Artykuł metodologiczny

Światło bliskiej podczerwieni (NIr) zwiększa ekspresję markera funkcji mitochondriów w przedsionkowym nabłonku czuciowym myszy

DOI:

10.3791/52265

⸱

14 marca 2015

 ,  ,  , 
1Discipline of Physiology, University of Sydney, 2Discipline of Biomedical Science, University of Sydney

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysfunkcja mitochondriów jest cechą charakterystyczną starzenia się komórek. W tym artykule zastosowano nieinwazyjne leczenie w bliskiej podczerwieni (NIr) w celu poprawy funkcji mitochondriów w starzejącym się nabłonku czuciowym przedsionkowym myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategie łagodzenia spadku funkcji równowagi wraz z wiekiem koncentrują się głównie na fizjoterapiach, w tym zadaniach równowagi i ćwiczeniach. Podejścia te nie odnoszą się jednak do podstawowych przyczyn spadku równowagi. Na myszach oceniono wpływ światła bliskiej podczerwieni (NIr) na metabolizm komórek w przedsionkowym nabłonku czuciowym. Zebrane dane pokazują, że ta prosta i bezpieczna interwencja może chronić te wrażliwe komórki przed szkodliwymi skutkami naturalnego starzenia się. mRNA wyekstrahowano z izolowanego obwodowego przedsionkowego nabłonka czuciowego (crista ampullaris i plamka łagiewkowa), a następnie transkrybowano do biblioteki cDNA. Biblioteka ta została następnie zbadana pod kątem ekspresji wszechobecnego przeciwutleniacza (SOD-1). Ekspresja genów przeciwutleniających została następnie wykorzystana do ilościowego określenia metabolizmu komórkowego. Stosując przezczaszkowe dostarczanie NIr u młodych (4 tygodnie) i starszych (8-9 miesięcy) myszy oraz krótki schemat leczenia (90 sekund / dzień przez 5 dni), praca ta sugeruje, że sam NIr może być wystarczający do poprawy funkcji mitochondriów w przedsionkowym nabłonku czuciowym. Ponieważ obecnie nie ma dostępnych, niedrogich, nieinwazyjnych metod terapii poprawiających funkcję przedsionkowych komórek rzęsatych, zastosowanie zewnętrznego promieniowania NIr stanowi potencjalną strategię przeciwdziałania wpływowi starzenia się na metabolizm komórkowy w przedsionkowym nabłonku czuciowym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pogarszająca się wydajność równowagi i następujące po niej upadki są powszechne i niestety często definiują cechy naturalnego starzeniasię 1. Wpływ tego spadku może być zarówno fizyczny, jak i społeczny i znacznie obniża jakość życia osób starszych. W związku z tym fizjoterapie i rehabilitacja były przedmiotem badań nad upadkami, ale nie wiązały się ze stałym zmniejszaniem częstości występowania powtarzających się upadków. Jednocześnie prace badające zmiany w obwodowym lub centralnym układzie przedsionkowym (systemie odpowiedzialnym za utrzymanie równowagi) są rzadkie, a potencjalne strategie terapeutyczne ukierunkowane na te układy i podstawowe przyczyny zaburzeń równowagi są ograniczone.

Ostatnie prace nad związanymi z wiekiem zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, w tym zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem2-4, modelami choroby Alzheimera5-8 i chorobą Parkinsona9-12, wykazały neuroprotekcyjne efekty prostego, nieinwazyjnego stosowania światła bliskiej podczerwieni (NIr). Ponadto w układzie przedsionkowym NIr zastosowano w celu zwiększenia aktywności pierwotnych neuronów doprowadzających przedsionkowych in vitro13. Chociaż mechanizm działania światła NIr nie jest dobrze poznany, większość badań z użyciem NIr sugeruje, że NIr stymuluje kompleks mitochondriów IV (oksydaza cytochromu c)14-17 w celu ułatwienia metabolizmu komórkowego. W przedsionkowym nabłonku czuciowym podskórna płytka komórek rzęsatych typu I jest gęsta w mitochondriach18 i jako taka może stanowić miejsce działania terapeutycznego leczenia NIr.

