Adaptacja metod badania wideofluoroskopowego jaskółki u ludzi do wykrywania i charakteryzowania dysfagii w modelach choroby myszy

Podsumowanie

To badanie z powodzeniem zaadaptowało metody ludzkiego wideofluoroskopowego badania połykania (VFSS) do użycia z modelami chorób mysich w celu ułatwienia badań nad dysfagią translacyjną.

Streszczenie

To badanie zaadaptowało metody ludzkiego wideofluoroskopowego połykania (VFSS) do użycia z modelami choroby mysiej w celu ułatwienia badań nad dysfagią translacyjną. Pomyślne wyniki zależą od trzech krytycznych elementów: komór testowych, które umożliwiają samodzielne karmienie w pozycji stojącej bez ograniczeń w ograniczonej przestrzeni, przepisów, które maskują awersyjny smak/zapach dostępnych na rynku doustnych środków kontrastowych oraz protokołu testowego krok po kroku, który pozwala na ilościowe określenie fizjologii połykania. Wyeliminowanie jednego lub więcej z tych składników będzie miało szkodliwy wpływ na wyniki badania. Co więcej, poziom energii systemu fluoroskopowego określi, które parametry połykania mogą być badane. Większość ośrodków badawczych posiada fluoroskopy o wysokiej energii przeznaczone do użytku z ludźmi i większymi zwierzętami, co skutkuje wyjątkowo niską jakością obrazu podczas testowania myszy i innych małych gryzoni. Pomimo tego ograniczenia zidentyfikowaliśmy siedem parametrów VFSS, które są konsekwentnie kwantyfikowalne u myszy przy użyciu fluoroskopu o wysokiej energii w połączeniu z nowym mysim protokołem VFSS. Niedawno otrzymaliśmy niskoenergetyczny system fluoroskopii o wyjątkowo wysokiej rozdzielczości obrazowania i możliwościach powiększenia, który został zaprojektowany do użytku z myszami i innymi małymi gryzoniami. Wstępne prace z wykorzystaniem tego nowego systemu, w połączeniu z nowym mysim protokołem VFSS, zidentyfikowały 13 parametrów jaskółki, które są konsekwentnie kwantyfikowalne u myszy, co stanowi prawie dwukrotnie większą liczbę niż uzyskano przy użyciu konwencjonalnych (tj. wysokoenergetycznych) fluoroskopów. Identyfikacja dodatkowych parametrów jaskółki jest oczekiwana w miarę optymalizacji możliwości tego nowego systemu. Dotychczasowe wyniki wskazują na użyteczność stosowania systemu fluoroskopowego o niskiej energii do wykrywania i ilościowego określania subtelnych zmian w fizjologii jaskółki, które w przeciwnym razie mogłyby zostać przeoczone podczas korzystania z fluoroskopów o wysokiej energii do badania modeli chorób myszy.

Wprowadzenie

Dysfagia (upośledzenie połykania) jest częstym objawem wielu schorzeń dotykających ludzi w każdym wieku. Przykłady obejmują udar, chorobę Parkinsona, chorobę Alzheimera, porażenie mózgowe, dystrofię mięśniową, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), chorobę Battena, raka głowy i szyi, przedwczesny poród i zaawansowane starzenie się. Dysfagia jest silnie skorelowana ze śmiertelnością, zazwyczaj w wyniku ciężkiego niedożywienia lub zapalenia płuc, które rozwija się, gdy do płuc zasysany jest obciążony bakteriami pokarm/płyn/ślina^1-4. Ten wyniszczający i zagrażający życiu stan chorobowy dotyka ponad 15 milionów ludzi każdego roku w samych Stanach Zjednoczonych³. Pomimo wysokiego rozpowszechnienia i związanych z tym negatywnych skutków, obecne opcje leczenia dysfagii ograniczają się do podejść paliatywnych (a nie leczniczych), takich jak modyfikacja diety (np. unikanie określonych konsystencji pokarmów/płynów), zmiany postawy (np. podwijanie podbródka podczas połykania), podejścia motoryczne (np. ćwiczenia ukierunkowane na mięśnie jamy ustnej, gardła i krtani), podejścia sensoryczne (np. wdrażanie stymulacji smakowej, temperatury i/lub mechanicznej) oraz karmienie przez zgłębnik (np. odżywianie i nawodnienie podawane przez zgłębnik nosowo-żołądkowy (NG) lub przezskórną endoskopową gastrostomię (PEG)). Terapie te służą jedynie jako terapia objawowa, a nie są ukierunkowane na podstawowe przyczyny problemu. Rzeczywiście, główną przeszkodą w odkrywaniu nowych, skutecznych metod leczenia dysfagii jest ograniczona wiedza naukowa na temat odpowiedzialnych za nią mechanizmów patologicznych, które prawdopodobnie są różne dla każdej choroby.

Diagnoza dysfagii jest głównie dokonywana za pomocą procedury radiograficznej zwanej wideofluoroskopowym badaniem połykania (VFSS), znanym również jako zmodyfikowane badanie połykania baru. W ciągu ostatnich ponad 30 lat ten test diagnostyczny został uznany za złoty standard w ocenie funkcji połykania^5-7. Test ten polega na tym, że pacjent siedzi lub stoi w obrębie wiązki promieniowania rentgenowskiego urządzenia do fluoroskopii, dobrowolnie spożywając pokarmy i płyny zmieszane z doustnym środkiem kontrastowym, zwykle siarczanem baru^8,9 lub joheksolem¹⁰. Gdy pacjent połyka, pokarm i płyn zawierający środek kontrastowy mogą być widoczne w czasie rzeczywistym na monitorze komputerowym podczas podróży z ust do żołądka. Struktury tkanek miękkich są również widoczne i można je ocenić w odniesieniu do struktury i funkcji. Pacjenci są proszeni o wykonanie kilku połknięć każdego pokarmu i konsystencji płynu, z których wszystkie są nagrywane na wideo w celu późniejszego oglądania i analizy klatka po klatce w celu ilościowego określenia obecności i stopnia dysfagii. Zazwyczaj analizowane są liczne fizjologiczne składniki połykania, takie jak anatomiczny punkt spustowy połykania gardłowego, czas przejścia bolusa przez gardło i przełyk, zakres i czas trwania uniesienia krtani, lokalizacja i ilość pozostałości po połknięciu oraz występowanie i fizjologiczna przyczyna aspiracji^7,11.

