Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Podsumowanie

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Streszczenie

Immunohistochemia jest powszechnie stosowaną techniką wykrywania obecności, lokalizacji i względnej obfitości antygenów in situ. Ten protokół na poziomie wprowadzającym opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do zakończenia immunohistochemicznego barwienia tkanki mózgowej gryzonia, na przykładzie markerów mikrogleju i elementów neuronalnych. W szczególności artykuł ten jest protokołem krok po kroku do fluorescencyjnej wizualizacji mikrogleju i neuronów za pomocą immunohistochemii odpowiednio dla Iba1 i Pan-neuronal. Podwójne znakowanie fluorescencyjne jest szczególnie przydatne do lokalizacji wielu białek w tej samej próbce, dając możliwość dokładnej obserwacji interakcji między typami komórek, receptorami, ligandami i/lub macierzą zewnątrzkomórkową w stosunku do siebie, a także kolokalizacji białek w pojedynczej komórce. W przeciwieństwie do innych technik wizualizacji, intensywność barwienia immunohistochemicznego fluorescencji może zmniejszyć się w ciągu kilku tygodni lub miesięcy po barwieniu, chyba że zostaną podjęte odpowiednie środki ostrożności. Pomimo tego ograniczenia, w wielu zastosowaniach podwójne znakowanie fluorescencyjne jest preferowane w stosunku do alternatyw, takich jak czterochlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) lub fosfataza alkaliczna (AP), ponieważ fluorescencja jest bardziej efektywna w czasie i pozwala na bardziej precyzyjne rozróżnienie między dwoma lub więcej markerami. Dyskusja zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów i porady, które pomogą Ci osiągnąć sukces.

Wprowadzenie

Immunohistochemia jest procesem wykrywania antygenów (t.j. białek) w skrawkach tkanek przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych, które wiążą się specyficznie z badanymi antygenami. Immunohistochemia została zapoczątkowana przez J.R. Marracka w 1934 roku, kiedy stwierdził on, że przeciwciała mogą lokalizować antygeny z dużą specyficznością¹. Począwszy od 1942 roku, opublikowano niektóre z pierwszych badań in vitro z wykorzystaniem przeciwciał fluorescencyjnych do wizualizacji immunohistochemicznej^2,3, po których opublikowano pierwsze badanie histochemiczne in vivo⁴. W latach 60. XX wieku, trzy dekady po wprowadzeniu metod immunohistochemicznych, przeciwciała sprzężone z enzymami zaczęto stosować jako odczynniki wtórne. Metody te zostały opracowane jednocześnie i niezależnie we Francji i w USA^5,6. Obecnie szeroki wachlarz przeciwciał zapewnia nieograniczone możliwości prowadzenia badań immunohistochemicznych⁷.

