Celem tej techniki jest umożliwienie naukowcom przeprowadzenia sekcji, barwienia immunologicznego i montażu krążków z oczami poczwarek Drosophila melanogaster w każdym wieku.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wypreparowanie i montaż krążków ocznych poczwarki Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dysk oka Drosophila melanogaster to potężny system, który może być używany do badania wielu różnych procesów biologicznych. Zawiera około 800 oddzielnych jednostek ocznych, określanych jako ommatidia1. Każde ommatidium zawiera osiem fotoreceptorów neuronalnych, które rozwijają się z niezróżnicowanych komórek po przejściu bruzdy morfogenetycznej w trzecim stadium larwalnym2. Po sekwencyjnym różnicowaniu fotoreceptorów rozwijają się komórki nieneuronalne, w tym komórki czopków i barwników, a także mechanosensoryczne komórki szczeciniaste3. Końcowe procesy różnicowania, w tym ustrukturyzowane ułożenie wszystkich typów komórek ommatidialnych, zaprogramowana śmierć komórek niezróżnicowanych typów komórek i ekspresja rodopsyny, zachodzą w faziepoczwarki 4-7. Technika ta koncentruje się na manipulowaniu krążkiem oka poczwarki, zapewniając wgląd i instrukcje, jak preparować dysk oka podczas fazy poczwarki, co jest z natury trudniejsze do wykonania niż zwykle preparowany krążek oka w trzecim stadium rozwojowym. Technika ta dostarcza również szczegółowych informacji na temat barwienia immunologicznego, aby umożliwić wizualizację różnych białek i innych składników komórek.
Wprowadzenie
Na dziedziny rozwoju i biologii komórkowej duży wpływ miał organizm modelowy: Drosophila melanogaster. W ramach tego modelu badania tarczy oka wniosły ogromną wiedzę na temat sygnalizacji, biologii komórki i innych obszarów. Późna trzecia larwa w stadium ocznym, tarcza oka była szeroko badana i jest potężnym modelem do wykorzystania, ponieważ daje migawkę serii okresów rozwojowych, z których każdy ma swoje własne unikalne cząsteczki i procesy sygnałowe, w miarę postępu morfogenetycznej bruzdy w poprzek tarczy oka8. Istnieje jednak potrzeba dalszego poszerzania naszej wiedzy na temat procesów rozwojowych w fazie rozwoju poczwarki. Chociaż przeprowadzono badania nad dyskiem oka poczwarki3-7, nasza wiedza nie zbliża się do zakresu pracy, która została wykonana na dysku oka w trzecim stadium rozwojowym. Wynika to po części z większej trudności w rozwarstwieniu dysku oka poczwarki. W związku z tym przedstawienie właściwej metody preparacji mogłoby znacznie poszerzyć badania w tym zakresie.
Chociaż istnieją etapy rozwoju dysku oka poczwarki, które łatwo jest przeanalizować, szczególnie w okresie środkowej poczwarki, inne okresy są znacznie trudniejsze do przeanalizowania. Protokół ten stanowi jedną z metod preparowania krążków oka poczwarki, która może być powszechnie stosowana we wszystkich ramach czasowych rozwoju poczwarki. Protokół ten może być stosowany jako alternatywa dla innego protokołu9, który pokazuje łatwiejszą i szybszą metodę preparowania krążków oka z punktów czasowych w połowie poczwarki. Protokół ten został pierwotnie sfilmowany i opracowany do szkolenia zaawansowanych studentów studiów licencjackich w UCLA Undergraduate Research Consortium in Functional Genomics (URCFG)10,11 w technice rozwarstwienia oka poczwarki. Wielu studentów studiów licencjackich było w stanie wykorzystać ten film i metodę, aby nauczyć się tej trudnej techniki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ta procedura jest procedurą 2-dniową.
Dzień 1 (2 godziny + czas analizy)
1. Rozwarstwienie dysku oka poczwarki
- Wybierz poczwarkę do sekcji.
nuta: Wiek poczwarki, która ma być poddana sekcji, zostanie określony na podstawie potrzeb doświadczalnych. Jednak w przypadku badania morfologii komórek często odbywa się to po 42 godzinach od powstania poczwarki (APF) w temperaturze 25 °C, co odpowiada wiekowi poczwarek pokazanych na filmie. Zebrać białe poczwarki (uważane za 0 godz. APF) za pomocą zwilżonego pędzla i ułożyć je w porządku chronologicznym (na podstawie czasu zbierania) w nowej fiolce z pokarmem dla much utrzymywanej w temperaturze 25 °C. Rozbioruj stare poczwarki w tej samej kolejności chronologicznej, aby zachować jak najmniejsze różnice czasu między poczwarkami. - Przenieść poczwarkę do kropli soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4, patrz materiały, aby zapoznać się z przepisem) na silikonowej płytce rozwarstwiającej.