Aspekty ludzkiego protokołu VFSS zostały niedawno dostosowane do badania swobodnie zachowujących się szczurów; jednak wyniki były ograniczone, ponieważ szczury nie pozostawały w polu widzenia wideofluoroskopowego podczas testowania¹². VFSS nie był wcześniej próbowany na myszach. Udana adaptacja ludzkiego protokołu VFSS do użytku z myszami i szczurami dostarczyłaby nowej metody badawczej do zbadania setek obecnie istniejących mysich (mysich i szczurzych) modeli chorób, o których wiadomo, że powodują dysfagię u ludzi. Ta nowa metoda (odtąd nazywana mysim VFSS) przyspieszyłaby zatem identyfikację i walidację mysich modeli dysfagii, które są odpowiednie do badania podstawowych mechanizmów neurofizjologicznych w mięśniach, nerwach i tkance mózgowej, które są patologiczne i przyczyniają się do dysfagii u ludzi. Co więcej, mysi VFSS pozwoliłby na identyfikację obiektywnych miar (biomarkerów) funkcji/dysfunkcji połykania, które można by bezpośrednio porównać z ludźmi. Te międzygatunkowe biomarkery wideofluoroskopowe mogą następnie służyć jako nowe miary wyników do ilościowego określania skuteczności leczenia w badaniach przedklinicznych na myszach i szczurach, co lepiej przełożyłoby się na badania kliniczne z udziałem ludzi.

W tym celu ustanowiono mysi protokół VFSS przy użyciu ~100 myszy obu płci. Wszystkie myszy były albo szczepami C57, albo hybrydowymi szczepami C57/SJL. Myszy C57 nie były genetycznie zmienione, podczas gdy C57 / SJL był szczepem tła dla kolonii transgenicznych myszy SOD1-G93A (lub SOD1), najczęściej stosowanego modelu zwierzęcego ALS. Kolonia SOD1 była w przybliżeniu mieszanką 50-50 myszy transgenicznych (tj. dotkniętych ALS) i nietransgenicznych (tj. niedotkniętych chorobą) rodzeństwa z miotu.

Mysi protokół VFSS składa się z trzech komponentów:

1. specjalnie zaprojektowane komory obserwacyjne, które umożliwiają dobrowolne karmienie i połykanie w pozycji stojącej bez skrępowania w zamkniętej przestrzeni wewnątrz urządzenia do fluoroskopii,
2. receptury, które maskują awersyjny smak/zapach doustnych środków kontrastowych i wytwarzają wystarczającą gęstość promieniowania, aby umożliwić odpowiednią wizualizację połykania,
3. Protokół testowy krok po kroku, który maksymalizuje przestrzeganie zaleceń przez zwierzęta, minimalizuje całkowity czas badania i narażenie na promieniowanie oraz umożliwia ilościowe określenie kilku parametrów połykania dla każdego etapu połykania (tj. ustnego, gardłowego i przełyku).

Połączony efekt tworzy komfortowe, mało stresujące, samodzielne środowisko do badania, które pozwala na ocenę typowych zachowań myszy podczas karmienia i połykania.

Protokół

Protokół VFSS u myszy jest zgodny z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) oraz wytycznymi NIH.

1. Konstrukcja komór obserwacyjnych z rurek i arkuszy poliwęglanowych (Rysunek 1)

1. Za pomocą ręcznej frezarki potnij kwadratowe rurki z poliwęglanu o szerokości 5 cm (grubość ścianek ~2 mm) na odcinki o długości 16 cm. Większość myszy mieści się w tych wymiarach, co pozwala na stworzenie wąskiej komory testowej, która umożliwia chodzenie i odwracanie się zgodnie z potrzebami. Grubość ścianki ~2 mm zapewnia odpowiednią sztywność, nie osłabiając znacząco wiązki promieni rentgenowskich.
   1. W tym protokole niezbędne są dwa typy komór: „rurki z dzióbkiem”, przeznaczone do podawania płynów za pomocą dzióbka, oraz „rurki wentylacyjne”, przeznaczone do podawania płynów za pomocą miseczki z trzpieniem.
      1. W przypadku „rurek z dzióbkiem” wykonaj za pomocą ręcznej frezarki mały podłużny otwór (12 x 8 mm) w górnej części każdej rurki, blisko jednego z końców. Otwór ten służy do podawania roztworów do picia przez dzióbek rurki do pojenia podczas warunkowania behawioralnego i testów VFSS.
      2. W przypadku „rurek wentylacyjnych” wywierć 9 małych otworów wentylacyjnych w górnej części każdej rurki, blisko jednego z końców. Rurka ta jest używana podczas testów VFSS z wykorzystaniem miseczki z trzpieniem zamiast rurki do pojenia.
      3. Można używać rurek z dzióbkiem podczas podawania płynu za pomocą miseczki z trzpieniem; jednak otwór w suficie komory musi zostać zablokowany, aby zapobiec rozpraszającym zachowaniom eksploracyjnym myszy (patrz krok 6.2.2).
2. Za pomocą komputerowej frezarki, zwanej również maszyną CNC (computerized numerical control), potnij arkusze poliwęglanu (grubość 3/4”) na zaślepki końcowe (50 x 50 mm, 2 na rurkę).
   1. Wykutuj jeden podłużny rowek (19 x 6 mm) w pobliżu jednej krawędzi wewnętrznej strony każdej zaślepki. Rowek ten służy do zamocowania miseczki z trzpieniem, z której myszy piją podczas testów VFSS.
   2. Wykutuj 5 okrągłych otworów wentylacyjnych (średnica 6 mm) w każdej zaślepce.
   3. Wykutuj jeden mniejszy otwór okrągły (średnica 5 mm) w zaślepce, bezpośrednio nad podłużnym rowkiem. Otwór ten służy do podawania płynu do miseczki z trzpieniem podczas testów VFSS.
   4. Na zewnętrznej stronie zaślepki wykonaj otwór z zatwornikiem o średnicy 9/16” i głębokości 1/4” wokół tego mniejszego otworu.
   5. Frezuj 2 mm wzdłuż obwodu wewnętrznej strony zaślepki na głębokość 7 mm, aby utworzyć stopień, który łatwo wsunie się w koniec rurki.
   6. Wykutuj rowek o szerokości 1 mm w stopniu zaślepki, aby pomieścić o-ring, który jest niezbędny, aby zapobiec wypadnięciu zaślepki z końca rurki.
   7. Wygładź wystające krawędzie i sfazuj wszystkie narożniki zaślepek, aby zapobiec ich przegryzaniu przez myszy.
3. Wykonaj miseczki z trzpieniem z arkuszy poliwęglanu za pomocą maszyny CNC. Wymiary całkowite powinny wynosić 24 x 19 x 6 mm³, z wgłębieniem w kształcie miseczki o wymiarach 10 x 3 mm² na jednym końcu. Jedna miseczka z trzpieniem jest potrzebna dla każdej rurki. Miseczki z trzpieniem powinny ciasno wsuwać się w podłużny rowek w zaślepkach końcowych (Rysunek 2).

