Mysia pneumonektomia jest powszechnie stosowanym modelem kompensacyjnego wzrostu płuc. Procedura ta może być stosowana w połączeniu ze śledzeniem linii lub transgenicznymi modelami myszy w celu wyjaśnienia podstawowych mechanizmów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysi model pneumonektomii kompensacyjnego wzrostu płuc
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
U ludzi zakłócona naprawa i przebudowa uszkodzonego płuca przyczynia się do wielu ostrych i przewlekłych chorób płuc, które ostatecznie mogą prowadzić do niepełnosprawności lub śmierci. Oparte na urazach modele zwierzęce naprawy i regeneracji płuc są ograniczone reakcjami specyficznymi dla urazu, co utrudnia odróżnienie zmian związanych z reakcją na uraz i ustąpieniem urazu od zmian związanych z naprawą i regeneracją płuc. Jednak wykorzystanie modeli zwierzęcych do identyfikacji tych szlaków sygnałowych naprawy i regeneracji ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych terapii mających na celu poprawę funkcji płuc po uszkodzeniu płuc. Model pneumonektomii myszy wykorzystuje kompensacyjny wzrost płuc do wyizolowania tych sygnałów naprawy i regeneracji w celu wyraźniejszego zdefiniowania mechanizmów reseptacji pęcherzyków płucnych. Tutaj opisujemy naszą technikę wykonywania pneumonektomii myszy i pozorowanej pneumonektomii. Technika ta może być wykorzystana w połączeniu ze śledzeniem linii lub innymi transgenicznymi modelami myszy w celu zdefiniowania molekularnego i komórkowego mechanizmu naprawy i regeneracji płuc.
Wprowadzenie
Główną funkcją płuc jest dostarczanie tlenu i dwutlenku węgla do wymiany między organizmem a atmosferą. U ludzi wiele wrodzonych i nabytych schorzeń prowadzi do zmniejszenia powierzchni płuc, co skutkuje upośledzeniem czynności płuc. Chociaż wiele terapii, takich jak wziewne kortykosteroidy, leki rozszerzające oskrzela, dodatkowy tlen i przewlekła wentylacja mechaniczna, jest stosowanych w celu złagodzenia konsekwencji upośledzenia czynności płuc1-3, idealna terapia tych schorzeń sprzyjałaby odrastaniu funkcjonalnej tkanki płucnej – tj. regeneracji płuc.
Regeneracja tkanek ssaków została dobrze udokumentowana. Afrykańska mysz kolczasta może regenerować duże obszary skóry bez tworzenia blizn4. Paliczek dystalny u ludzi może się zregenerować po urazie lub amputacji5-7. Po pneumonektomii (PNX) kompensacyjny wzrost płuc występuje u myszy8, szczurów9, psów10 i ludzi11. Z definicji kompensacyjny wzrost płuc obejmuje nie tylko rozszerzenie istniejących przestrzeni powietrznych, ale także ponowne przegrodowanie tych powiększonych przestrzeni powietrznych wraz z rozszerzeniem związanej z tym mikrocyrkulacji12. Analiza ekspresji genów wykazała, że model ten podsumowuje wiele zdarzeń sygnalizacyjnych związanych z rozwojem płuc13. Cztery tygodnie po mysim PNX powierzchnia wyrostka zębodołowego jest równoważna powierzchni wyrostka zębodołowego u zwierząt pozorowanych14. W tym manuskrypcie opisujemy procedury PNX na myszach i pozorowane PNX.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Oświadczenie o wykorzystaniu zwierząt: Wszystkie procedury w tym badaniu zostały przeprowadzone za zgodą i zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (IACUC) w Szpitalu Dziecięcym w Cincinnati. Ośmiotygodniowe samce myszy C57BL/6J uzyskano z Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) i pozwolono im zaaklimatyzować się przez tydzień przed użyciem. Do czasu operacji zwierzęta były trzymane w obiekcie barierowym wolnym od patogenów i dostarczano im autoklawowaną karmę i filtrowaną wodę ad libdium. Każda klatka dla myszy była zaopatrywana w dedykowane powietrze i wodę, a pomieszczenia były utrzymywane w 12-godzinnym cyklu dnia i nocy. Po powrocie do zdrowia po operacji myszy trzymano w klatkach z filtrowanymi wierzchołkami, podawano im autoklawowaną karmę ad libidum i podawano przefiltrowaną wodę z butelki z wodą.
1. Przygotowanie instrumentów
- Zrób 6 retraktorów skóry za pomocą spinaczy do papieru i szpilek. Przekręć wyprostowane spinacze do papieru na trzonkach szpilek do papieru, pozostaw prosty drut stalowy o długości 5 cm na jednym końcu i wykonaj pojedynczy haczyk w kształcie litery "U" o długości 0,5 cm na końcu drutu.