Ogólnym celem niniejszej korespondencji jest przedstawienie krótkiego wprowadzenia do barwienia immunohistochemicznego; nie ma ona na celu bycia kompleksowym i wyczerpującym przeglądem tej techniki. W opisanym protokole zaprezentowano techniki immunohistochemiczne dla dwóch antygenów (markerów mikrogleju i neuronów) do barwienia preparatów mózgu szczura, które zostały poddane perfuzji paraformaldehydem, krioprotekcji sacharozą i kriosekcjonowaniu. Barwienie immunohistochemiczne rozpoczyna się od blokowania nieswoistego wiązania antygenów w celu zmniejszenia tła. Następnie inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym umożliwia wiązanie ze specyficznym antygenem w tkance. Po zastosowaniu przeciwciała pierwszorzędowego podaje się kolejne przeciwciało, zwane przeciwciałem drugorzędowym, aby połączyć przeciwciało pierwszorzędowe z koniugowanym sygnałem wizualizacji⁸. Przeciwciało drugorzędowe jest skierowane przeciwko domenie immunoglobulin G (IgG) specyficznej dla gatunku, w którym wytworzono przeciwciało pierwszorzędowe. Przeciwciało drugorzędowe wzmacnia sygnał przeciwciała pierwszorzędowego, ponieważ regiony Fab przeciwciała drugorzędowego wiążą się z wieloma miejscami w domenie IgG przeciwciała pierwszorzędowego. Wizualizację umożliwiają enzymy lub cząsteczki fluorescencyjne skoniugowane z regionami F_c przeciwciała drugorzędowego. Na przykład królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko Iba1 jest cząsteczką króliczego IgG specyficzną dla Iba1. Po zastosowaniu osiołkowego przeciwciała przeciwko króliczemu IgG jako przeciwciała drugorzędowego, rozpozna ono i zwiąże się z wieloma regionami króliczego IgG przeciwko Iba1 (patrz Rycina 1). Przeciwciało osiołkowe można wizualizować różnymi metodami. Niniejsza korespondencja koncentruje się na detekcji fluoroforu skoniugowanego z przeciwciałem drugorzędowym, które rozpoznaje przeciwciało pierwszorzędowe, w celu wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W immunohistochemii fluorescencyjnej do wizualizacji wszystkich jąder komórkowych można zastosować barwnik jądrowy, taki jak Hoechst lub DAPI.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie technik bezpośredniego i pośredniego znakowania przeciwciałami. Przeciwciała wiążą się z badanym antygenem i mogą być wzmocnione przez przeciwciała wtórne wytworzone przeciwko gatunkowi przeciwciał pierwszorzędowych. Technikę tę można przeprowadzić z wykorzystaniem kompleksu awidyna-biotyna (ABC) w celu amplifikacji i DAB do wizualizacji (A) lub bezpośrednio sprzężonego fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego (B). Alternatywnie, przeciwciała pierwszorzędowe mogą być bezpośrednio sprzężone z wieloma różnymi znacznikami, w tym z biotyną lub fluorophorem (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Alternatywną metodą wizualizacji barwienia immunohistochemicznego jest zastosowanie tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB; patrz Rysunki 1 i 2). Różni się ona od fluorescencji wykorzystaniem biotynilowanego przeciwciała wtórnego lub przeciwciała sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP), co dostarcza enzymu przekształcającego DAB w osad widoczny w mikroskopii w świetle przechodzącym. W przypadkach, gdy przedmiotem zainteresowania jest pojedynczy antygen lub wymagane jest trwałe barwienie, DAB może być bardziej odpowiedni niż barwienie fluorescencyjne. Jednak barwienie DAB nie nadaje się do różnicowania wielu markerów, zwłaszcza jeśli analizowane są dwa antygeny jądrowe. Informacje na temat materiałów do DAB i modyfikacji protokołu znajdują się w Tabeli 1. Alternatywnie, do wizualizacji przeciwciała wtórnego sprzężonego z fosfatazą alkaliczną (AP) można użyć chlorku nitro błękitu tetrazoliowego/5-bromo-4-chloro-3-indolylofosforanu (NBT/BCIP).

Rycina 2: Reprezentatywne obrazy pojedynczo znakowanych przekrojów tkanki mózgu szczura z zastosowaniem DAB wzmocnionego niklem. Przekroje mózgu szczura znakowane DAB wzmocnionym niklem dla Iba1 (A) oraz Pan-neuronal (B) umożliwiają długotrwałą analizę samych mikroglejów lub neuronów. Pasek skali 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Należy wziąć pod uwagę szacowaną obfitość badanego antygenu w analizowanej tkance. Metody pośrednie (opisane powyżej) są przydatne w przypadku celów o niskiej obfitości. Gdy badany antygen występuje w dużej ilości, można zastosować metody bezpośrednie. Metody bezpośrednie wykorzystują przeciwciało pierwszorzędowe, które jest bezpośrednio sprzężone z sygnałem wizualizacyjnym, dzięki czemu nie jest wymagane przeciwciało drugorzędowe. Metoda ta upraszcza proces barwienia, ale eliminuje wzmocnienie sygnału uzyskiwane w metodach pośrednich. Stosowanie bezpośrednio sprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego eliminuje również reakcje krzyżowe przeciwciał drugorzędowych podczas podwójnego znakowania.

Niniejszy komunikat szczegółowo opisuje protokół podwójnego znakowania z użyciem Iba1 oraz markera pan-neuronalnego (szczegóły w Tabeli 1). Iba1 barwi mikroglej w wielu stanach aktywacji, w tym rozgałęziony, nadmiernie rozgałęziony, aktywowany, ameboidalny i pręcikowy. Marker pan-neuronalny barwi aksony, dendryty i soma neuronów. Ponieważ Iba1 barwi większość komórek mikrogleju, a marker pan-neuronalny celuje w neurony, ta kombinacja barwień jest użyteczna w uzyskaniu szerokiego zrozumienia interakcji między mikroglejem a neuronami.