Rysunek 1: Komory obserwacyjne. Komory obserwacyjne zostały zaprojektowane w celu utrzymania swobodnie zachowujących się zwierząt w polu widzenia fluoroskopu. Na zdjęciach przedstawiono elementy komory niezbędne do przeprowadzenia VFSS. Góra: „rurka z dzióbkiem”, przeznaczona do podawania płynów za pomocą dzióbka. Dół: „rurka wentylacyjna”, przeznaczona do podawania płynów za pomocą miseczki z kołkiem. Dwie nakrętki są zamienne pomiędzy rurką z dzióbkiem a rurką wentylacyjną.

Figura 2: Miseczki z kołkami. Każda miseczka z kołkiem zatrzaskuje się w rowku na wewnętrznej powierzchni każdej zaślepki. Po lewej: niezespołowane komponenty. W środku: zespołowane komponenty. Po prawej: zewnętrzna powierzchnia zaślepki. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej figury.

2. Konstrukcja butelek z rurką do siorbania z probówek do wirowania, silikonowych korków i metalnych wlewów (Rycina 3)

1. Użyć świdra do korków (5/16”), aby wykonać otwór centralny w każdym silikonowym korku.
2. Nanieść kilka kropli oleju mineralnego do otworu i ręcznie włożyć metalny wlew w szeroki koniec korka. Preferowane są proste wlewy z kulistym zakończeniem, ponieważ proste wlewy z otwartym końcem powodują nadmierne wycieki i rozbryzgi środka kontrastowego w komorze obserwacyjnej, co może utrudniać wizualizację podczas testów.
3. Dostosować długość wlewu tak, aby obejmował całą długość silikonowego korka i wystawał około 3 cm poza jego szeroki koniec.
4. Włożyć wąski koniec każdego korka (zawierający rurkę ssącą) do probówki do wirówek o pojemności 30 ml.
5. Zweryfikować, czy długość wlewu jest odpowiednia, wkładając go przez podłużny otwór w górnej części komory obserwacyjnej. Końcówka wlewu powinna znajdować się około 1 cm od sufitu komory, co jest wystarczającą długością, aby zdrowe dorosłe myszy mogły do niej dotrzeć.
   UWAGA: Zbyt duża długość powoduje, że myszy piją, obracając lub przechylając głowę, co utrudnia wizualizację połykania podczas VFSS.
6. Wydłużyć wlew, aby dostosować go do młodszych myszy, szczepów myszy o mniejszych rozmiarach oraz modeli chorobowych myszy, które nie mogą dosięgnąć wlewu z powodu zaburzeń motorycznych kończyn.
7. Umyć nowo przygotowane wlewy przed użyciem, aby usunąć olej mineralny, resztki silikonu i inne zanieczyszczenia powstałe podczas przygotowania.

Rycina 3: Butelki z rurkami z pijakiem.Lewo: niezespołowane elementy. Środek: zespołowane elementy. Prawo: mysz pijąca z rurki z pijakiem w komorze obserwacyjnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Budowa systemu dostarczania strzykawkowego do użytku z miseczkami z kołkami (Rysunek 4)

1. Użyj tokarki do wykonania adapterów łączących rurki z polietylenu (PE) z zaślepkami komory obserwacyjnej, zgodnie z poniższym opisem.
   1. Potnij pręt z żywicy acetalowej o średnicy 1/2” na odcinki o długości 1 1/4”, nazywane w dalszej części adapterami rurek (lub adapterami).
   2. Na jednym końcu każdego adaptera zredukuj średnicę odcinka o długości 1/2” na końcówce do 3/16”; jest to tzw. wąski koniec.
   3. Na pozostałym odcinku o długości 3/4” każdego adaptera (t.j. końcu o średnicy 1/2”) wykonaj nacięcia umożliwiające ręczne chwytanie podczas użytkowania. Odcinek ten nazywany jest szerokim końcem.
   4. W szerokim końcu każdego adaptera wywierć centralny otwór o średnicy 0,098” i głębokości 1”.
   5. Wywierć i rozwierć pozostałą część otworu centralnego w każdym adapterze do średnicy 0,096”, aby zapewnić ciasne dopasowanie do rurek PE. 
2. Utnij rurkę PE (PE 240, średnica wewnętrzna 1,67 mm) na pożądaną długość za pomocą nożyczek. Odcinek o długości 3-4 stóp wystarczająco zwiększa odległość między badaczem a fluoroskopem podczas testów VFSS, co poprawia bezpieczeństwo radiacyjne.
   UWAGA: Dłuższe odcinki rurek będą wymagały większej objętości roztworu środka kontrastowego podczas testów VFSS, być może więcej niż standardowa receptura 30 ml.
3. Wsuń całkowicie igłę 15 G z tępą końcówką do jednego końca rurki PE. Połączenie powinno być ciasne.
4. Wsuń drugi (wolny) koniec rurki PE przez otwór centralny adaptera, zaczynając od szerokiego końca.
5. Wysuń rurkę PE z wąskiego końca adaptera tak, aby wystawała około 2 mm.
6. Włóż wąski koniec adaptera (z wystającą ok. 2 mm rurką PE) do zaślepki rury obserwacyjnej; powinien on ciasno pasować do otworu z faząLocated bezpośrednio nad miseczką z kołkiem (peg-bowl).
7. Dostosuj długość rurki PE na wąskim końcu adaptera tak, aby ledwo wystawała ponad wgłębienie miseczki w miseczce z kołkiem.
8. Napełnij strzykawkę 10 ml (bez igły) wodą z zlewki i usuń pęcherzyki powietrza.
9. Podłącz napełnioną strzykawkę do końcówki rurki PE z igłą.
10. Powoli naciskaj tłok strzykawki, aby wprowadzić wodę do miseczki z kołkiem w komorze obserwacyjnej. Przestań, gdy miseczka będzie prawie pełna. Unikaj przepełnienia, co mogłoby spowodować rozchlapywanie podczas picia.
11. Jeśli miseczka z kołkiem nie napełnia się prawidłowo, dostosuj długość rurki PE wystającej nad miseczką.
12. Zbyt długie wysunięcie rurki PE może skłonić myszy do gryzienia jej podczas testów zamiast picia z miseczki.
13. Jeśli rurka PE nie jest wystawiona wystarczająco daleko, ciecz będzie spływać na dno komory obserwacyjnej zamiast napełniać miseczkę.
14. Po użyciu odłącz strzykawkę i umyj cały system dozujący mydłem i wodą. Użyj strzykawki 10 ml, aby przepchnąć powietrze przez rurkę PE w celu usunięcia wody. W razie potrzeby wysterylizuj w autoklawie.

