Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia przyżyciowa (IVM) to potężna technika obrazowania optycznego, która umożliwiła wizualizację, monitorowanie i kwantyfikację różnych zdarzeń biologicznych w czasie rzeczywistym i na żywych zwierzętach. Technologia ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat procesów fizjologicznych i zjawisk wywoływanych przez patogeny w określonych narządach.
W tym badaniu, IVM jest stosowany do wątroby myszy, a protokoły są zaprojektowane do obrazowania in vivo układu krążenia wątroby i pomiaru prędkości czerwonych krwinek (RBC) w poszczególnych naczyniach wątrobowych. Aby uwidocznić różne podtypy naczyń, które charakteryzują narząd wątroby i wykonywać pomiary prędkości przepływu krwi, myszom C57Bl / 6 wstrzykuje się dożylnie odczynnik fluorescencyjny do osocza krwi, który znakuje naczynia krwionośne związane z wątrobą. IVM umożliwia pomiar in vivo, w czasie rzeczywistym, prędkości RBC w konkretnym naczyniu będącym przedmiotem zainteresowania. Ustalenie tej metodologii umożliwi badanie hemodynamiki wątroby w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Ostatecznie ta metodologia oparta na obrazowaniu będzie ważna dla badania wpływu infekcji L. donovani na hemodynamikę wątroby.
Ta metoda może być zastosowana do innych modeli zakaźnych i narządów myszy i może być dalej rozszerzona do przedklinicznych testów wpływu leku na stan zapalny poprzez ilościowe określenie jego wpływu na przepływ krwi.
Wprowadzenie
Hemodynamika specyficzna dla narządu jest ważną fizjologiczną cechą każdego organu ssaka. Nieprawidłowości w przepływie krwi mogą być konsekwencją stanu zapalnego i oznaką dysfunkcji narządów1. W związku z tym organizacja, struktura i funkcja przepływu krwi pojawiają się jako parametry krytyczne do analizy w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Techniki, które są powszechnie stosowane do analizy przepływu krwi w określonym narządzie, mają kilka ograniczeń, w tym limit rozdzielczości samej techniki (np. obrazowanie dopplerowskie przepływu krwi), zdolność do pomiaru tylko bezwzględnego przepływu krwi (objętość krwi na jednostkę służącą narządo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i protokołami, które zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Aix-Marseille we Francji. Samice myszy C57Bl/6 w wieku 8-10 tygodni zostały pozyskane komercyjnie i traktowane zgodnie z zasadami Décret No 8 87–848, 19 października 1987 r., Paryż. Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem pasożytów L. donovani LD1S zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego wynikającymi z ustawodawstwa francuskiego i Unii Europejskiej.
1. Zakażenie myszy
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Specyficzną organizację architektoniczną zatok wątrobowych można zwizualizować w oparciu o właściwości autofluorescencyjne tego narządu (Rysunek 1, panel B i C, kolor zielony), domięśniowe wstrzyknięcie Hoechst w celu znakowania jąder hepatocytów (Rysunek 1B, kolor niebieski) oraz dożylne wstrzyknięcie fluorescencyjnej BSA do barwienia układu krążenia wątroby (Rysunek 1C, kolor czerwony). Wątroba składa się z kilku różnych podtypów naczyń o odmiennych funkcjach i struktu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niedawny rozwój mikroskopii przyżyciowej wątroby myszy otwiera nowe możliwości badania fizjologicznej odpowiedzi na zakażenie in vivo i w czasie rzeczywistym5,9,10. Przepływ krwi w narządach jest krytycznym parametrem fizjologicznym, który często ulega zmianie w wielu chorobach. Jednak stan hemodynamiki wątroby w warunkach fizjologicznych i zakaźnych pozostaje słabo zbadanym obszarem. W tym badaniu zastosowano metody oparte na IVM, które wcześniej zostały przystosowane do badania śledziony i naczyń kr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez INSERM, Uniwersytet Aix-Marsylia i nagroda za rozwój kariery od HFSPO uzyskana przez CL Forestier.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamina | PanPharma | 20434 | |
| Ksylazyna | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Ciecz cyjanoakrylowa | Cyanolit | 5833300005 | |
| Rama szkiełka nakrywkowego: Szkiełko membranowe do części mikrodystrekcyjnej N°: 5013 | Maszyny molekularne | 50103 | |
| Szkiełko nakrywkowe DiaPath 24x60 ep: 1,6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy | Leica | Przeglądarka TCS-SP5 | |
| LAS-AF | Oprogramowanie Leica | w wersji 3.1.0 buid 8587 |
Bibliografia
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