Podsumowując, barwienie immunohistochemiczne opiera się na starannym doborze przeciwciał. Wraz ze wzrostem specyfiki pytania badawczego może pojawić się potrzeba zastosowania przeciwciał skierowanych przeciwko innym antygenom. Aby skierować badanie na konkretny stan aktywacji mikrogleju, można zdecydować się na użycie przeciwciał CD45 lub CD68 zamiast Iba1. Ponadto w pracy z myszami pożądane wyniki może zapewnić marker F4/80. Podobnie, elementy neuronalne można specyficznie targetować za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko jądru, synapsie (pre- lub postsynaptycznej), aksonowi oraz stożkowi wzrostu. Dodatkowo istnieją inne markery pozwalające zróżnicować wiek neuronu (Double-cortin, NeuN) oraz regenerację neuronalną (GAP-43).

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Arizony. Listę zalecanych materiałów i sprzętu znajduje się w Tabeli 1.

1. Przygotowanie tkanki

1. Perfuzja
   1. Uśmierć gryzonia poprzez przedawkowanie pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, IP), a następnie przeprowadź perfuzję transkardialną roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) aż do całkowitego upuszczenia krwi (3-5 min) przy szybkości przepływu 8 ml/min. Szczegółowe instrukcje dotyczące perfuzji znajdują się w publikacji Gage et al 2012⁹.
   2. Bezpośrednio po płukaniu PBS utrwal tkankę, przeprowadzając perfuzję 4% paraformaldehydem w PBS przez 15-20 min przy szybkości przepływu 8 ml/min.
   3. Wyjmij mózg i umieść w 4% paraformaldehydzie na 24 hr, a następnie w roztworach sacharozy o rosnącym stężeniu (kolejno 15%, 30%, 30%; przygotowanych w buforze tris-saline) w temperaturze 4 °C. Przenieś mózg do kolejnego roztworu sacharozy dopiero wtedy, gdy mózg opadnie na dno w każdym z roztworów. Uwaga: Zazwyczaj 5 dni w każdym roztworze jest wystarczającym czasem, aby tkanka opadła na dno.
2. Zamrażanie tkanki i kriosekcjonowanie
   1. Umieść mózg w medium do zatapiania, takim jak związek O.C.T., i zanurz w izopentanie w temperaturze -35 °C. Pozostaw mózg do zamrożenia na minimum 10 min, a następnie przechowuj w -80 °C. Niedbałość w utrzymaniu temperatury może prowadzić do wystąpienia problemów; informacje dotyczące rozwiązywania problemów znajdują się w sekcji dyskusji.
   2. Wykonaj seryjne przekroje czołowe o grubości 20 µm w temperaturze -20 °C. Zbierz tkankę na szkiełka dodatnio naładowane. Przekroje mózgu można umieścić w kasetce na szkiełka owiniętej w folię, włożyć do woreczka strunowego i przechowywać długoterminowo w -80 °C. Ta metoda przechowywania tworzy podwójną barierę zapobiegającą dostępowi powietrza i powstawaniu szronu.

2. Obróbka tkanek

UWAGA: Przykładowy sprzęt i materiały niezbędne do barwienia przedstawiono na Rysunku 3. Dostępne są alternatywy, jednak obrazy te pomogą osobom rozpoczynającym pracę z barwieniem immunohistochemicznym w wizualizacji odpowiednich elementów przed ich zakupem.

Rycina 3: Przykładowe elementy wymagane do barwienia immunohistochemicznego. Czarna skrzynka pokazana na (A) stanowi idealną komorę wilgotnościową do immunofluorescencji, ponieważ preparaty są chronione przed światłem bez konieczności owijania skrzynki folią. Po wykonaniu skrawków preparaty mogą być przechowywane w skrzynce, takiej jak żółta skrzynka pokazana na (B). Szczelne owinięcie skrzynki folią i umieszczenie jej w woreczku strunowym przed włożeniem do zamrażarki pomaga chronić próbki tkanek przed wysuszeniem mrozowym. Przykład preparatów przedstawiono na (C), a różne kuwety do barwienia ukazano na (D) i (E). Szkiełka zakrywkowe mogą różnić się rozmiarem i grubością (F), jednak zakrywki o grubości 1.2 zapewniają dobre wyniki obrazowania w większości mikroskopów pionowych i konfokalnych. Ołówek, taki jak pokazany na (G), może być używany do opisywania preparatów. Należy unikać markerów permanentnych, ponieważ tusz może się rozmazać, co wpływa zarówno na barwienie, jak i na możliwość zidentyfikowania próbki. Mini pisak do cytologii (pap pen), taki jak pokazany na (H), umożliwia narysowanie na preparacie odpychającej obwódki.