Figura 4: System podawania za pomocą strzykawki. Lewo: niezespołowane elementy. Środek: zespół elementów. Prawo: mysz pijąca z miseczki na kołku w komorze obserwacyjnej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

4. Budowa zmotoryzowanego stołu nożycowego do zdalnego pozycjonowania komory obserwacyjnej (Rysunek 5)

1. Zbuduj podnośnik nożycowy z platformą o wymiarach 12 x 12 cm, która może być podnoszona i obniżana o 5 cm, aby umożliwić obserwację myszy w różnych pozycjach w polu widzenia fluoroskopii. Materiał podnośnika powinien być metalowy lub plastikowy, aby ułatwić czyszczenie środkami dezynfekującymi.
2. Zamontuj silniki krokowe do regulacji wysokości i pozycji podłużnej podnośnika.
3. Połącz pierwszy silnik krokowy z mechanizmem podnośnika nożycowego, aby kontrolować wysokość poprzez przesuwanie poprzeczki. Połączenie to może zostać zrealizowane za pomocą śruby pociągowej lub przekładni zębowej.
4. Połącz drugi silnik krokowy z ramą podnośnika nożycowego, aby kontrolować pozycję podłużną poprzez przesuwanie całej ramy podnośnika względem stołu. Połączenie to może zostać zrealizowane za pomocą śruby pociągowej lub przekładni zębowej.
5. Podłącz system zdalnego sterowania do silników krokowych, aby umożliwić regulację pozycji komory obserwacyjnej podczas obrazowania, minimalizując tym samym ekspozycję badacza na promieniowanie.
6. Zintegruj przyciski ręcznego pilota z układem mikrokontrolera w celu sterowania aktywacją i kierunkiem pracy każdego silnika krokowego.

Rycina 5: Zdalnie sterowany nożycowy stół windowany. Po lewej: widok boczny nożycowego stołu windowanego. Po prawej: stół windowany z komorą obserwacyjną umieszczoną w fluoroskopie. Stół windowany reguluje pozycję komory obserwacyjnej, aby utrzymać myszy w polu widzenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Przeprowadź warunkowanie behawioralne przed badaniem VFSS, aby zapewnić maksymalny poziom współpracy