- Przytrzymaj górną część etui poczwarki kleszczami i przebij i otwórz dolną część etui poczwarki parą ostrych kleszczy. Wyjmij poczwarkę z obudowy w nowo utworzonym otworze.
- Wykonaj ukośne cięcie nożyczkami, w połowie klatki piersiowej, w poczwarce. Usuń resztki lub przenieś głowę poczwarki do nowej kropli PBS. Wyczyść za pomocą rurki dmuchawy pipety (szczegółowe informacje znajdują się w materiałach i na rysunku 1) i w razie potrzeby dodaj dodatkowy PBS. Upewnij się, że nie masz odwodnienia.
- Mocno chwyć górną część naskórka głowy poczwarki za pomocą kleszczy. Używając końcówki rurki dmuchawy, delikatnie popchnij obudowę poczwarki, aby wyciągnąć mózg i inne tkanki, w tym krążki oczu, z obudowy poczwarki. Pamiętaj, aby nie chwytać żadnej tkanki w obrębie naskórka.
- Używając rurki dmuchawy wypełnionej PBS, delikatnie wydmuchaj tkankę tłuszczową, tkankę ciała i inne zanieczyszczenia z obudowy głowy, aby wyraźnie oddzielić i zidentyfikować dyski mózgowe i oczne.
nuta: Utrzymanie mózgu przymocowanego do obudowy głowy poczwarki pozwoli badaczowi używać obudowy głowy jako "uchwytu" do przyszłej manipulacji tkanką bez uszkadzania krążków ocznych lub mózgu. Jednak często zdarza się, że dyski mózgowe i oczne są usuwane z obudowy głowy, co nie jest szkodliwe dla całej procedury i wyników. Często potrzeba wielu prób i pchania, aby skutecznie wydobyć krążki oka i mózg z wnętrza głowy poczwarki i tak, aby były wyraźnie oddzielone od otaczającej tkanki. Czystszy i bardziej oddzielny może uzyskać krążki oczne z otaczającej tkanki, co pomoże zapobiec przyczepianiu się obcych tkanek do krążków ocznych. - Po rozbiorze należy natychmiast przenieść tkankę do 3-dołkowego szklanego naczynia na lodzie z 0,5 ml roztworu Fix (patrz materiały). Unosić tkankę na powierzchni roztworu Fix przez kilka minut (zwykle czas potrzebny na wypreparowanie następnego zestawu krążków oka).
UWAGA: Jeśli nie jest to pierwsza tarcza oka do wypreparowania w tej rundzie sekcji, całkowicie zanurz poprzednią tarczę oka w roztworze Fix. W przypadku wykonywania specjalnych procedur barwienia (np. reaktywnych form tlenu, lizosomów itp.) należy to zrobić przed utrwaleniem. W tym celu należy przechowywać wypreparowane krążki oka w lodowato zimnym PBS przed kontynuowaniem odpowiedniego protokołu barwienia. - Po rozbiorze i zanurzeniu wszystkich dysków ocznych, które są preparowane, przenieś szklane naczynie z 3 dołkami do kołyski i kołysz w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
2. Barwienie immunologiczne
- Ostrożnie usunąć roztwór Fix i dodać 0,5 ml PBS z 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, patrz materiały) i myć chusteczkę na bujaku przez 10 minut. Powtórz ten krok jeszcze trzy razy, w sumie 4 prania (10 minut każde).
nuta: Ostrożne usunięcie roztworu ze studzienki można wykonać pod mikroskopem preparacyjnym, aby zapobiec uszkodzeniu lub utracie tkanek. Roztwór można ostrożnie odessać za pomocą pipety; Preferujemy jednorazową pipetę transferową z cienką końcówką, której otwór został spłaszczony, aby zmniejszyć ryzyko zasysania tkanki. - Pod koniec czwartego płukania usunąć płukanie i dodać 0,5 ml roztworu blokowego (patrz materiały) do studzienki i inkubować przez 30 min.
nuta: Ten okres może zostać wydłużony w zależności od potrzeb. - Pod koniec 30-minutowego czasu blokowego odpipetować 10 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczonego w roztworze blokowym) do odpowiedniej liczby dołków w płytce mikrodołkowej.
nuta: Jedna studzienka płytki mikrodołkowej pomieści około 4 par krążków ocznych przymocowanych do obudowy poczwarki lub 8 izolowanych par krążków ocznych z przyczepionymi mózgami. Podstawowymi przeciwciałami stosowanymi w tym protokole dla reprezentatywnych danych są antyfosfotyrozyna (rozcieńczenie 1:500) i anty-Cut (rozcieńczenie 1:200). - Przenieś wypreparowaną tkankę do dołków na płytkę mikrodołkową wypełnioną roztworem przeciwciała pierwotnego ze szklanego naczynia z 3 dołkami.