1. Przygotowanie szkiełek
   1. Wyjąć szkiełka z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej.
      1. Opcjonalnie: Jeśli skrawki wcześniej oddzieliły się od szkiełek, umieścić rozmrożone szkiełka w piekarniku w temperaturze 60 °C na maksymalnie 4 h, aby zapobiec odklejaniu się skrawków tkanki.
   2. Umieścić szkiełka w statywie i odpowiadającej mu kuwecie.
   3. Przemyć szkiełka trzy razy w PBS po 5 min każde, wymieniając roztwór pomiędzy przemyciami. Od tego kroku należy unikać pozostawiania skrawków bez cieczy przez dłuższy czas. Uwaga: Jeśli skrawki wyschną, wzrośnie tło barwienia i nie będzie można uzyskać wiarygodnych danych.
2. Barwienie tkanki
   1. W szczelnej przed światłem kasecie do barwienia stworzyć „komorę wilgotnościową” z chusteczek beztkaninowych nasączonych wodą dejonizowaną.
   2. Osuszyć krawędzie szkiełka chusteczką beztkaninową, użyć mini pap pen do utworzenia hydrofobowej obwódki na samym brzegu szkiełka, z dala od skrawków tkanki. Obwódka ta powinna zapewnić odpowiednią przestrzeń między meniskiem cieczy a krawędzią tkanki, aby napięcie powierzchniowe nie wpływało na barwienie.
      UWAGA: Obwódkę z pap pen można nanieść przed krokiem 2.1.3, jeśli badane przeciwciała nie wymagają mikrofalowego odsłaniania antygenów. Jeśli pap pen został naniesiony przed przemywaniem w PBS, na tym etapie należy sprawdzić szczelność hydrofobowej obwódki. Użyć mini-pap pen, aby uzupełnić wszelkie luki w obwódce.
   3. Przy poziomo ułożonych szkiełkach zablokować nieswoiste wiązanie antygenów poprzez inkubację w 4% v/v serum w PBS (roztwór blokujący). Nanieść pipetą 300 µl roztworu blokującego na szkiełko i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej. Należy upewnić się, że roztwór blokujący sięga obwódki z pap pen na krawędzi szkiełka i całkowicie pokrywa tkankę, aby uniknąć nierównomiernego barwienia spowodowanego napięciem powierzchniowym w pobliżu tkanki.
      1. Użyć serum z tego samego gatunku, w którym wytworzono przeciwciało wtórne. Uwaga: W tej procedurze przeciwciała wtórne są wytworzone w ośle, dlatego stosuje się serum osła. Jeśli używa się przeciwciał wtórnych z dwóch lub więcej różnych gatunków, należy dołączyć serum z każdego z tych gatunków.
   4. Nanieść pipetą przeciwciało pierwotne na szkiełka. Uwaga: Stężenia przeciwciał dla tego barwienia zostały zoptymalizowane na poziomie odpowiednio 1:5 000 dla Iba1 i 1:500 dla Pan-neuronal. Stwierdzono, że stężenia te zapewniają wyraźne barwienie przy braku tła.
      1. Rozcieńczyć roztwór blokujący do 1% serum w PBS i dodać przeciwciała pierwotne. Nanieść pipetą 300 µl roztworu przeciwciała pierwotnego w 1% serum na szkiełko. Ponownie upewnić się, że ciecz sięga krawędzi obwódki z pap pen. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      2. Przygotować trzy szkiełka kontrolne: jedno bez przeciwciał Iba1 i Pan-neuronal, jedno z Iba1 bez przeciwciała Pan-neuronal oraz jedno z przeciwciałem Pan-neuronal bez Iba1. Barwić te szkiełka w tej samej serii, używając tych samych roztworów, jednak z pominięciem przeciwciał pierwotnych, aby przetestować nieswoiste wiązanie przeciwciał wtórnych.
   5. Następnego dnia przemyć szkiełka trzy razy w PBS po 5 min każde, wymieniając roztwór pomiędzy przemyciami.
   6. Przeciwciała fluorescencyjne są światłoczułe, dlatego od tego kroku należy minimalizować ekspozycję na światło, upewniając się, że pojemniki do przemywania są owinięte folią, a kasety do hybrydyzacji są czarne lub inkubowane w ciemności. Nanieść pipetą odpowiednie przeciwciała wtórne na wszystkie szkiełka i inkubować przez 60 min w temperaturze pokojowej w stężeniu 1:250 w roztworze blokującym (patrz krok 2.2.3) w szczelnej przed światłem „komorze wilgotnościowej” (patrz krok 2.2.1).
      1. Użyć przeciwciał wtórnych o różnych długościach fal. W tym przypadku dla przeciwciała pierwotnego rabbit anti-Iba1 zastosować donkey anti-rabbit 594 jako odpowiednie przeciwciało wtórne. Dla przeciwciała pierwotnego mouse anti-Pan-neuronal zastosować donkey anti-mouse 488 jako odpowiednie przeciwciało wtórne. Alternatywnie można użyć anti-rabbit 488 i anti-mouse 594.
   7. Przemyć szkiełka trzy razy w PBS po 5 min każde.
   8. Opcjonalnie: wykonać barwienie jąder komórkowych.
      1. Umieścić w Hoechst (lub innym barwniku jądrowym) o stężeniu 0,03 µg/ml w podwójnie destylowanej H₂O dokładnie przez 60 s.
      2. Przemyć szkiełka trzy razy w PBS po 5 min każde.
   9. Przemyć w ddH₂O.
3. Przykrywanie szkiełek
   1. Przykryć szkiełka szkiełkami cover-slip, używając wodnego medium montażowego, takiego jak Fluoromount-G lub ProlongGold. Należy zadbać o usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem.
      Uwaga: Można stosować inne środki montażowe, jednak niektórzy zauważyli silne przenikanie barwników w ciągu kilku dni od przykrycia szkiełek.
   2. Użyć bezbarwnego lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie, zapobiegając wysychaniu skrawków na skutek odparowania. Pozostawić lakier do wyschnięcia w pojemniku chroniącym przed światłem, podczas gdy szkiełka pozostają w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać w pojemniku chroniącym przed światłem, owiniętym folią, w temperaturze 4 °C.