1. Na 1-2 tygodnie przed badaniem VFSS poddać myszy jednorazowemu, nocnemu (12-16 h) okresowi regulacji dostępu do wody w celu wywołania pragnienia, podczas którego woda jest usuwana z klatki domowej. Celem regulacji wody jest wywołanie pragnienia u zwierząt, a nie ich odwodnienie. Zwierzęta powinny pozostać czujne i reagować na bodźce. Taki czas trwania i ramy czasowe są niezbędne, aby zapobiec odwodnieniu, które może wystąpić w wyniku dwóch epizodów regulacji wody w ciągu jednego tygodnia (tj. jednego dla warunkowania behawioralnego i drugiego dla badania VFSS).
2. Umieścić pojedynczą „rurkę-dyszę” (z jednym końcem zamkniętym zaślepką) na dnie klatki domowej zawierającej świeżą ściółkę. Zamknięty koniec powinien znajdować się najbliżej otworu dyszy w suficie komory. Ten krok zapewnia odpowiednią wentylację, podczas gdy wiele myszy śpi stłoczone wewnątrz komory przez noc. Otwarty koniec umożliwia myszom swobodne wchodzenie i wychodzenie z komory.
3. Usunąć inne materiały wzbogacające środowisko (np. materiał gniazdowy i budkę), aby zachęcić myszy do eksploracji i spania w komorze przez noc (Rysunek 6). Ten krok zapewnia, że myszy są przyzwyczajone do przebywania w komorze przez dłuższy czas przed badaniem VFSS.
4. Umieścić na dnie klatki po jednym standardowym granulacie pokarmowym na mysz do spożycia w nocy; nie dostarczać wody ani innych źródeł nawadniania.
5. Użyć standardnej pokrywy filtracyjnej, aby zatrzymać myszy w klatce na noc, ponieważ wymiary komory obserwacyjnej uniemożliwiają dopasowanie standardowej metalowej kratki. Usuniętą kratkę (z pojemnikiem na pokarm i butelką z wodą) położyć na wierzchu pokrywy filtracyjnej, aby ją dociążyć i zapobiec ucieczce myszy.
6. Następnego ranka przeprowadzić badanie smakowości zgodnie z poniższym opisem.
   1. Przygotować roztwór testowy o smaku czekoladowym w butelce z rurką do picia o pojemności 30 ml, bez dodawania środka kontrastowego (tj. zastąpić ioheksol wodą). Przepis znajduje się w Tabeli 1. Przygotować jedną butelkę na każdą testowaną klatkę.
   2. Usunąć komorę obserwacyjną i zastąpić ją standardową metalową kratką. Podać roztwór o smaku czekoladowym (temperatura pokojowa, ~22 °C) przez 2 min na klatkę, wprowadzając butelkę przez kratkę.
   3. Ocenić smakowość, obserwując zachowania podczas picia w trakcie 2-minutowego okresu testowego.
   4. Ocenić smakowość według następujących kryteriów:
      1. Czas utajenia do momentu, gdy pierwsza mysz pije z dyszy przez co najmniej 5 s bez przerwy.
      2. Procent myszy w klatce, które piją roztwór.
      3. Liczba myszy pijących jednocześnie z dyszy.
   5. Roztwór uznaje się za smakowy, jeśli większość myszy w każdej klatce wykazuje wielokrotne, długie (>5 s) serie picia oraz jeśli wiele myszy pije jednocześnie z dyszy (Rysunek 7).
   6. Jeśli roztwór o smaku czekoladowym nie jest smakowy, powtórzyć badanie smakowości z innymi wzmacniaczami smaku w różnych stężeniach, aby zidentyfikować jeden preferowany roztwór.
   7. Zaoferować do czterech różnych roztworów (w różnych stężeniach) pojedynczo, w randomizowanej kolejności, wielu klatkom myszy w ciągu jednego dnia testowego, bez okresu wypłukiwania lub roztworu wypłukującego. Odpowiednie wzmacniacze smaku do rozważenia dla myszy to cukier, ser, masło orzechowe, różne smaki owocowe i orzechowe oraz mleko.
      UWAGA: Nie przeprowadzać badania smakowości częściej niż raz w tygodniu, aby zapobiec odwodnieniu wynikającemu z powtarzających się epizodów regulacji wody.
   8. Identyfikacja preferowanego roztworu dla każdej linii myszy może zająć kilka tygodni. Celem jest znalezienie smaków kandydackich, które wywołują u myszy wielokrotne długie (>5 s) serie picia natychmiast (<30 s) po udostępnieniu, ponieważ kwalifikacje te uznaje się za niezbędne do uzyskania pomyślnych wyników VFSS.
7. Po zidentyfikowaniu preferowanego roztworu smakowego ponownie umieścić komorę obserwacyjną w każdej klatce domowej, aby kontynuować warunkowanie behawioralne zgodnie z poniższym opisem.
   1. Przymocować zaślepkę do komory obserwacyjnej po stronie najbliższej owalnego otworu (dyszy).
   2. Udostępnić myszom roztwór o smaku czekoladowym na 2-3 h, wprowadzając butelkę z rurką do picia przez owalny otwór w górnej części komory. Ten krok zapewnia, że wszystkie myszy zostały przyzwyczajone do picia w głębi komory obserwacyjnej.
   3. Usunąć metalową kratkę, aby zmieścić komorę obserwacyjną.
   4. Umieścić 1 granulat pokarmowy na mysz na dnie klatki do spożycia ad libitum podczas okresu testowego.
   5. Przykryć klatkę standardową pokrywą filtracyjną, aby zapobiec ucieczce myszy przez pozostałą część okresu warunkowania behawioralnego. Usuniętą metalową kratkę (z pojemnikiem na pokarm i butelką z wodą) położyć na wierzchu pokrywy filtracyjnej, aby ją dociążyć.
8. Po zakończeniu warunkowania behawioralnego zapewnić wodę i pokarm ad libitum w klatce domowej.
9. Umyć komory obserwacyjne (rurki i zaślepki) oraz butelki z rurkami do picia (dysze i probówki wirówkowe) wodą z mydłem; w razie potrzeby wysterylizować w autoklawie. Unikać używania acetonu do czyszczenia rurek, ponieważ powoduje on trwałe zmętnienie, w wyniku którego rurka staje się nieprzejrzysta zamiast półprzezroczystej.

Rysunek 6: Myszy eksplorujące komory obserwacyjne. Myszy naturalnie dążą do szukania schronienia w małych przestrzeniach. W rezultacie swobodnie wchodzą do rurki obserwacyjnej i ją eksplorują, gdy zostanie ona umieszczona w klatce domowej. Większość myszy znajduje się śpiących w komorze rano. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

SKŁADNIKI	Roztwór czekoladowy (do badań smakowych)	Iohexol o smaku czekoladowym (do badań VFSS)
Syrop czekoladowy	3 ml	3 ml
Iohexol (350 mg jodu/ml)	0 ml	15 ml
Woda (dejonizowana lub filtrowana)	Dopełnić do objętości końcowej 30 ml (27 ml)	Dopełnić do objętości końcowej 30 ml (12 ml)
Objętość końcowa	30 ml	30 ml

Tabela 1: Preferowany przez szczepy myszy C57 i C57/SJL roztwór testowy o smaku czekolady.

Rysunek 7: Badanie smakowitości. Jednym z wskaźników preferencji smakowych podczas badania smakowitości jest liczba myszy jednocześnie pijących z jednego poidełka w klatce domowej. Na zdjęciu widoczne są cztery myszy jednocześnie pijące roztwór o smaku czekoladowym, który został zidentyfikowany jako preferowany wzmacniacz smaku przez szczepy C57 oraz C57/SJL.