- Umieścić płytkę mikrodołkową na zwilżonym ręczniku papierowym (aby zapobiec odwodnieniu) w pustym pudełku z końcówką pipety (lub innym podobnym pojemniku) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
Dzień 2 (4 godziny + czas montażu)
- Przenieś tkankę z płytki mikrodołkowej do nowego szklanego naczynia z 3 dołkami z 0,3% PBT (≈0,5 ml) i myj chusteczkę przez 10 minut na bujaku. Powtórz ten krok jeszcze trzy razy, w sumie 4 prania (10 min każde)
- Usuń ostatnie płukanie i dodaj 0,5 ml roztworu blokowego do studzienki. Blok na 30 min.
nuta: Ten okres może zostać wydłużony w zależności od potrzeb. - Usunąć roztwór blokowy i dodać 0,5 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych (wykonanego z fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał odpowiednich dla przeciwciała pierwszorzędowego i długości fali fluorescencyjnej, rozcieńczonego w roztworze blokowym) do studzienki i chronić szklane naczynie 3-dołkowe przed światłem pokrywą lub folią aluminiową i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
nuta: Wszystkie kolejne kroki powinny być w podobny sposób chronione przed ekspozycją na światło. Inkubację tę można przedłużyć do nocy w temperaturze 4 °C, w konfiguracji podobnej do inkubacji przeciwciał pierwotnych, ale można ją również przeprowadzić w szklanym naczyniu z 3 dołkami pokrytymi folią laboratoryjną lub na płytce mikrodołkowej, jeśli pożądane jest zachowanie przeciwciał. - Pod koniec inkubacji przeciwciał usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i dodać 0,5 ml 0,3% PBT do studzienki i myć na bujaczu przez 10 minut. Powtórz ten krok, w sumie 4 płukania (10 minut każde).
nuta: Jeśli pożądane jest barwienie DAPI, przed rozpoczęciem pierwszego prania dodaj 0,5 μl roztworu podstawowego DAPI (patrz materiały) do 500 μl PBT, który zostanie użyty do pierwszego prania (rozcieńczenie 1:1,000).
3. Montaż
- Pod koniec ostatniego prania zamontuj tarcze antenowe/oczne na szkiełku, używając 70% glicerolu lub PBS jako podłoża, aby usunąć mózg i inne niechciane tkanki w basenie po jednej stronie szkiełka.
- Ostrożnie przesuń tkankę za pomocą ciśnienia hydrostatycznego między kleszczami lub bardzo delikatnie za pomocą końcówki kleszczyka i ustaw krążki oczu w kolumnie w kierunku środka szkiełka.
- Usuń cały obcy glicerol lub PBS z okolic tkanki (używając w tym celu odprowadzającego wilgoć działania chusteczki laboratoryjnej lub kleszczy).
- Umieścić niewielką ilość (≈10 μl) podłoża montażowego po jednej stronie kolumny krążka oka i umieścić szkiełko nakrywkowe na tkance tak, aby rozprowadzić podłoże mocujące na krążkach oka.
- Pozostaw szkiełko na 1 do 2 minut, aby chusteczka/podłoże montażowe całkowicie się rozprowadziło.
- Zetrzyj nadmiar podłoża montażowego z okolic krawędzi szkiełka nakrywkowego i uszczelnij je przezroczystym lakierem do paznokci.
