x g przez 10 minut.
  3. Odrzucić sklarowany osad i dodać 10 ml DMEM/F12 do komórek w probówce. Delikatnie odwróć, aby wymieszać komórki. Wirować przy 600 x g. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym FACS.
  4. Policz łączną liczbę komórek. Wirować przy 600 x g przez 10 min. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Natychmiast utrwal komórki, dodając 0,5 ml 4% paraformaldehydu. Dobrze wymieszaj, delikatnie wirując. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  5. Wirować przy 600 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Delikatnie wiruj, aby rozbić osad komórkowy. Przepuszczalność komórek przez dodanie 1 ml schłodzonego roztworu przepuszczalnego. Delikatnie mieszaj i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
  6. Wirować przy 600 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Dodać 3 ml buforu barwiącego FACS i ponownie zawiesić. Powtórz ten krok jeszcze raz. Zawiesić komórki w buforze barwiącym FACS w końcowym stężeniu 5 x 106 komórek/ml.
  7. Przenieś 100 μl zawiesiny komórek (0,5 x 106 komórek) do każdej probówki do mikrofuge i dodaj zalecaną objętość przeciwciała pierwszorzędowego. W przypadku Pax6 dodaj 5 μl PE anty-Pax6 do 100 μl zawiesiny komórek. W przypadku MITF dodać 5 μl anty-MITF do 100 μl zawiesiny komórek.
  8. Wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Dodać 3 ml buforu barwiącego FACS. Mieszać i odwirowywać w sile 600 x g przez 10 min. Usunąć supernatant i powtórzyć czynności opisane w 8.16 jeszcze dwa razy.
  9. W przypadku barwienia MITF inkubować komórki w przeciwciałie drugorzędowym, kozie anty-mysim Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu 1:2,000 przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. W przypadku barwienia Pax6 unikaj tego kroku.
  10. Przemyć komórki 5 ml buforu barwiącego FACS i odwirować przy 600 x g przez 10 minut. Powtórzyć proces jeszcze dwa razy.
  11. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu barwiącego FACS i delikatnie odwirować, aby rozbić osad komórkowy. Próbki są gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej.

9. Izolacja i kultura iPS-RPE

  1. W 29 dniu ostrożnie przeciąć wybrane pigmentowane kolonie z płytki hodowlanej za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl. Przenieść pływające kolonie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować kolonie przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.
  2. Zawiesić kolonie komórkowe w 10 ml DMEM/F12 i odwirować przy 600 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant.
  3. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, inkubując kolonie z 2 ml 0,25% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 7-10 minut. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową, aby oddzielić kolonie.
  4. Zneutralizować trypsynę, dodając 2 ml pożywki iPS-RPE. Wirować przy 600 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant. Zawiesić pojedyncze komórki w 2 ml pożywki iPS-RPE. Przenieść komórki na 6-dołkową płytkę pokrytą matrycą białkową i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym eksperymencie hodowano komórki iPS i różnicowano je w kierunku linii RPE z ciał embrioidalnych (EB). EB o kontrolowanych rozmiarach formowano przy użyciu płytek z mikrowypustkami. Jak pokazano na Rysunku 1, tworzenie EB w płytkach z mikrowypustkami było homogeniczne. Następnie EB te zebrano i wysiano na płytki 6-dołkowe (Rysunek 2).

Komórki RPE można zidentyfikować po ich klasycznej sześciokątnej morfologii, pigmentacji oraz ekspresji markerów RPE. Po 12...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby w pełni wykorzystać potencjał pluripotencjalnych komórek macierzystych w terapii komórkowej, konieczne jest regulowanie ich różnicowania w sposób konsekwentny i powtarzalny. W niniejszym raporcie opisano protokoły tworzenia EB o kontrolowanej wielkości przy użyciu technologii płytek mikrodołkowych, inicjowania różnicowania w kierunku RPE oraz identyfikacji markerów białkowych i genowych RPE. Aby zsynchronizować różnicowanie in vitro , jednorodne rozmiary EB utworzono za pomocą znanej liczby komórek iPS odwir...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Opinie lub twierdzenia zawarte tutaj są prywatnymi poglądami autorów i nie mogą być interpretowane jako oficjalne lub odzwierciedlające poglądy Departamentu Armii lub Departamentu Obrony. Badania te zostały przeprowadzone w czasie, gdy autorzy Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene i Jae-Hyek Choi odbyli staż podoktorski w USAISR. Prace te były wspierane przez U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) oraz Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka mTeSR1 + 5x suplementStem Cell Technologies5850
Y-27632 (Rock Inhibitor)Stem Cell Technologies72304
DMEM/F12Life Technologies11330-032
2-merkaptoetanolSigmaM-7154
Aminokwasy endogenneHyklon (Fisher)SH30853.01
Zamiennik surowicy nokautującejLife Technologies10828-028
Gentamycyna Life Technologies15750-060
L-glutaminaLife Technologies25030-081
MEM mediaLife Technologies10370-021
Suplement N1SigmaN-6530-5ML
TaurynaSigmaT-8691-25G
HydrokortyzonSigmaH0888-1G
Bydło płodowe surowicaHyclon (Fisher)SH3008803HI
Trijodo-L-tyronina sodowa   sólSigmaT6397
Wodorotlenek soduSigmaS5881
DispaseLife Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemHyklon (Fisher)10010-023
Płytka Aggrewell 400Stem Cell Technologies27940
AggreWell mediumStem Cell Technologies5893
AccutaseStem Cell Technologies7920
BD Cytofix/Cytoperm Zestaw do utrwalania/przepuszczalnościBD Biosciences554714
Mysie przeciwciało anty-PAX6Badania rozwojowe Hybridoma Bank
Rabbit Przeciwciało anty-RXAbcamAb23340
Mysz  Przeciwciało anty-MITFThermo ScientificMS-772-P
Królik Przeciwciało anty-ZO-1Invitrogen40-2200
RNeasy plus mini zestawQiagen74134
PCR master mixPromegaM7502
Zestaw RNA do cDNA o dużej pojemności LifeTechnologies4387406

Bibliografia

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  2. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  6. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
  7. Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
  8. Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
  9. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  10. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427(2012).
  11. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  12. Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
  13. Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152(2009).
  15. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
  16. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  17. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
  18. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
  19. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  20. Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
  21. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  22. Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. , Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
  23. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzysteformowanie ciałek embrionoidalnychtechnologia płytek z mikrowypustkamikierowana dyferencjacjaimmunocytochemiaanaliza RT-PCRsortowanie komórek aktywowane fluorescencjąekspresja markerów RPEinkubacja kultur komórkowych
Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.