6. Przygotowanie do badania VFSS

1. Poddać myszy nocnemu okresowi regulacji poziomu wody (t.j. wstrzymać podawanie wody przez 12-16 hr), zgodnie z opisem w Kroku 5 powyżej.
   1. Umieścić pojedynczą „rurkę wentylacyjną” (z jednym końcem zamkniętym zaślepką) na dnie klatki domowej zawierającej świeżą ściółkę. Zamknięty koniec powinien znajdować się najbliżej otworów wentylacyjnych w suficie komory. Krok ten zapewnia odpowiednią wentylację podczas gdy wiele myszy śpi stłoczonych wewnątrz komory przez noc. Otwarty koniec umożliwia myszom swobodne wchodzenie i wychodzenie z komory.
2. Następnego ranka wyjąć zabrudzone komory obserwacyjne z klatek, krótko opłukać wodą z kranu i całkowicie osuszyć w celu przygotowania do testów VFSS.
   1. Wyjmować i czyścić tylko jedną komorę naraz, aby zapobiec pomyleniu komór między klatkami, co może wywołać nadmierne zachowania eksploracyjne znacząco zakłócające testy VFSS.
   2. Jeśli do testów VFSS zamiast „rurek wentylacyjnych” stosowane są „rurki z dzióbkiem”, włożyć silikonową zatyczkę do otworu dzióbka w suficie komory obserwacyjnej, aby zapobiec zachowaniom eksploracyjnym (Rysunek 8).
   3. Oznaczyć każdą komorę (np. numerem klatki domowej), aby zapobiec pomyłkom.
      UWAGA: Do oznaczenia każdej wyczyszczonej rurki przed umieszczeniem jej z powrotem w klatce domowej należy użyć pisaka suchościeralnego. Należy unikać pisaków permanentnych, ponieważ są one wchłaniane przez materiał rurki i nie dają się zmyć, nawet za pomocą alkoholu lub acetonu.
3. Przygotować roztwór ioheksolu o smaku czekoladowym (lub inny smakowy roztwór).
   1. Przygotować jedną porcję (30 ml) roztworu testowego (Tabela 1) dla kilku klatek.
   2. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE IOHEXOLU: Nieotwarte butelki z ioheksolem przechowywać w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Otwarte butelki z ioheksolem należy zużyć w ciągu 24 hr, ponieważ lepkość i smak mogą ulec zmianie w ciągu dnia lub dwóch po kontakcie z powietrzem. Alternatywnie można zamrozić alikwoty w pojedynczych porcjach (15 ml) w probówkach do wirowania w celu długoterminowego przechowywania. Przygotowane roztwory testowe ioheksolu muszą zostać użyte w ciągu kilku godzin, aby zapewnić ich świeżość i zapobiec unikaniu ich przez myszy. Roztwory ioheksolu podawać w temperaturze pokojowej, aby uniknąć zakłóceń w badaniu wynikających z wpływu temperatury na funkcję połykania. Nie zamrażać pozostałego przygotowanego roztworu testowego, ponieważ smak czekolady po zamrożeniu staje się gorzki, co prowadzi do unikania go przez myszy.
4. Przygotować środowisko do fluoroskopii.
   1. Użyć zapasowej (pustej) komory obserwacyjnej i miseczki z kołkiem (lub dzióbka rurki do picia), aby określić optymalną wysokość i pozycję w wiązce fluoroskopu, która umożliwia wizualizację picia w płaszczyźnie bocznej (poziomej).
   2. Ustawić częstotliwość klatek fluoroskopii na 30 klatek na sekundę; jeśli są dostępne, można zastosować wyższe (ale nie niższe) częstotliwości klatek.
   3. Upewnić się, że radioprzepuszczalny marker kalibracyjny jest odpowiednio umieszczony na kamerze/detektorze fluoroskopu, tak aby był widoczny na monitorze wyświetlacza przez cały czas trwania testu. Krok ten jest niezbędny do kalibracji pomiarów długości wykorzystywanych do ilościowego określania parametrów połykania.

Rysunek 8: Silikonowy korek przy użyciu miseczek z prętem (peg-bowls). Po lewej: silikonowy korek. Po prawej: Silikonowy korek jest przeciągany przez otwór rurki ssącej w górnej części komory obserwacyjnej. Korek ten zapobiega rozpraszaniu uwagi myszy przez otwór dzióbka podczas stosowania miseczki z prętem zamiast rurki ssącej w trakcie badania VFSS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

7. Badanie VFSS u myszy

1. Obserwuj każdą klatkę, aby zidentyfikować moment, w którym mysz dobrowolnie wejdzie do komory obserwacyjnej.
   1. Wyjmij komorę z klatki i ostrożnie przymocuj 2^nd zaślepkę końcową (z przymocowaną miseczką-kołkiem, jeśli nie jest używana rurka do picia), uważając, aby nie przyciąć myszy (szczególnie ogona).
      UWAGA: Takie podejście minimalizuje reakcję stresową myszy wynikającą z manipulacji, co jest szczególnie istotne w przypadku myszy testowanych po raz pierwszy.
   2. Przy powtarzalnych testach myszy można łatwiej zachęcić do wejścia do komory, gdy zostanie ona umieszczona przed nimi wewnątrz klatki lub gdy zostaną one zawieszone za ogon nad otworem komory.
2. Umieść komorę obserwacyjną (zawierającą mysz) w urządzeniu do fluoroskopii, aby rozpocząć badanie VFSS w płaszczyźnie bocznej (t.j. pozioma wiązka promieni rentgenowskich).
3. Podaj roztwór ioheksolu o smaku czekoladowym (Tabela 1) za pomocą miseczki-kołka lub butelki z rurką do picia.
   1. W przypadku użycia miseczki-kołka, podaj roztwór za pomocą systemu dozującego ze strzykawką opisanego w Kroku 3 powyżej. System ten umożliwia szybkie i łatwe uzupełnianie miseczki w razie potrzeby.
   2. W przypadku użycia butelki z rurką do picia, wprowadź rurkę przez owalny otwór w górnej części komory obserwacyjnej. Przechyl butelkę tak, aby wylewka była skierowana w stronę środka komory.
4. Rozpocznij rejestrację wideofluoroskopową w momencie, gdy mysz zacznie pić.
   1. Dostosuj położenie komory obserwacyjnej (używając zdalnie sterowanego nożycowego stołu podnośnika opisanego w Kroku 4), tak aby mechanizm połykania był widoczny w polu widzenia.
   2. Wstrzymuj rejestrację za każdym razem, gdy mysz odwraca się od miseczki-kołka lub wylewki, aby zminimalizować czas ekspozycji na promieniowanie.
   3. Wznów rejestrację, gdy mysz powróci do wylewki lub miseczki-kołka.
   4. Uzupełniaj miseczkę-kołek w razie potrzeby.
   5. Przerwij testy, jeśli mysz nie zacznie pić w ciągu 5 min. Celem jest zarejestrowanie kilku długich (>5 s) okresów ciągłego picia, co jest typowe dla większości myszy w ciągu pierwszych 2 min testów.
   6. Myszy niepoddające się badaniu zwróć do klatki domowej (bez wody) w celu ponownego przetestowania w późniejszym czasie tego samego dnia; okres regulacji dostępu do wody nie może przekroczyć 24 h. Myszy, które nie będą współpracować przez trzy próby, zostają usunięte z badania.
5. W razie potrzeby zmień położenie fluoroskopu, aby przebadać myszy w płaszczyźnie grzbietowo-brzusznej (t.j. pionowa wiązka promieni rentgenowskich). Płaszczyzna ta służy do identyfikacji odchyleń w przepływie bolusa przez gardło i przełyk podczas połykania.
6. Podczas badania wielu myszy z tej samej klatki domowej:
   1. Przecieraj miseczkę-kołek (oraz końcówkę rurki PE) lub wylewkę rurki do picia suchym ręcznikiem papierowym pomiędzy myszami.
   2. W razie potrzeby czyść komorę obserwacyjną pomiędzy myszami, aby usunąć wszelkie odpryski ioheksolu ze ścianek komory. Przepłucz komorę wodą z kranu i osusz ręcznikiem papierowym.
7. Podczas badania myszy z różnych klatek domowych:
   1. Użyj nowej miseczki-kołka (lub wymień wylewkę rurki do picia). W przeciwnym razie myszy mogą być rozproszone zapachem innych myszy, które piły z tej samej miseczki lub rurki. Miseczki-kołki i rurki do picia powinny być oznakowane, aby uniknąć pomyłek.
8. Po zakończeniu badań wszystkich myszy w jednej klatce, zapewnij im wodę i pokarm w klatce domowej.
9. Umyj komory obserwacyjne (rurki i zaślepki końcowe), miseczki-kołki, system dozujący ze strzykawką oraz butelki z rurkami do picia (wylewki i probówki do wirówek, jeśli były używane) wodą z mydłem; w razie potrzeby wysterylizuj w autoklawie.
10. Zutylizuj pozostały roztwór ioheksolu zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa; w większości placówek dopuszczalne jest odprowadzenie do kanalizacji.

