Artykuł metodologiczny

Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

DOI:

10.3791/52307

⸱

18 stycznia 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje techniki izolacji żywych komórek i pierwotnej hodowli linii komórkowych miogennych i fibroblastów z tkanki mięśniowej lub skórnej. Opisana jest również technika unieśmiertelniania tych linii komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generowanie specyficznych dla pacjenta linii komórkowych stanowi nieocenione narzędzie do badań diagnostycznych lub translacyjnych, a komórki te mogą być pobierane z tkanki biopsji skóry lub mięśni dostępnej podczas diagnostyki pacjenta. W tym protokole opisujemy technikę izolacji żywych komórek z niewielkich ilości tkanki mięśniowej lub skórnej w celu pierwotnej hodowli komórek. Dodatkowo udostępniamy technikę unieśmiertelniania miogennych linii komórkowych i linii komórkowych fibroblastów z komórek pierwotnych. Po uwiecznieniu linii komórkowych można osiągnąć znaczną ekspansję komórek pochodzących od pacjenta. Unieśmiertelnione komórki są podatne na wiele dalszych zastosowań, w tym badania przesiewowe leków i korektę mutacji genetycznej in vitro. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diagnostyka molekularna znacznie się rozwinęła w ciągu ostatnich 20 lat. Genomowe DNA jest obecnie rutynowo izolowane z plwociny lub wymazu z policzka, podczas gdy w przeszłości wymagało pobrania krwi. Przy obecnym krótkim czasie realizacji i łatwości sekwencjonowania genów, wiele mutacji chorobowych jest rutynowo identyfikowanych bez konieczności przeprowadzania dodatkowych badań. W przypadku diagnostyki chorób mięśni, identyfikacja dziesiątek nowych genów odpowiedzialnych za dystrofię mięśniową lub miopatię w ciągu ostatniej dekady radykalnie zmieniła sposoby diagnozowania tych chorób 1,2. Obecnie istnieją dziesiątki genów, które zostały zidentyfikowane jako przyczyny dystrofii mięśniowej i wrodzonej miopatii, chociaż mechanizmy, za pomocą których wiele z tych genów powoduje chorobę, pozostają niejasne. Wyzwaniem są zwłaszcza choroby rzadkie ze względu na niewielką liczebność populacji pacjentów. W tych przypadkach, a także w przypadku bardziej powszechnych chorób, wysoce pożądane jest stworzenie stabilnych narzędzi ułatwiających badania nad mechanizmem patogenezy i badaniami przesiewowymi leków terapeutycznych.

Pomimo ogromnego postępu w diagnostyce DNA, biopsje mięśni są nadal wykonywane w celu ustalenia podstawowej diagnozy u wielu pacjentów, u których podejrzewa się pierwotną chorobę metaboliczną lub mięśniową. Gdy konieczna jest biopsja mięśnia, daje ona możliwość dodatkowego pobrania tkanek diagnostycznych i badawczych przy minimalnym dodatkowym ryzyku zachorowalności dla pacjenta. Ponieważ istnieje wiele zastosowań dla każdej próbki tkanki, wysoce pożądane jest ustanowienie technik pierwotnej hodowli komórek przy użyciu tkanki chirurgicznej, które są proste, wydajne i wymagają minimalnych ilości tkanki. Właściwa selekcja biopsji mięśni lub skóry jest wymagana, aby zmaksymalizować izolację komórek pierwotnych od tkanek i długotrwałe przechowywanie żywego materiału. Ponadto badania nad komórkami macierzystymi i badania przesiewowe leków są bardzo obiecujące w opracowywaniu terapii wielu chorób przy użyciu testów komórkowych 3,4.

Opisujemy tutaj metody pierwotnej izolacji komórek z ludzkich biopsji mięśni lub skóry. Dodatkowo dołączamy protokół unieśmiertelnienia komórek miogennych, który jest przydatny do generowania dużej liczby komórek od osobnika. Komórki te mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak niestandardowe badania przesiewowe leków, które w innym przypadku są nieosiągalne przy ogólnie niskiej liczbie komórek uzyskanych z tkanki pierwotnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Protokoły pobierania tkanek ludzkich muszą być sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet IRB. Pobieranie wyrzuconych, pozbawionych elementów pozwalających na identyfikację tkanek ludzkich zostało zatwierdzone przez Szpital Dziecięcy w Bostonie oraz Komitety IRB Brigham and Women's Hospital. Opisane poniżej metody zostały zastosowane do izolacji komórek miogennych z pozbawionych elementów pozwalających na identyfikację, wyrzuconych tkanek. Opisane metody mają zastosowanie do tkanek pobranych z materiału pacjenta, który wyraził na to zgodę.