3. Obrazowanie barwionej tkanki

1. Mikroskopia
   1. Przed rozpoczęciem mikroskopii, która powinna odbywać się w zaciemnionym pomieszczeniu, należy pozostawić lakier do paznokci do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę.
   2. Należy wykonać fotomikrografie przy użyciu mikroskopu konfokalnego lub badawczego z fluorescencyjnym źródłem światła i dołączoną kamerą cyfrową. Przy użyciu dołączonego oprogramowania należy osobno ustawić ekspozycję dla każdej długości fali – 405, 488 i 594. Uwaga: szczegółowe instrukcje obrazowania powinny być dostępne online u producenta mikroskopu.
   3. Należy wykonać fotomikrografie w każdym kanale bez przesuwania skrawków ani regulacji ostrości. Obrazy należy rejestrować w kolorze lub alternatywnie w skali szarości, a następnie przekonwertować na kolor.
      Uwaga: obrazy kolorowe lub w skali szarości z każdego kanału można zestawić podczas postprocesingu.
   4. Należy dopilnować, aby skrawki tkanki nie były wystawione na działanie światła otoczenia ani światła mikroskopowego przez dłuższy czas, ponieważ dojdzie do fotoblaknięcia skrawków. Aby tego uniknąć, należy zwiększyć czas ekspozycji zamiast zwiększać natężenie światła/lasera.
   5. Nie należy wyłączać fluorescencyjnego źródła światła w ciągu 30 min od jego włączenia.
      Uwaga: Szybkie włączanie i wyłączanie źródła może skrócić żywotność żarówki fluorescencyjnej.

Wyniki

Niniejszy protokół barwienia pozwala na uzyskanie przekrojów tkanki mózgu szczura, w których mikroglej jest znakowany fluorescencyjnie w kanale 594 (czerwony), a neurony w kanale 488 (zielony; patrz Rycina 4). W przypadku zastosowania barwienia jąder komórkowych, będzie ono widoczne w kanale 405 (niebieski). Obrazy można rejestrować w różnych kanałach, a następnie nakładać je na siebie w celu bezpośredniego porównania trzech kanałów lub dowolnych dwóch z nich. Wiele pakietów oprogramowania do akwizycji c...