8. Analiza wideo

1. Należy użyć oprogramowania do edycji wideo umożliwiającego analizę klatka po klatce nagrań wideofluoroskopii w celu ilościowego określenia interesujących parametrów połykania (Tabela 2).
2. Należy wyznaczyć co najmniej dwóch przeszkolonych recenzentów do analizy każdego filmu w sposób zaślepiony: głównego recenzenta oraz jednego lub dwóch recenzentów pomocniczych.
   1. Główny recenzent: Przegląda każdy film w celu zidentyfikowania i analizy 3–5 długich (około 5 s) serii picia. Kryterium to opiera się na opublikowanych nieradiograficznych badaniach połykania u myszy^13,14 oraz badaniach VFSS u szczurów¹², wykazujących, że 3–5 pomiarów na parametr połykania jest wystarczających do analiz statystycznych.
   2. Recenzenci pomocniczy: Niezależnie analizują 3–5 pomiarów na parametr połykania dla każdej myszy, które zostały wstępnie zidentyfikowane i przeanalizowane przez głównego recenzenta.
3. Należy zidentyfikować rozbieżności w ocenach recenzentów dla każdej myszy. Wszystkie rozbieżności należy przeanalizować ponownie w grupie recenzentów, aby osiągnąć 100% konsensusu.
4. Należy obliczyć średnią z 3–5 uzgodnionych (tzn. bezspornych) wartości dla każdego parametru połykania, aby uzyskać wartość średnią dla każdej myszy do wykorzystania w analizach statystycznych. W przypadku uzyskania mniej niż 3 pomiarów dla pojedynczego parametru połykania dla danej myszy, w statystycznej bazie danych dla odpowiedniego parametru połykania należy wprowadzić wartość brakującą (tzn. nie zero).