Tutaj opisany jest krótki, nieinwazyjny schemat leczenia przezczaszkowo stosowanego NIr, który może być użyty do pomiaru metabolizmu komórkowego (a co za tym idzie, funkcji mitochondriów) w przedsionkowym nabłonku czuciowym myszy. Omówiono również preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego i wykazano, że NIr zwiększa ekspresję wszechobecnego przeciwutleniacza (dysmutazy ponadtlenkowej 1) w nabłonku czuciowym – wcześniej wykazano, że jest to ważne dla przeżycia komórek rzęsatych ślimaka19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Sydney.

1. Zwierzęta

UWAGA: 1 i 8 - 9 miesięczne myszy (C57/BL6) zostały pozyskane z Centrum Zasobów Zwierzęcych (Perth, Australia). Myszy umieszczono w Bosch Rodent Facility na Uniwersytecie w Sydney.

  1. Myszy trzymane w standardowych klatkach dla myszy w 12/12-godzinnym cyklu światło/ciemność z dostępem do jedzenia i wody ad libitum.
  2. Dla porównania podziel myszy w każdej grupie wiekowej na grupy leczone bliską podczerwienią (NIr) lub pozorowane (kontrolne).

2. Naświetlanie bliską podczerwienią (NIr) i leczenie pozorowane

  1. Ogol sierść na głowie i szyi myszy elektryczną maszynką do golenia tak dokładnie, jak to możliwe, aby zapobiec szybkiemu odrastaniu włosów przed zakończeniem kuracji. Aby utrzymać status myszy wolnych od patogenów, należy używać 70% etanolu do czyszczenia narzędzi między golącymi się zwierzętami i weterynaryjnego środka dezynfekującego F10 między zwierzętami z oddzielnych klatek. Należy to zrobić 2-3 dni przed rozpoczęciem leczenia, aby nie dopuścić do nadmiernego obchodzenia się ze zwierzętami.
  2. Powstrzymaj mysz, przytrzymując proksymalny koniec ogona i pozwól mu się zrelaksować w dłoni jednej ręki lub blacie stołu, aby zminimalizować stres, który może prowadzić do fałszywych wyników.
  3. Trzymaj urządzenie NIr (670 nm) LED (dioda elektroluminescencyjna) w odległości 1 - 2 cm od odsłoniętego (ogolonego) obszaru i włącz urządzenie na 90 sekund (Rysunek 1A).
    UWAGA: Zmianę temperatury w wyniku 90-sekundowej ekspozycji zmierzono jako <0,2 °C w 100 ml wody.
  4. Powtórzyć kroki 2.2–2.3 dla grupy zwierząt poddanej działaniu substancji pozorowanej, ale pozostawić urządzenie wyłączone (Rysunek 1B).
  5. Powtórzyć kroki 2.2 - 2.3 dla grupy zwierząt, w której zastosowano NIr, ale przykryć wyrób folią aluminiową.
  6. Powtarzaj kroki 2,2 - 2,5 codziennie w odstępach około 24 godzin przez 5 kolejnych dni.
  7. Pobrać przedsionkowy nabłonek czuciowy (3 grzebieniowe i 1 plamka łagiewkowa) z obu uszu w piątym dniu po leczeniu (patrz punkt 3 poniżej).