1. Izolacja komórek

  1. Dysocjacja biopsji mięśni i oczyszczanie komórek miogennych
    1. Wstępnie zważyć 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej w kapturze bezpieczeństwa biologicznego do hodowli tkankowej, a następnie ponownie zważyć płytkę zawierającą biopsję mięśnia, aby obliczyć ilość tkanki do dysocjacji.
    2. Używając sterylnych skalpeli, drobno zmiel tkankę mięśniową i dodaj kilka kropli sterylnego 1x HBSS, aby zapobiec wysychaniu tkanki.
    3. Dodać po 3,5 ml dypazy II i kolagenazy D na gram tkanki mięśniowej do strawienia. Kilkakrotnie odpipetować tkankę mieloną i roztwór enzymatyczny przez sterylną pipetę o pojemności 25 ml. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 15 minut i trawić tkankę do momentu, aż zawiesina łatwo przejdzie przez sterylną pipetę o pojemności 5 ml.
      UWAGA: Dysocjację tkanek uzyskuje się zwykle przez trawienie enzymatyczne w ciągu 45-90 minut. Aby uzyskać dodatkowe informacje, zapoznaj się z sekcją "Reprezentatywne wyniki".
    4. Dodać 2 objętości sterylnej pożywki wzrostowej do zdysocjowanej tkanki, przefiltrować przez sitko do komórek 100 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml i komórki osadu przez 10 minut przy 329 x g (~1,100 obr./min), temperaturze pokojowej. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu mediów.
    5. Zawiesić osad w 1 objętości sterylnej pożywki wzrostowej i dodać 7 objętości roztworu do lizy czerwonych krwinek. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 40 μm, a następnie granulować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej 329 x g.
    6. Policz komórki w hemocytometrze i ponownie zawieś komórki w 1x HBSS 0,5% BSA w stężeniu 1 x 106 komórek/100 μl. Odłóż na bok ~ 250 000 komórek w jednej probówce, która zostanie użyta jako negatywna (niebarwiona) kontrola. Odłożyć na bok dodatkowe jednokolorowe barwione probówki kontrolne dla jodku propidyny i dla CD56, które są wymagane do prawidłowego bramkowania komórek CD56 dodatnich przez sortowanie FACS. Zapoznaj się z instrukcjami sortowania komórek lub skonsultuj się z ekspertami FACS ds. sortowania, aby upewnić się, że uwzględniono odpowiednie kontrole.
    7. Wybarwić komórki do sortowania 5 μl / 106 komórek przeciwciała anty CD56. Wszystkie próbki (w tym próbki kontrolne) należy inkubować na lodzie przez 30 minut.
    8. Próbki myć w 10 ml 1x HBSS i granulkach przez 10 minut przy 329 x g (~1,100 obr./min) w wirówce z chłodzeniem, w temperaturze 4°C.
    9. Dodać jodek propidyny w końcowym stężeniu 1 μg/ml do próbki, która ma być sortowana w celu wykluczenia martwych komórek. Oczyść miogenne komórki CD56 dodatnie z komórek niemiogennych za pomocą sortera komórek aktywowanych fluorescencją.
  2. Dysocjacja biopsji skóry