- Wykonaj kilka kwadratowych obłożeń chirurgicznych o wymiarach 15 x 15 cm za pomocą folii plastikowej. Przygotuj jeden dressing na mysz. Umieść papierową wieżę pomiędzy każdym opakowaniem.
- Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne wraz ze stosem płytek korkowych o wymiarach 12 x 12 cali, gazą i wacikami z bawełnianą końcówką.
2. Przygotowanie myszy
- Wywołaj znieczulenie 2% izofluranem. Zważ zwierzę.
- W dedykowanym obszarze przygotowania chirurgicznego ogol lewą klatkę piersiową i szyję za pomocą golarki elektrycznej.
- Nałóż kroplę maści na sztuczne łzy na oczy myszy.
- Odkazić szyję i lewą klatkę piersiową chlorheksydyną i alkoholem izopropylowym. Powtórz jeszcze dwa razy.
3. Intubacja ustno-tchawicza myszy i wentylacja mechaniczna
- Poproś niesterylnego technika chirurgicznego o umieszczenie myszy na wznak we wstępnie ogrzanym obszarze operacyjnym.
- Potwierdź głębokość znieczulenia, dokumentując brak reakcji na uszczypnięcie łapy.
- Po umyciu rąk i założeniu stroju chirurgicznego, maski i czapki załóż sterylne rękawiczki chirurgiczne.
- Po ułożeniu i zastosowaniu techniki aseptycznej należy wykonać pionowe nacięcie o długości 1 cm nad przednią częścią szyi, aby odsłonić krtań. Lekko zwiń mięśnie paska za pomocą zakrzywionych, ząbkowanych kleszczyków o długości 10 cm i odsłoń krtań i tchawicę, rozkładając mięśnie paska czubkiem prostych nożyczek.
- Doustnie wprowadzić 22 G cewnika naczyniowego do środkowej tchawicy (ryc. 1A) i wizualnie potwierdzić umieszczenie (ryc. 1B). Utrzymuj znieczulenie i wentyluj za pomocą 1-3% izofluranu przez respirator gryzoni (225 μl na udar; 200 uderzeń na minutę). Zastosuj ograniczenie ciśnienia 15 cm H2O.
4. Pneumonektomia myszy
- Połóż mysz w prawej bocznej pozycji odleżynowej z tyłem myszy skierowanym w stronę operatora (lewą stroną do góry). Użyj samouszczelniającej się folii plastikowej jako sterylnej serwety. Przecinając zasłonę, użyj zakrzywionych nożyczek z końcówką, aby wykonać cięcie o długości 2 cm równolegle do żeber w 4. i 5.przestrzeni międzyżebrowej. Włóż zakrzywione nożyczki z końcówką i odetnij skórę od leżących poniżej żeber i mięśni międzyżebrowych.
- Cofnij skórę za pomocą czterech retraktorów, aby odsłonić kwadratowe okienko chirurgiczne o wymiarach 1,5 x 1,5 cm (ryc. 2A). Przymocuj zwijacze do tablicy korkowej.
- Wypreparuj żebra za pomocą zakrzywionych kleszczy i użyj jednej końcówki zakrzywionych kleszczy, aby wejść do jamy klatki piersiowej.
- Za pomocą mikronożyczek z końcówką użyj dolnego ostrza, aby wejść do jamy klatki piersiowej. Wykonaj 0,5 cm nacięcie między żebrami i powtórz w przeciwnym kierunku.
- Używając dwóch pozostałych zwijaczy, otwórz klatkę piersiową w osi przednio-tylnej i przymocuj zwijacze do tablicy korkowej (rysunek 2B).
- Używając zakrzywionych kleszczy z końcówką w lewej ręce, chwyć lewe płuco i przesuń górną część lewego płuca bocznie i dolnie przez torakotomię, aż lewa tętnica płucna i oskrzela zostaną odsłonięte (ryc. 3A,B).
- Trzymając obciążony tytanowy aplikator mikroklipsowy naczyniowy w prawej ręce, z korpusem aplikatora w dłoni i zakrzywioną końcówką skierowaną na zewnątrz dłoni (ryc. 3C), wsuń końcówkę aplikatora do klatki piersiowej wzdłuż krzywizny tylnej części lewego płuca i przypnij lewe oskrzela i tętnicę płucną (ryc. 3D).
- Wyjmij aplikator, ale pozostaw lewe płuco schowane. Prawą ręką chwyć mikronożyczki z końcówką i przetnij oskrzela i tętnicę płucną dystalnie do klipsa i usuń lewe płuco (ryc. 3E).