3. Ekstrakcja tkanek20

  1. Przygotować 300 ml sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego na bazie glicerolu (ACSF) składającego się z (w mM): 26 NaHCO3, 11 glukozy, 250 glicerolu, 2,5 KCl, 1,2 NaH2PO4, 1,2 MgCl2 i 2,5 CaCl2. Przed dodaniem CaCl2 należy zagazować roztwór karbogenem (95%O2 i 5% CO2 ), aby uzyskać pH 7,4 i uniknąć wytrącania się wapnia (zmętnienia). Schłodzić roztwór w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez 45 minut, aby powstała zawiesina lodu.
  2. Przygotuj bufor do lizy izolacji RNA w oznakowanych mikroprobówkach z zakręcaną górką (zatrzymuje pękanie pokrywek, gdy ciśnienie w probówce zmienia się między zamrażaniem a rozmrażaniem w ciekłym azocie) zgodnie z instrukcjami producenta lub zwykłymi praktykami laboratoryjnymi. Mieć gotowy ciekły azot w aluminiowej kolbie Dewara.
    UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy używać odzieży ochronnej i okularów. Upewnij się, że ciekły azot jest używany w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, ponieważ objętość jego postaci gazowej jest około 700 razy większa niż w postaci ciekłej i może spowodować uduszenie.
  3. Głęboko znieczulij myszy ketaminą (400 mg/kg) za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego. Pozwól, aby odruch kończyn tylnych całkowicie ustąpił, co oznacza, że myszy są w pełni znieczulone.
  4. Odetnij głowę myszy ostrymi nożyczkami ze stali nierdzewnej i wykonaj nacięcie wzdłuż strzałkowej skóry czaszki za pomocą żyletki (zaokrąglone #22). W tym momencie i podczas kroków 3.5 - 3.9 utrzymuj sklepienie czaszki, mózg i leżący pod nim aparat przedsionkowy tak chłodny, jak to możliwe, poprzez regularne nakładanie lodowatego ACSF na tkankę.
  5. Używając spiczastego ramienia nożyczek o standardowym wzorze, wykonaj małe nacięcie w czaszce w Lambda i przetnij wzdłuż szwu strzałkowego.
  6. Delikatnie wsuń jedno ramię płytkiego rongeurs pod kość ciemieniową, trzymając ostrze jak najbliżej dolnej powierzchni kości, nie ciągnąc mózgu. Zabezpiecz i odciągnij kość ciemieniową bocznie, a kość potyliczną z tyłu, aż mózg zostanie odsłonięty.
  7. Użyj małej szpatułki ze stali nierdzewnej i unieś mózg z dala od przedniego i środkowego dołu czaszki, aby odsłonić nerw przedsionkowo-ślimakowy (CN VIII). Przeciąć nerw, aby zapobiec niepotrzebnemu napięciu na pierwotne aksony doprowadzające, które bezpośrednio unerwiają przedsionkowe komórki rzęsate.
  8. Usunąć mózg in toto po przecięciu CN VIII.
  9. Obserwuj błędnik kostny zawierający ślimak i obwodowe narządy przedsionkowe w środkowym dole czaszki. Wykonaj dwa małe nacięcia obok każdego błędnika kostnego i wytnij całą strukturę, przytrzymując przedni kanał półkolisty i ciągnąc na boki.
  10. Natychmiast zanurzyć wycięte labirynty w naczyniu preparacyjnym zawierającym lodowaty roztwór ACSF (jak opisano w kroku 3.1), ciągle przetapiając karbogenem.
  11. Pod mikroskopem stereoskopowym przytrzymaj błędnik przy ślimaku i przymocuj go kleszczami do dna naczynia.
    1. Użyj prostych, cienkich kleszczy, aby podrapać mały otwór w kości nad bańką przedniego kanału półkolistego (SSC).
    2. Delikatnie powiększ ten otwór, sięgając bezpośrednio pod kość i przesuwając na zewnątrz od bańki. Zachowaj ostrożność, aby nie wepchnąć kleszczy do otworu i nie uszkodzić delikatnego błoniastego błędnika poniżej. Kontynuuj w ten sposób, aż łagiewka, przednia i boczna bańka zostaną odsłonięte. Jeśli to możliwe, usuń również tylną bańkę.
  12. Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie unieś łagiewkę i bańki z błędnika kostnego, aż zostaną całkowicie oderwane. Jeśli to możliwe, trzymaj je za powiązane kanały półkoliste, aby uniknąć uszkodzenia nabłonka czuciowego. W niektórych przypadkach może być konieczne przecięcie bliższej części półkolistego przewodu błoniastego nożyczkami do tęczówki, aby uwolnić bańki z kości.
  13. Chwyć bezpiecznie narządy przedsionkowe między końcówkami kleszczy i umieść w buforze do lizy przygotowanym wcześniej w kroku 3.2. Delikatnie obracaj kleszcze w buforze, aby upewnić się, że narządy przedsionkowe odłączyły się od kleszczy. Sprawdź, czy tak jest, umieszczając kleszcze pod mikroskopem stereoskopowym.
    1. Przykręcić pokrywę mikrotubuli i natychmiast zamrozić próbkę w ciekłym azocie.