    UWAGA: Fibroblasty skórne można wyizolować z stempla skórnego od pacjentów, gdy biopsje mięśni nie są dostępne. Fibroblasty skórne mogą być wykorzystywane jako biomateriał do wielu badań, w tym transdukcji za pomocą MyoD w celu wytworzenia komórek miogennych. Dodatkowo fibroblasty skóry mogą być wykorzystywane do generowania komórek iPS, które można różnicować w różne typy komórek w celu dalszych badań.
    1. Przetransportować biopsję skóry do laboratorium w podłożu transportowym. Po otrzymaniu próbki należy jak najszybciej przeprowadzić hodowlę pierwotną. Jeżeli nie można ustalić hodowli pierwotnej tego samego dnia, należy przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej przez noc.
    2. Przenieść biopsję skóry na sterylną szalkę Petriego o średnicy 35 mm w okapie z przepływem laminarnym.
    3. Spłucz biopsję skóry na szalce Petriego sterylnym 1x PBS, aby usunąć krew i zanieczyszczenia. Usuń tkankę tłuszczową za pomocą sterylnego skalpela.
    4. Dodać 2 ml roztworu kolagenazy i zmielić tkankę skalpelem, inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut do 1 godziny, w zależności od wielkości tkanki.
    5. Przenieść strawioną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, dwukrotnie przepłukać szalkę Petriego 2 ml pożywki hodowlanej fibroblastów i zebrać pożywkę do tej samej probówki.
    6. Komórki osadu w ilości 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Odrzucić supernatant i przemyć osad 3 ml pożywki fibroblastów w celu usunięcia kolagenazy, a następnie ponownie rozsiać komórki osadu. Proszę zapoznać się z tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat składu mediów.
    8. Powtórz krok 1.2.7 jeszcze raz.
    9. Zawiesić osad w 5 ml pożywki fibroblastowej i komórkach płytki na sterylnej kolbie do hodowli tkanek T25. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    10. Oceń kulturę pod kątem przyłączenia i wzrostu fibroblastów w ciągu najbliższych 1-3 dni.
      UWAGA: Niektóre małe kawałki tkanki mogą również przyczepiać się do płytki, a fibroblasty migrują z tych fragmentów tkanki.
    11. Utrzymuj kulturę w tych samych warunkach, aż fibroblasty osiągną około 80% zbieżności.
    12. Zbierz fibroblasty przez trypsynizację i przenieś do świeżych kolb hodowlanych w celu dodatkowej ekspansji. Przeprowadź trypsynizację, myjąc kultury 3 razy w 1x PBS wolne od Ca++ i Mg++. Dodać trypsynę-EDTA (patrz tabela materiałów) do komórek (2 ml / kolba T25) przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.
    13. Podziel odłączone komórki na dodatkowe kolby. Jeśli niektóre fragmenty tkanek pozostaną połączone z oryginalnymi kolbami T25, dodaj 5 ml świeżej pożywki hodowlanej do tej kolby, a więcej fibroblastów będzie migrować w sposób ciągły.
      UWAGA: Ekspandowaną kulturę fibroblastów można zamrozić jako P1 i przechowywać w ciekłym azocie do przyszłych eksperymentów.