- Zdemontować zwijacze żeber.
- Użyj zakrzywionych kleszczy, aby uszczypnąć 1 cm skóry poniżej nacięcia, ale powyżej poziomu przepony i wprowadzić angiocewnik 24 G przez skórę do lewej klatki piersiowej (ryc. 4A, B).
- Użyj szwu prolenowego 5-0, aby umieścić dwa przerywane szwy wokół 4. i 5. żebra, aby zamknąć klatkę piersiową.
- Usuń zwijacze skóry. Użyj dwóch zestawów kleszczy, aby przybliżyć skórę na całej długości nacięcia i przyklej skórę do środka.
- Podłączyć strzykawkę typu luer-lock o pojemności 3 ml do angiocewnika i usunąć resztki powietrza, delikatnie odsysając i wyjmując angiocewnik.
- Przyklej nacięcie szyi zamknięte za pomocą dwóch zestawów kleszczy, jak poprzednio.
5. Mysz udawana pneumonektomia
- Odsłoń lewe płuco, jak zaznaczono w protokole "Pneumonektomia myszy". Podnieś klatkę piersiową za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby umożliwić dopływ powietrza do lewej jamy klatki piersiowej (Rysunek 5A,B).
- Umieść angiocewnik 24 G w lewej jamie klatki piersiowej, jak powyżej, uważając, aby nie uszkodzić lewego płuca.
- Używając szwu 5-0 prolenu i uważając, aby nie przebić płuca (ryc. 5C), umieść dwie długości materiału szwowego w odstępach między 3. / 4. i 5. / 6. żebrem (ryc. 5D). Umieść obie długości materiału szwowego przed wiązaniem, aby zmniejszyć ryzyko przepukliny lewego płuca. Zawiąż materiał szwu, aby wykonać dwa przerwane szwy (ryc. 5E).
- Przyklej skórę do nacięcia klatki piersiowej, usuń resztki powietrza za pomocą angiocewnika i przyklej nacięcie szyi jak powyżej.
6. Resuscytacja, Analgezja i rekonwalescencja
- Należy wyłączyć izofluran i podać podskórnie 0,1 mg/kg buprenorfiny i 0,5 ml soli fizjologicznej.
- Po wznowieniu spontanicznego oddychania należy usunąć rurkę dotchawiczą.
- Obserwuj mysz, aż znów zacznie chodzić. Chodzenie zwykle wznawia się po kilku minutach od usunięcia rurki dotchawiczej.
- Umieść mysz w inkubatorze o temperaturze 27 °C (nawilżony, 25% tlenu) w celu odzyskania O/N.
UWAGA: Na podłodze klatki umieszczamy kilka granulek karmy zwilżonej wodą przez pierwsze 24 godziny po zabiegu. - Podawać 0,1 mg/kg buprenorfiny we wstrzyknięciu dootrzewnowym dwa razy na dobę przez trzy dni po zabiegu. Należy uważać, aby nie otworzyć pola operacyjnego podczas pracy ze zwierzętami.
7. Monitorowanie myszy
- Zważ myszy po 1, 3, 5 i 7 dniach od zabiegu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykres mas ciała myszy po PNX oraz po operacji pozorowanej przedstawiono na Rysunku 6. W naszych badaniach przeżywalność wynosi stale 95 - 100% zarówno dla PNX, jak i dla pozorowanej pneumonektomii. W celu zapoznania się z opisem regeneracji prawego płuca w tym modelu oraz oczekiwanym przebiegiem czasowym, odsyłamy czytelnika do publikacji Gibney et al.15 oraz Wang et al.14
Aby pomyślnie przeprowadzić procedury PNX u myszy oraz pozorowan...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiliśmy najbardziej szczegółowy opis procedur PNX na myszach i pozorowanych PNX na myszach, które zostały zgłoszone do tej pory. Uświadomiliśmy czytelnikowi kilka typowych pułapek, z którymi często spotykają się badacze uczący się tej procedury, i przedstawiliśmy kilka technik opracowanych przez nasze laboratorium w celu złagodzenia tych pułapek. Inne laboratoria wykorzystujące ten model mogły opracować inne modyfikacje techniki lub używać innych instrumentów. Oceniając różnice w technikach, poszczególni badacze ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Cincinnati Children's Hospital Division of Veterinary Services za pomoc. Ten manuskrypt był wspierany przez National Institutes of Health K12 HD028827. Dr Anna Perl nauczyła autorów tego zabiegu chirurgicznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 6-calowy aplikator z klipsem naczyniowym | Teleflex Medical (WECK) | 137062 | |
| Horizon mały tytanowo-czerwony klips | Teleflex Medical (WECK) | 1201 | |
| Wąskie kleszcze zakrzywione 12 cm | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Zakrzywione ząbkowane 10 cm Kleszcze Graefe | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Uchwyt | na igły CastroviejoFine Science Tools | 12565-14 | |