4. Ekstrakcja RNA i RT-PCR

  1. Postępuj zgodnie ze standardowymi metodami ekstrakcji informacyjnego RNA (mRNA) zgodnie z instrukcjami producenta lub preferowanymi protokołami laboratoryjnymi.
    UWAGA: W tym protokole zastosowano komercyjny zestaw, który wykorzystywał nośne RNA do izolowania małych wydajności mRNA. Mniejsze objętości elucji można wykorzystać do zwiększenia końcowych stężeń mRNA.
    UWAGA: Ujemne kontrole "bez enzymu" (NEC) i kontrole "bez matrycy DNA" (NTC) również muszą zostać zakończone, aby zapewnić ważność zaobserwowanych efektów.
  2. Zastosuj standardowe metody odwrotnej transkrypcji mRNA do komplementarnego DNA (cDNA) i amplifikacji docelowych genów21-23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby porównać wpływ leczenia NIr u młodych (4 tygodnie) i starszych (8 - 9 miesięcy) myszy, zmierzyliśmy ekspresję antyoksydacyjnej dysmutazy ponadtlenkowej 1 (SOD-1) u młodych (n = 16) i starszych (n = 20) myszy, które były leczone NIr, pozorowane lub blokowane NIr. Rycina 2 pokazuje znaczący wzrost znormalizowanej ekspresji SOD-1 β-aktyny ponad 2-krotnie u młodych zwierząt leczonych NIr w porównaniu z młodymi zwierzętami leczonymi pozorowo (p < 0,01) i młodymi zwierzętami z blokadą NIr (p < 0,01)....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki opisane tutaj pokazują, że krótkie przezczaszkowe dostarczanie światła NIr (90 sekund / dzień przez 5 dni) jest wystarczające do podniesienia poziomu ekspresji przeciwutleniaczy u starszych myszy w porównaniu z myszami leczonymi pozorami. Podczas gdy emitowane ciepło może stanowić źródło aktywacji mitochondriów i/lub neuronów, jak podano w przypadku aferentów przedsionkowych szczurów24 – nasz pomiar ciepła emitowanego przez urządzenie NIr LED wynosił <0,2°C w ciągu 90 sekund i jako taki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Dr. Paulowi Wittingowi i Pani Genevieve Fong za pomoc w ekstrakcji mRNA i PCR, a także Garnett Passe and Rodney Williams Memorial Foundation za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Quantum WARP 10Urządzenia kwantowe2070N030-A
Mikrotubule śruboweJakość Scientific Plastics520-GRD-Q
KetaminaParnell, Aleksandria Australia
Nożyczki standardoweFST14001-12
Ostrza chirurgiczne ze stali węglowej #22LivingstoneSBLDCL 22
Friedman-Pearson rongeursFST16221-14
Mikroskop stereoskopowyLeica MicrosystemsA60S
Dumont #5 Kleszcze SFFST11252-00
Zestaw mikro izolatu RNA IIBiolineBIO-52075