2. Unieśmiertelnienie komórek miogennych

  1. Umieść 5 milionów komórek pakujących Phoenix Ecotropic (PE) przez noc na 10 cm sterylnej płytce do hodowli tkankowej w DMEM i pożywce 199 w stosunku 4:1, uzupełnionej 10% surowicą cielęcą.
  2. Nakarm komórki 30 minut przed transfekcją 5 ml świeżej pożywki uzupełnionej 10 mM kofeiny.
  3. Homogenizować mieszaninę 2 μg plazmidowego DNA z preparatu midi (plazmid CDK4 lub hTERT) i polyjet i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, zgodnie z zaleceniami producenta.
  4. Dodaj mieszaninę plazmidu / polyjet do komórek PE na noc.
  5. Nakarm komórki świeżą pożywką (DMEM i Pożywką 199 w stosunku 4:1, uzupełnioną 10% surowicą cielęcą). Dwanaście godzin później zbierz supernatant zawierający wirusa i przefiltruj go przez filtr o wielkości porów 0,45 μm.
  6. Użyć 1 ml zebranego supernatantu do zakażenia przez noc amfotropowej linii komórkowej PA317 5 i uzyskać stabilną linię komórkową wytwarzającą wirusa po selekcji za pomocą 0,5 mg/ml neomycyny (G418) dla CDK4 lub 0,5 mg/ml higromycyny dla hTERT.
  7. Przygotuj działające supernatanty wirusowe, hodując stabilne komórki pakujące do poziomu bliskiego zrębowi, a następnie zbierając supernatant każdego ranka, wieczoru i ranka przez trzy zbiory.
  8. Przefiltrować supernatanty wirusa i albo użyć je bezpośrednio, albo podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Należy pamiętać, że supernatant wirusa traci 50% skuteczności infekcji przy każdym zamrażaniu-rozmrażaniu. Pamiętaj, aby wyprać wybielacz przed wyrzuceniem wszystkiego, co miało kontakt z cząsteczkami wirusa.
    UWAGA: Stabilną linię komórkową wytwarzającą wirusa PA317 można zamrozić i utrzymywać w temperaturze -150 °C w celu trwałego przechowywania (pożywka do zamrażania to 10% DMSO; 90% surowicy).
  9. Komórki miogenne oczyszczone metodą FACS (opisane w krokach 1.1-1.9) o gęstości 5 x 104 komórki / studzienkę na płytkach 6-dołkowych pokrytych 0,1% żelatyną. Upewnij się, że komórki są przymocowane do płytki przed przystąpieniem do infekcji wirusowej.
  10. Dodać 400 μl przefiltrowanego, świeżo wyprodukowanego supernatantu wirusowego lub zamrożonych podwielokrotności do każdej sześciodołkowej płytki przez noc (zachować 2 dołki jako kontrole).
  11. Zmień pożywkę, karmiąc komórki 2,5 ml / studzienkę świeżego podłoża mięśniowego (4:1 zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM) i Pożywka 199 firmy Dulbecco uzupełnione 15% płodową surowicą bydlęcą; 0,02 M bufor HEPES; 1,4 mg/L witaminy B12; 0,03 mg/L ZnSO4, 0,055 mg/l deksametazonu, 2,5 μg/l czynnika wzrostu hepatocytów i 10 μg/l zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów). Wyrzuć media i pipety zawierające cząsteczki wirusa do pojemnika z wybielaczem. Pozostaw komórki w tym samym pożywce na 3 dni, aby wyzdrowiały po infekcji, a następnie poddaj je selekcji za pomocą 400 μg/ml neomycyny (zakażenie CDK4) lub 300 μg/ml higromycyny (zakażenie hTERT).
  12. Utrzymuj komórki pod selekcją leków, aż komórki w naczyniu kontrolnym obumrą (1-2 tygodnie).
  13. Pasaż komórek, zanim staną się zlewające (60-80% konfluencji; przy użyciu 0,05% trypsyny EDTA), nawet w okresie selekcji. Ponownie płytkować komórki w wielu 10-centymetrowych szalkach ze świeżą pożywką mioblastową (jak opisano w 2.11) uzupełnioną lekiem selekcyjnym. Utrzymuj unieśmiertelnione wybrane komórki jako heterogeniczną populację lub klon, aby uzyskać całkowicie jednorodne tło genetyczne (taka sama insercja transgenu w każdej komórce).
  14. Wykonaj selekcję klonalną, wykonując następujące czynności:
    1. Wysiewaj komórki o małej gęstości (np. 300 do 500 komórek na 10 cm szalkach) i utrzymuj je przez około dwa tygodnie, aż utworzą się małe kolonie (10-20 komórek).
    2. W tym momencie usuń większość pożywki, pozostawiając tylko cienką warstwę, aby zapobiec wysychaniu komórek.
    3. Umieść pierścień klonujący (z jednym końcem zanurzonym w silikonowym smarze próżniowym) na każdym pożądanym klonie i dodaj kilka kropli trypsyny/EDTA.
    4. Zbieraj komórki, gdy już się zaokrąglą, ostrożnie odsysając komórki za pomocą końcówki o pojemności 1 ml lub pipety Pasteura i przenosząc je na najmniejszą dostępną płytkę wielodołkową (płytki 96 lub 48, 24 lub 12-dołkowe).
    5. Rozwiń klony zgodnie z potrzebami, aby zapobiec konfluencji lokalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 ilustruje niektóre z kluczowych etapów związanych z pierwotną dysocjacją tkanki: dokładna ilość tkanki jest ważona na sterylnej szalce Petriego do hodowli tkanek (Rysunek 1A, B). Tkanka jest następnie drobno mielona za pomocą sterylnych skalpeli, aż do uzyskania zawiesiny tkanki (ryc. 1C, D). Po dodaniu enzymów trawiennych, pierwotna dysocjacja tkanki mięśniowej jest zwykle osiągana przez trawienie enzymatyczne w ciągu 45-90 minut. Postęp trawienia tkanek jest ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki jako użyteczny zasób