Dyskusja

Ogólnym celem niniejszej publikacji było zapoznanie czytelnika z procedurami immunohistochemicznymi. W tym celu wykorzystano przykład podwójnego znakowania antygenami Iba1 oraz pan-neuronalnymi w celu obserwacji mikrogleju i neuronów w preparatach mózgu szczura, które zostały perfundowane paraformaldehydem, krioprotektowane sacharozą i poddane kriosekcjonowaniu.

Technikę tę można dostosować do wielu różnych celów. Dzięki niewielkim modyfikacjom protokołu można w sposób immunohistochemiczny zwi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka szklane Fisherbrand Superfrost Plus	Fisher Scientific	22-034-979	Używany do montażu tkanek (1.2.2)
Piekarnik	Thermo Scientific	51028112	Używany do suszenia tkanek (2.1.1)
Mini Pap pen	Life Technologies	00-8877	Używany w kroku 2.2.2
Andwin Scientific Tissue-tek Naczynie do barwienia szkiełek	Fisher Scientific	22-149-429	Używany do wszystkich prań podczas barwienia (2.2), a także do kroku Hoechst (2.2.8)
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-A	Służy do suszenia szkiełek (2.2)
Czarne pudełko do barwienia	Ted Pella	21050	Służy do blokowania i barwienia etapów (2.2)
Normalna surowica osła	Fisher Scientific	50-413-253	Służy do inkubacji blokowej i przeciwciał (2.2)
Mysz &alfa;-pan-neuronalna	milipora	MAB2300	Używany do przeciwciał pierwszorzędowych (2.2.4)
Królik α-Iba1	Wako Chemical	019-19741	Stosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe (2.2.4)
Osioł &alfa;-królik 594	Jackson ImmunoResearch	711-585-152	Używany do przeciwciał drugorzędowych (2.2.6)
Osioł &alfa;-mysz 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-150	Używany jako przeciwciało drugorzędowe (2.2.6)
Folia cateringowa	Dowolna	Nie dotyczy	Używany w krokach 1.2.2 i 2.3.2
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Używany do szkiełek nakrywkowych (2.2.8)
Szkiełka nakrywkowe	Fisher Scientific	12544E	Używany do szkiełek nakrywkowych (2.2.8)
Bezbarwny lakier do paznokci	Dowolna	Nie dotyczy	Używany do szkiełek nakrywkowych (2.2.8)
Axio Observer.Z1 i LSM 710 (skaning laserowy, konfokalny)	Carl Zeiss	Nie dotyczy	Używany do obrazowania (3)
Axioskop A2	Carl Zeiss	N/A	Używany do obrazowania (3)
CitriSolv	FisherScientific		Dla protokołu DAB
ABC	Vector Laboratories	PK-6100	Dla protokołu DAB
Zestaw peroksydazy DAB	Vector Laboratories	SK-4100	Dla protokołu DAB
Biotynylowane konie i alfa;-królik IgG	Vector Laboratories	BA-1100	Dla protokołu DAB
laboratoria wektorowe	konia i alfa-myszy IgG	BA-2001	Dla protokołu DAB
30% nadtlenek wodoru	FisherScientific	H325-500	Dla protokołu DAB
Stojaki na suwaki Wheaton i naczynia do barwienia	TedPella	21043	Do protokołu DAB
Pompa perfuzyjna Masterflex i rurka	Cole-Parmer		Używany do perfuzji (1.1.1 i 1.1.2)
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT związek (przypadek 12)	Fisher Scientific	14-373-65	Używany do zamrażania tkanek (1.2.1)
Termometr (-50 do 50 C)	Fisher Scientific	15-059-228	Używany do zamrażania tkanek (1.2.1)
Cryostat	Leica	CM3500S	Używany do cięcia tkanek (1.2.2)
Naczynie do barwienia, plastikowe z 2 pokrywkami	Grale Scientific	353	Do rerivaly antygenu
20-miejscowy stojak do barwienia, prowadnice poziome	Grale Scientific	354	Do rerivaly antygenu
Kuchenka mikrofalowa	Dowolna	Nie dotyczy	Do rerivaly antygenu

Biotynylowane