- Uchwyć fluorescencyjne obrazy dysków oka za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jako przykład zastosowania niniejszego protokołu, na rysunku 2 przedstawiono wyniki obrazujące krążki oczne w stadium środkowej poczwarki (42 h APF w 25 °C), poddane immunobarwieniu różnymi przeciwciałami. Dzięki zastosowaniu przeciwciała skierowanego przeciwko pozostałościom fosfotyrozyny można zaobserwować błony komórkowe (Rysunek 2A). Można to wykorzystać do zidentyfikowania regularnego układu komórek ommatidialnych w oku poczwarki po końcowych procesach wzorowania, które zachodzą przed stadium środko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż wydaje się, że proces ten jest prosty i łatwy do wykonania, w rzeczywistości opanowanie tej techniki wymaga dużo praktyki. Rutynowo zaczynamy od nauki preparowania i montowania krążków trzeciego oka12, które są znacznie łatwiejsze w obsłudze. Praktyka ta pomaga wypracować odpowiednią pozycję preparacyjną ramion, dłoni i palców13 tak, aby manipulacja kleszczami pod mikroskopem sekcyjnym była stabilna, łatwa i doświadczona. Zasadniczo, okres ćwiczeń powinien osiągnąć cel, jakim jest uczynie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Doceniamy i chcielibyśmy podziękować Instytutowi Medycznemu Howarda Hughesa za nagrodę HHMI Professor dla U.B., która umożliwiła ten projekt. Dziękujemy uczelni Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles za zapewnienie obiektów i wsparcia infrastruktury dydaktycznej dla tej pracy. Prace były również wspierane przez fundusze z Midwestern University i hojną darowiznę z Charity Fidelity Gift Fund. Dziękujemy Johnowi VandenBrooksowi za komentarze do manuskryptu i Kriscie Pearman za jej pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH 7,4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Zwiększ głośność do 1 μ l, dostosuj pH do 7,4, sterylizuj w autoklawie lub filtrze, rozcieńcz do 1x PBS z autoklawowanym ddH2O przed użyciem. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Uwaga: Działa drażniąco! Nosić rękawice. |
| 0,3% PBT | 1,5 ml Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37% roztwór formaldehydu | Fisher Scientific F75P1GAL | Uwaga: Toksyczny, prawdopodobny czynnik rakotwórczy dla ludzi! Nosić rękawice. | |
| Napraw rozwiązanie | (≈ 4% formaldehydu w PBS) 50 μ l 37% formaldehydu, 450 μ l 1x PBS, przed użyciem przygotuj świeże | ||
| Normalna surowica kozia | Przeciwciała Rockland i testy | B304 | Aliquot w objętościach 1 ml i przechowywać w temperaturze -80 ° Roztwór |
| 10% NGS w PBT. Można to zrobić i przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C na kilka dni przed użyciem. | |||
| Roztwór podstawowy DAPI | Life Technologies | D3571 | Do barwienia jąder morskich. Przygotować roztwór o stężeniu 1 mg/ml z ddH2O. |
| VectaShield Medium | montażowe Vector Labs | H-1000 | Medium montażowe |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Do montażu. Przygotować 70% rozcieńczenie z ddH2O. |
| Sprzęt | |||
| Mieszalnik nutacyjny | VWR | 82007-202 | Służy do kołysania tkanki w 3-dołkowym szklanym naczyniu |
| SylGard 182 Zestaw elastomerów silikonowych | Krayden | NC9897184 | Służy do produkcji silikonowego naczynia preparacyjnego |
| Silikonowe naczynie | preparacyjneDelikatnie wymieszaj zestaw elastomerów Sylgard (powyżej) zgodnie z instrukcją (aby uniknąć pęcherzyków). Wlej mieszaninę na szalkę Petriego (dowolnej wielkości). Pozostawić SylGard do utwardzenia przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza; Inkubator C. | ||
| Naczynie szklane 3-dołkowe | Corning | 7220-85 | Odmiana 3-dołkowa nie jest już dostępna, jest to produkt 9-dołkowy. |
| 72-dołkowa minitaca z mikrostudzienką | Nunc | 438733 | |
| Ostre kleszcze (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Mikronożyczki typu Vannas, proste, ostrze 5 mm | Ted Pella | 1346 | |
| Kapilary ze szkła borokrzemianowego 100 mm | World Precision Instruments | 1B100-4 | Pociągnij za pomocą ściągacza do igieł, aby uzyskać cienką końcówkę, która umożliwia przepływ niewielkiego strumienia PBS. |
| Jednorazowe pipety transferowe, cienka końcówka | Samco Scientific | 231 | |
| Podane wymiary rurek to średnica wewnętrzna (ID) x średnica zewnętrzna (OD) x grubość ścianki w calach | |||
| Rurka PVC (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Użyj ich z ciągniętą igłą do montażu rurki dmuchawy, jak pokazano na rysunku 2. |
| Rurka silikonowa Tygon (3/32 x 5/32 x 1/32) | Rurka silikonowa Saint Gobain Performance ABW00004 | ||
| Rurka silikonowa Tygon (1/32 x 3/32 x 1/32) | Rurka Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
Bibliografia
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
- Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
- Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347(2012).
- Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59(2005).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936(2010).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