Izolacja i hodowla populacji komórek miogennych jest niezwykle przydatna przy ustalaniu fenotypów choroby lub modeli choroby in vitro . Opisana tutaj procedura izolacji komórek miogennych umożliwia izolację mioblastów i fibroblastów z próbek mięśni szkieletowych, które można następnie rozmnażać, różnicować lub natychmiast analizować. Strukturę i funkcję mioblastów można ocenić za pomocą badania mikroskopowego, oceny przeżycia komórek, oceny fuzji komórek l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta publikacja jest finansowana przez Cure CMD, grant Association Contre Les Myopathies (AFM) (projekt 16297) oraz przez National Institutes of Health (granty o numerach K08 AR059750, L40 AR057721 i 2R01NS047727).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt
Tissue  kultura kaptur bezpieczeństwa biologicznegoBaker Company, Inc.Model SterilGuard Hood
Wirówka stołowa, taka jak Beckman Model Beckman CoulterModel Allegra 6RJeśli przeprowadzane jest sortowanie komórek, preferowana jest wirówka z chłodzeniem
MikroskopNikonModel Eclipse TS100
Inkubator do hodowli tkankowych, podłączony do CO2 źródłoForma Scientific Sortownik komórek aktywowany
(FACS)Odczynniki Becton DickinsonModel Aria
do izolacji pierwotnych mioblastów z tkanek
Dyspasa IIRoche Applied Science#04942078001Przygotuj roztwór skarpety o stężeniu 2,4U/ml w kolagenazie DMEM
D Roche Applied Science#088882001Przygotować roztwór podstawowy 10 mg/ml
1x Sterylny motek' s Zrównoważony roztwór soli fizjologicznej (HBSS), wolny od wapnia i magnezuGIBCO Life Technologies#14185-052
Albumina surowicy bydlęcej, frakcja VSigma#05470Przygotuj sterylny  roztwór 1X HBSS 0,5% BSA do sortowania FACS
Sterylna pożywka wzrostowa dla mioblastów: Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Pożywka (DMEM) z wysokim poziomem glukozy (4,5 g) uzupełniona 30% płodową surowicą bydlęcąGIBCO Life Technologies11965-092Zawiera L-glutaminę
Roztwór do lizy RBCQiagen158904
Jodek propidium 10 mg / mlSigmaP4170Przygotuj roztwór podstawowy, rozcieńczając proszek w sterylnej wodzie destylowanej
Przeciwciało anty-ludzkie CD56 do cytometrii przepływowej Biolegend318310Przeciwciało sprzężone z APC, dostępne są inne etykiety
Odczynniki do unieśmiertelnienia pierwotnych mioblastów Ekotropowa
linia komórkowapakowania PE Cell BiolabsRV-101
Amfotropowa linia komórkowa pakowania PA3174Cell BiolabsRV-102
Żelatyna ze skóry świniSigmaG1890-500gPrzygotować roztwór podstawowy 0,1% żelatyny w wodzie. Posmaruj naczynie roztworem o temperaturze 37& C przez jedną godzinę. Usuń roztwór i dodaj pożywkę.
PolyJet SignagenSL100688
G418Fisher345812
HygromycynaEMD Biosciences400051
plazmidy pBabe zawierające mCDK4 i hTERTniedostępneStadler i wsp., 2013
Qiagen plasmid midiprep kitQiagen12143
Medium 199Life Technologies Średni 199 (31150022)
Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle medium (DMEM)Life Technologies DMEM (11965-092)Mix 4:1 DMEM:199
Pożywka wzrostowa Myoblast: 4:1 Dulbecco' s zmodyfikowane Eagle Medium (DMEM) i Medium 199 uzupełnione 15% płodową surowicą bydlęcą; 0,02 M bufor HEPES; 1,4 mg/l witaminy B12; 0,03 mg/L ZnSO4, 0,055 mg/L deksametazon, 2,5 μ czynnik wzrostu hepatocytów g/L i 10 μ czynnik wzrostu g / L beta fibroblastów.Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (siarczan); Sigma (witamina B12, deksametazon); Chemicon international (HGF); Biopionier (betaFGF) #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). Przygotować pożywkę i roztwór podstawowy witaminy B12 (20 mg/ml); Siarczan (60&mikro; g/ml); Dex (55 i mikro; g/&mikro; l) oddzielnie dla łatwiejszego użytkowania. Roztwór podstawowy HGF (5&mikro; g/ml) i FGF (20&mikro; g/ml) powinny być dodawane świeżo co tydzień w końcowym stężeniu roboczym.
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
Przeciwciało o łańcuchu ciężkim miozyny do barwienia immunologicznegoRozwojowy Hybrydoma BankMF20Klon MF20
Przeciwciało Desmin do barwienia immunologicznegoThermo ScientificMS-376-S0Klon D33
Surowica końskaInvitrogen26050-088
Odczynniki do pierwotnej izolacji fibroblastów skóry