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agrawal, Y., Carey, J. P., Della Santina,, C, C., Schubert, M. C., Minor, L. B. Disorders of balance and vestibular function in US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 2001-2004. Archives of internal medicine. 169, 938-944 (2009).
  2. Bessho, K., et al. Effect of subthreshold infrared laser treatment for drusen regression on macular autofluorescence in patients with age-related macular degeneration. Retina. 25, 981-988 (2005).
  3. Olk, R. J., et al. Therapeutic benefits of infrared (810-nm) diode laser macular grid photocoagulation in prophylactic treatment of nonexudative age-related macular degeneration: two-year results of a randomized pilot study. Ophthalmology. 106, 2082-2090 (1999).
  4. Rodanant, N., et al. Predictors of drusen reduction after subthreshold infrared (810 nm) diode laser macular grid photocoagulation for nonexudative age-related macular degeneration. American journal of ophthalmology. 134, 577-585 (2002).
  5. De Taboada, L., et al. Transcranial laser therapy attenuates amyloid-beta peptide neuropathology in amyloid-beta protein precursor transgenic mice. Journal of Alzheimer's disease : JAD. 23, 521-535 (2011).
  6. Grillo, S. L., Duggett, N. A., Ennaceur, A., Chazot, P. L. Non-invasive infra-red therapy (1072 nm) reduces beta-amyloid protein levels in the brain of an Alzheimer's disease mouse model. TASTPM. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 123, 13-22 (2013).
  7. Purushothuman, S., Johnstone, D. M., Nandasena, C., Mitrofanis, J., Stone, J. Photobiomodulation with near infrared light mitigates Alzheimer's disease-related pathology in cerebral cortex - evidence from two transgenic mouse models. Alzheimer's researc., & therapy. 6, 2(2014).
  8. Sommer, A. P., et al. 670 nm laser light and EGCG complementarily reduce amyloid-beta aggregates in human neuroblastoma cells: basis for treatment of Alzheimer's disease. Photomedicine and laser surgery. 30, 54-60 (2012).
  9. Moro, C., et al. Photobiomodulation preserves behaviour and midbrain dopaminergic cells from MPTP toxicity: evidence from two mouse strains. BMC neuroscience. 14, 40(2013).
  10. Peoples, C., et al. Photobiomodulation enhances nigral dopaminergic cell survival in a chronic MPTP mouse model of Parkinson's disease. Parkinsonis., & related. 18, 469-476 (2012).
  11. Shaw, V. E., et al. Neuroprotection of midbrain dopaminergic cells in MPTP-treated mice after near-infrared light treatment. The Journal of comparative neurology. 518, 25-40 (2010).
  12. Ying, R., Liang, H. L., Whelan, H. T., Eells, J. T., Wong-Riley, M. T. Pretreatment with near-infrared light via light-emitting diode provides added benefit against rotenone- and MPP+-induced neurotoxicity. Brain research. 1243, 167-173 (2008).
  13. Rajguru, S. M., et al. Infrared photostimulation of the crista ampullaris. The Journal of physiology. 589, 1283-1294 (2011).
  14. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
  15. Desmet, K. D., et al. Clinical and experimental applications of NIR-LED photobiomodulation. Photomedicine and laser surgery. 24, 121-128 (2006).
  16. Huang, Y. Y., Chen, A. C., Carroll, J. D., Hamblin, M. R. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose-response : a publication of International Hormesis Society. 7, 358-383 (2009).
  17. Rojas, J. C., Gonzalez-Lima, F. Low-level light therapy of the eye and brain. Eye and brain. 3, 49-67 (2011).
  18. Vranceanu, F., et al. Striated organelle, a cytoskeletal structure positioned to modulate hair-cell transduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4473-4478 (2012).
  19. Johnson, K. R., et al. Separate and combined effects of Sod1 and Cdh23 mutations on age-related hearing loss and cochlear pathology in C57BL/6J mice. Hearing research. 268, 85-92 (2010).
  20. Tung, V. W., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50471(2013).
  21. Kirby, J., Menzies, F. M., Cookson, M. R., Bushby, K., Shaw, P. J. Differential gene expression in a cell culture model of SOD1-related familial motor neurone disease. Human molecular genetics. 11, 2061-2075 (2002).
  22. Parry, S. N., Ellis, N., Li, Z., Maitz, P., Witting, P. K. Myoglobin induces oxidative stress and decreases endocytosis and monolayer permissiveness in cultured kidney epithelial cells without affecting viability. Kidney and Blood Pressure Research. 31, 16-28 (2008).
  23. Saee-Rad, S., et al. Analysis of superoxide dismutase 1, dual-specificity phosphatase 1, and transforming growth factor, beta 1 genes expression in keratoconic and non-keratoconic corneas. Molecular vision. 19, 2501-2507 (2013).
  24. Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  25. Moro, C., et al. Photobiomodulation inside the brain: a novel method of applying near-infrared light intracranially and its impact on dopaminergic cell survival in MPTP-treated mice. Journal of neuroscience. 120, 670-683 (2014).
  26. Moreno, L. E., et al. Infrared neural stimulation: beam path in the guinea pig cochlea. Hearing research. 282, 289-302 (2011).
  27. Curthoys, I. S. A red thread as a guide in the vestibular labyrinth. The Journal of physiology. 589, 1241-1241 (2011).
  28. Chakrabarti, S., et al. Mitochondrial Dysfunction during Brain Aging: Role of Oxidative Stress and Modulation by Antioxidant Supplementation. Aging and disease. 2, 242-256 (2011).
  29. Petrosillo, G., De Benedictis, V., Ruggiero, F. M., Paradies, G. Decline in cytochrome c oxidase activity in rat-brain mitochondria with aging. Role of peroxidized cardiolipin and beneficial effect of melatonin. Journal of bioenergetics and biomembranes. 45, 431-440 (2013).
  30. Zhu, H., Sun, A., Zou, Y., Ge, J. Inducible metabolic adaptation promotes mesenchymal stem cell therapy for ischemia: a hypoxia-induced and glycogen-based energy prestorage strategy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34, 870-876 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Near Infrared LightSOD 1 ExpressionTranscranial ApplicationMouse Vestibular SystemAntioxidant Gene AnalysisDensitometry MeasurementTissue Dissection ProtocolCerebral Spinal Fluid

Powiązane artykuły