Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Immunohistochemia jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania obecności, lokalizacji i względnej obfitości antygenów in situ. Ten protokół na poziomie wprowadzającym opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do zakończenia immunohistochemicznego barwienia tkanki mózgowej gryzonia, na przykładzie markerów mikrogleju i elementów neuronalnych. W szczególności artykuł ten jest protokołem krok po kroku do fluorescencyjnej wizualizacji mikrogleju i neuronów za pomocą immunohistochemii odpowiednio dla Iba1 i Pan-neuronal. Podwójne znakowanie fluorescencyjne jest szczególnie przydatne do lokalizacji wielu białek w tej samej próbce, dając możliwość dokładnej obserwacji interakcji między typami komórek, receptorami, ligandami i/lub macierzą zewnątrzkomórkową w stosunku do siebie, a także kolokalizacji białek w pojedynczej komórce. W przeciwieństwie do innych technik wizualizacji, intensywność barwienia immunohistochemicznego fluorescencji może zmniejszyć się w ciągu kilku tygodni lub miesięcy po barwieniu, chyba że zostaną podjęte odpowiednie środki ostrożności. Pomimo tego ograniczenia, w wielu zastosowaniach podwójne znakowanie fluorescencyjne jest preferowane w stosunku do alternatyw, takich jak czterochlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) lub fosfataza alkaliczna (AP), ponieważ fluorescencja jest bardziej efektywna w czasie i pozwala na bardziej precyzyjne rozróżnienie między dwoma lub więcej markerami. Dyskusja zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i porady, które pomogą Ci osiągnąć sukces.
Wprowadzenie
Immunohistochemia jest procesem wykrywania antygenów (t.j. białek) w skrawkach tkanek przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych, które wiążą się specyficznie z badanymi antygenami. Immunohistochemia została zapoczątkowana przez J.R. Marracka w 1934 roku, kiedy stwierdził on, że przeciwciała mogą lokalizować antygeny z dużą specyficznością1. Począwszy od 1942 roku, opublikowano niektóre z pierwszych badań in vitro z wykorzystaniem przeciwciał fluorescencyjnych do wizualizacji immunohistochemicznej2,3, po których opublikowano pierwsze badanie histochemiczne in vivo4. W latach 60. XX wieku, trzy dekady po wprow....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Arizony. Listę zalecanych materiałów i sprzętu znajduje się w Tabeli 1.
1. Przygotowanie tkanki
- Perfuzja
- Uśmierć gryzonia poprzez przedawkowanie pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, IP), a następnie przeprowadź perfuzję transkardialną roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) aż do całkowitego upuszczenia krwi (3-5 min) przy szybkości przepływu 8 ml/min. Szczegółowe instrukcje dotyczące perfuzji znajdują się w publikacji Gage et al 2012<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół barwienia pozwala na uzyskanie przekrojów tkanki mózgu szczura, w których mikroglej jest znakowany fluorescencyjnie w kanale 594 (czerwony), a neurony w kanale 488 (zielony; patrz Rycina 4). W przypadku zastosowania barwienia jąder komórkowych, będzie ono widoczne w kanale 405 (niebieski). Obrazy można rejestrować w różnych kanałach, a następnie nakładać je na siebie w celu bezpośredniego porównania trzech kanałów lub dowolnych dwóch z nich. Wiele pakietów oprogramowania do akwizycji c.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ogólnym celem niniejszej publikacji było zapoznanie czytelnika z procedurami immunohistochemicznymi. W tym celu wykorzystano przykład podwójnego znakowania antygenami Iba1 oraz pan-neuronalnymi w celu obserwacji mikrogleju i neuronów w preparatach mózgu szczura, które zostały perfundowane paraformaldehydem, krioprotektowane sacharozą i poddane kriosekcjonowaniu.
Technikę tę można dostosować do wielu różnych celów. Dzięki niewielkim modyfikacjom protokołu można w sposób immunohistochemiczny zwi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Panom Ryanowi Hartowi i Panu Arrizowi Lucasowi za ich nieocenione opinie na temat tej komunikacji. Praca ta była wspierana przez NIH NINDS R01 NS065052 i Phoenix Children's Hospital Mission Support Funds.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkiełka szklane Fisherbrand Superfrost Plus | Fisher Scientific | 22-034-979 | Używany do montażu tkanek (1.2.2) |
| Piekarnik | Thermo Scientific | 51028112 | Używany do suszenia tkanek (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Używany w kroku 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Naczynie do barwienia szkiełek | Fisher Scientific | 22-149-429 | Używany do wszystkich prań podczas barwienia (2.2), a także do kroku Hoechst (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Służy do suszenia szkiełek (2.2) |
| Czarne pudełko do barwienia | Ted Pella | 21050 | Służy do blokowania i barwienia etapów (2.2) |
| Normalna surowica osła | Fisher Scientific | 50-413-253 | Służy do inkubacji blokowej i przeciwciał (2.2) |
| Mysz &alfa;-pan-neuronalna | milipora | MAB2300 | Używany do przeciwciał pierwszorzędowych (2.2.4) |
| Królik α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe (2.2.4) |
| Osioł &alfa;-królik 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Używany do przeciwciał drugorzędowych (2.2.6) |
| Osioł &alfa;-mysz 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Używany jako przeciwciało drugorzędowe (2.2.6) |
| Folia cateringowa | Dowolna | Nie dotyczy | Używany w krokach 1.2.2 i 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Używany do szkiełek nakrywkowych (2.2.8) |
| Szkiełka nakrywkowe | Fisher Scientific | 12544E | Używany do szkiełek nakrywkowych (2.2.8) |
| Bezbarwny lakier do paznokci | Dowolna | Nie dotyczy | Używany do szkiełek nakrywkowych (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 i LSM 710 (skaning laserowy, konfokalny) | Carl Zeiss | Nie dotyczy | Używany do obrazowania (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Używany do obrazowania (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | Dla protokołu DAB | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | Dla protokołu DAB |
| Zestaw peroksydazy DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | Dla protokołu DAB |
| Biotynylowane konie i alfa;-królik IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | Dla protokołu DAB |
| laboratoria wektorowe | konia i alfa-myszy IgG | BA-2001 | Dla protokołu DAB |
| 30% nadtlenek wodoru | FisherScientific | H325-500 | Dla protokołu DAB |
| Stojaki na suwaki Wheaton i naczynia do barwienia | TedPella | 21043 | Do protokołu DAB |
| Pompa perfuzyjna Masterflex i rurka | Cole-Parmer | Używany do perfuzji (1.1.1 i 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT związek (przypadek 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Używany do zamrażania tkanek (1.2.1) |
| Termometr (-50 do 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Używany do zamrażania tkanek (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Używany do cięcia tkanek (1.2.2) |
| Naczynie do barwienia, plastikowe z 2 pokrywkami | Grale Scientific | 353 | Do rerivaly antygenu |
| 20-miejscowy stojak do barwienia, prowadnice poziome | Grale Scientific | 354 | Do rerivaly antygenu |
| Kuchenka mikrofalowa | Dowolna | Nie dotyczy | Do rerivaly antygenu |
Bibliografia
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marsha....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