Pożywka transportowa: RPMI 1640 uzupełniony o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 0,2% penicyliny/streptomycynyPożywka RPMI 1640: GIBCO Life Technologies11875-093
Pożywka do hodowli pierwotnych fibroblastów ludzkich: RPMI 1640 uzupełniona o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycynyPłodowa surowica bydlęca: Thermo ScientificSH30071.03
Roztwór kolagenazy: Kolagenaza typu 2 (100 mg) zawieszona w 12,5 ml pożywki hodowlanej fibroblastów i wysterylizowana filtremWorthington4176
Sterylny 1X Bufor Fosforanowy Sól Solna (PBS) bez wapnia i magnezuLonza17-516F
Materiały do izolacji pierwotnych mioblastów
50 ml i 15 ml sterylne probówki stożkoweGeneMate/BioexpressC-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))Sterylne
skalpeleAspen Surgical372610
HemocytometrHausser Scientific1492
Sterylne pipety 5, 10 i 25 ml Bellcoglass1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)Pipety wielokrotnego użytku są myte, zatykane bawełniane i autoklawowane przed użyciem
Sterylne plastikowe naczynia poddane kulturze tkankowej (10 cm)BD Falcon353003
Sterylne nylonowe sitka do komórek (100 &mikro; m oraz 40 i mikro; Rozmiar m)BD Falcon352340 (40 i mikro; m); 352360 (100 cali; m)
  Materiały do unieśmiertelniania
Sterylne 0,45 i mikro; mfiltry MilliporeSLHV013SL
Pierścienie klonująceCorning#3166-8Do czyszczenia i autoklawowania przed i po użyciu
Materiały do linii komórkowych fibroblastów 
Sterylne 35 mm plastikowe naczynia z kulturami tkankowymiGreiner bio-one628160
Sterylne skalpeleDeRoyalD4510A
tkankowych T25Produkt z tworzywa sztucznego, TPP90026sprzedawany w USA przez MIDSCI
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
fluorescencją serii II na rynku mioblastów Sterylne kolby do hodowli

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
  2. Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
  3. Sharples, A. P., Stewart, C. E. Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).
  4. Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine. Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).
  5. Miller, A. D., Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).
  6. Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).
  7. Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom. Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).
  8. Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
  9. Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. Are human and mouse satellite cells really the same. J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).
  10. Belles-Isles, M., et al. Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM. Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).
  11. Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice. PLoS One. 6, e17454(2011).
  12. Zhu, C. H., et al. Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies. Aging Cell. 6, 515-523 (2007).
  13. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet Muscle. 1, 34(2011).
  14. Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).
  15. Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Res. 42, e104(2014).
  16. Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells. Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).
  17. Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
  18. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).
  19. Choi, J., et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).
  20. Huard, C., et al. Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles. Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).
  21. Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).
  22. Park, J. I., et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin. Nature. 460, 66-72 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

Tagi

Izolacja z biopsji mi niaunie miertelnianie linii kom rkowychpierwotna hodowla kom rekoczyszczanie metod FACSr nicowanie kom rek miogennychnadekspresja CDK4ekspresja hTERTprodukcja supernatantu wirusowegoselekcja antybiotykowatechnika pier cienia klonuj cego

Powiązane artykuły