| Proste 9 cm Nożyczki do zeza (końcówka) | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Proste 8,5 cm hartowane drobne nożyczki | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Proste, nożyczki sprężynowe Cohan-Vannas | Fine Science Tools | 15000-12 | |
| Klej do skóry | Gluture | 32046 | |
| 22 G Angiocewnik | |||
| 24 G Angiocatheter | |||
| 3 ml Strzykawka | |||
| 4 Krótkie zwijacze | |||
| 2 Długie zwijacze | |||
| 5-0 Prolene na zakrzywionej igle tnącej | Ethicon | 8698G | |
| 0,5 ml Strzykawka na igle | |||
| Sól fizjologiczna normalna | |||
| Buprenorfina | |||
| Press-n-Seal Wrap | Glad Products Company | ||
| 12 x 12 cali Stos tablic korkowych | Office Depot | ||
| 70% etanolu | |||
| Betadine | |||
| Wentylator myszy | Hugo Sachs Elektronnik | Waporyzator izofluranowy Minivent Type 845 | |
| OHMEDA | Excel 210 SE | ||
| Maść na sztuczne łzy | Puralube | NDC: 17033-211-38 |
Bibliografia
- Strueby, L., Thebaud, B. Advances in bronchopulmonary dysplasia. Expert review of respiratory medicine. , (2014).
- Donn, S. M., Sinha, S. K. Recent advances in the understanding and management of bronchopulmonary dysplasia. Seminars in fetal & neonatal medicine. 14, 332(2009).
- Molen, T., Miravitlles, M., Kocks, J. W. COPD management: role of symptom assessment in routine clinical practice. International journal of chronic obstructive pulmonary disease. 8, 461-471 (2013).
- Seifert, A. W., et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561-565 (2012).
- Vidal, P., Dickson, M. G. Regeneration of the distal phalanx. A case report. Journal of hand surgery. 18, 230-233 (1993).
- Potter, P. C., Levine, M. H. Bone Regeneration Following Chronic Suppurative Osteitis of the Distal Phalanx. Annals of surgery. 80, 728-729 (1924).
- McKim, L. H. Regeneration of the Distal Phalanx. Canadian Medical Association journal. 26, 549-550 (1932).
- Brown, L. M., Rannels, S. R., Rannels, D. E. Implications of post-pneumonectomy compensatory lung growth in pulmonary physiology and disease. Respir Res. 2, 340-347 (2001).
- Holder, N. Regeneration and compensatory growth. British medical bulletin. 37, 227-232 (1981).
- Hsia, C. C. Lessons from a canine model of compensatory lung growth. Curr Top Dev Biol. 64, 17-32 (2004).
- Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367, 244-247 (2012).
- Konerding, M. A., et al. Spatial dependence of alveolar angiogenesis in post-pneumonectomy lung growth. Angiogenesis. 15, 23-32 (2012).
- Kho, A. T., Liu, K., Visner, G., Martin, T., Boudreault, F. Identification of dedifferentiation and redevelopment phases during postpneumonectomy lung growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305, 542-554 (2013).
- Wang, W., Nguyen, N. M., Guo, J., Longitudinal Woods, J. C. Noninvasive Monitoring of Compensatory Lung Growth in Mice after Pneumonectomy via (3)He and (1)H Magnetic Resonance Imaging. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 697-703 (2013).
- Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI research. 2, 48(2012).
- Rawlins, E. L., Perl, A. K. The a'MAZE'ing world of lung-specific transgenic mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 46, 269-282 (2012).
- Ochs, M., Muhlfeld, C. Quantitative microscopy of the lung: a problem-based approach. Part 1: basic principles of lung stereology. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305, L15-22 (2013).
- Ysasi, A. B., et al. Effect of unilateral diaphragmatic paralysis on postpneumonectomy lung growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305, L439-445 (2013).
- Dane, D. M., Yilmaz, C., Estrera, A. S., Hsia, C. C. Separating in vivo mechanical stimuli for postpneumonectomy compensation: physiological assessment. Journal of applied physiology. 114, 99-106 (2013).
- Mortola, J. P., Magnante, D., Saetta, M. Expiratory pattern of newborn mammals. Journal of applied physiology. 58, 528-533 (1985).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of applied physiology. 106, 984-987 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