PARAMETRY POŁYKANIA	OPIS
Odstęp między połykami (ISI)	Liczba klatek wideo pomiędzy dwoma kolejnymi, nieprzerwanymi przełykami. Klatką początkową dla obliczenia ISI jest „klatka spoczynkowa” bezpośrednio poprzedzająca widoczny transport kęsa z zatok gardłowych do przełyku. Klatką końcową jest „klatka spoczynkowa” następnego przełyku. Liczbę klatek pomiędzy dwoma kolejnymi przełykami dzieli się następnie przez 30 klatek na sekundę (fps), aby przeliczyć ją na czas (sekundy).
Szybkość wysuwania żuchwy (równoważnik częstotliwości lizania)	Podczas badania VFSS język nie jest wyraźnie widoczny, co uniemożliwia ilościowe określenie częstości lizania; jednakże częstość ruchów żuchwy jest łatwa do zmierzenia. Podczas lizania żuchwa musi się otworzyć, aby umożliwić wysunięcie języka z pyszczka. W związku z tym liczba cykli otwarcia i zamknięcia żuchwy (wychyleń) na sekundę (30 klatek) podczas picia jest równoważna częstości lizania. Każdy cykl ruchu żuchwy rozpoczyna się od maksymalnego otwarcia żuchwy (co pokrywa się z wysunięciem języka) i kończy w momencie, gdy żuchwa ponownie powróci do pozycji maksymalnie otwartej. Kolejne cykle zamykania i ponownego otwierania żuchwy są liczone jako poszczególne epizody ruchu żuchwy.
Zakres wysunięcia żuchwy	Odległość, na jaką otwiera się żuchwa podczas cykli wysuwania żuchwy, mierzona w mm pomiędzy siekaczami górnymi a dolnymi.
Stosunek lizania do połykania	Liczba cykli wysuwania żuchwy występujących podczas każdego ISI (t.j. między dwoma kolejnymi, nieprzerwanymi przełykami).
Częstość połykania	Liczba przełyków występujących podczas każdego 2-sekundowego epizodu nieprzerwanego picia z dzióbka.
Czas przejścia gardłowego (PTT)	Czas potrzebny na przełyknięcie kęsa przez gardło. Klatka początkowa jest identyczna z klatką początkową ISI (t. j. „klatkę spoczynkową”, która bezpośrednio poprzedza widoczny transport kęsa z zatok gardłowych). Klatką końcową jest moment, w którym ogon kęsa całkowicie przekroczy 2nd kręg szyjny (C2), który jest najbardziej wyraźnym punktem orientacyjnym w odcinku szyjnym kręgosłupa myszy. Następnie liczbę klatek między klatką początkową a końcową dzieli się przez 30 kl./s i przelicza na milisekundy (msek).
Prędkość przemieszczania się kęsa przez gardło	Prędkość kuli pokarmowej w gardle jest mierzona w odniesieniu do PTT (opisanego powyżej). Przy użyciu oprogramowania ImageJ mierzy się odległość (mm) od zatok gardłowych do drugiego kręgu szyjnego (C2), skalując ją za pomocą znacznika kalibracyjnego. Odległość tę (mm) dzieli się następnie przez PTT (msec), aby wyznaczyć prędkość kuli pokarmowej (mm/msec).
Czas przejścia przez przełyk (ETT)	Klatka początkowa ETT jest identyczna z klatką końcową PTT (opisaną powyżej). Klatką końcową ETT jest moment, w którym bolus całkowicie przedostanie się do żołądka, co definiuje się jako zniknięcie bolusa z przełyku. Liczbę klatek pomiędzy klatką początkową a końcową ETT dzieli się następnie przez 30 kl./s i przelicza na ms.
Prędkość przesuwania się bolusa przez przełyk	Prędkość przemieszczania się kęsa w przełyku jest mierzona w odniesieniu do czasu przejścia kęsa (ETT, opisanego powyżej). Przy użyciu oprogramowania ImageJ mierzy się odległość (mm) od drugiego kręgu szyjnego (C2) do przejścia żołądkowo-przełykowego, skalując ją za pomocą znacznika kalibracyjnego. Odległość tę (mm) dzieli się następnie przez czas ETT (msec), aby wyznaczyć prędkość kęsa (mm/msec).
Prędkość przemieszczania się kęsa przez gardło i przełyk	Parametr ten jest stosowany w sytuacjach, gdy drugi kręg szyjny (C2) nie jest wyraźnie widocznym punktem orientacyjnym anatomicznym, co uniemożliwia rozróżnienie między fazą gardłową a przełykową połykania. W takich przypadkach prędkość przemieszczania się kęsa przez gardło i krtań jest łączona w jeden parametr połykania. Klatka początkowa jest identyczna z klatką początkową PTT (t. j. „klatkę spoczynkową”, która bezpośrednio poprzedza widoczny transport kęsa z zatok gardłowych). Klatka końcowa jest identyczna z klatką końcową dla ETT (t. j. (gdy bolus całkowicie przedostanie się do żołądka). Liczbę klatek pomiędzy tymi dwoma zdarzeniami dzieli się przez 30 fps i przelicza na milisekund (msec).
Powierzchnia bolusa	Za pomocą oprogramowania ImageJ mierzona jest powierzchnia kęsa w „klatce spoczynkowej” nadgardła przed rozpoczęciem połykania gardłowego, z przeskalowaniem przy użyciu znacznika kalibracyjnego.
Obszar resztek gardłowych	Powierzchnię pozostałości gardłowych mierzy się przy użyciu oprogramowania ImageJ, skalując wynik za pomocą znacznika kalibracyjnego.
Objętość spożytego płynu	Objętość płynu spożytego z butelki z rurką do picia jest trudna do oszacowania ze względu na wycieki z dzióbka. Jednakże objętość płynu spożytego z miseczki z kołkiem można obliczyć dokładniej w następujący sposób: 1) wyznaczyć gęstość (tj. stosunek masy do objętości) skalibrowanej objętości cieczy podanej do naczynia typu peg-bowl, 2) wyznaczyć masę naczynia peg-bowl zawierającego pozostałą ciecz, 3) wprowadzić te wartości do konwertera masy na objętość (np. http://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php.

Tabela 2: Parametry przełykania możliwe do ilościowego określenia podczas badania VFSS u myszy.

Wyniki

Z sukcesem opracowaliśmy nowy i powtarzalny protokół VFSS specyficzny dla myszy, który obejmuje komory testowe umożliwiające samodzielne żywienie, przepisy na aromatyzowanie doustnych środków kontrastowych oraz szczegółowy protokół testowy pozwalający na ilościową ocenę fizjologii połykania. Zdolność systemu fluoroskopowego w zakresie poziomów energii określiła, które parametry połykania można zbadać u myszy. Początkowo korzystaliśmy z fluoroskopów wysokiej energii przeznaczonych dla ludzi i większych zwierząt (np. GE Advantx, GE OEC 9600 oraz Omega Cardiac Cath CS-25, każdy z częstotliwością 30 klatek na sekundę). Jednak systemy te posiadały niewystarczające możliwości powiększenia niezbędne do badania myszy, co skutkowało tym, że zwierzę zajmowało jedynie niewielką część pola widzenia (Rycina 9). W rezultacie jakość obrazu była wyjątkowo niska, co uniemożliwiało wizualizację większości struktur mechanizmu połykania. Pomimo tego ograniczenia zidentyfikowaliśmy 7 obiektywnych parametrów połykania w VFSS, które były konsekwentnie mierzalne u myszy przy użyciu konwencjonalnego (tj. wysokenergetycznego) fluoroskopu w połączeniu z nowym protokołem VFSS dla myszy (Tabela 3). Ponadto zidentyfikowaliśmy przestrzeń vallecularną jako anatomiczny punkt wyzwalający połykanie u zdrowych dorosłych myszy (w wieku 3-17 miesięcy), a także u myszy w wieku podeszłym (>18 miesięcy) oraz w końcowym stadium ALS.

Rycina 9: Systemy fluoroskopii wysokoenergetycznej. Po lewej: Reprezentacyjny obraz myszy uzyskany za pomocą systemów fluoroskopii wysokoenergetycznej (t.j. konwencjonalnej). Należy zauważyć, że mysz wypełnia tylko niewielką część pola widzenia fluoroskopu, co wykazuje niewystarczającą zdolność powiększenia konwencjonalnych fluoroskopów w obrazowaniu gryzoni. Po prawej: Ten sam obraz powiększony po przechwyceniu za pomocą programu do edycji wideo. Czarna strzałka: punkt wyzwalający połykanie (zatoki migdałkowe). Biała strzałka: bolus w końcowym odcinku przełyku, bezpośrednio przed przejściem przez przejście przełykowo-żołądkowe (biała gwiazdka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

PARAMETRY POŁYKANIA	System wysokoenergetyczny	System niskiej energii
Odstęp między połyknięciami (ISI)	X	X
Szybkość ruchu żuchwy (odpowiednik szybkości lizania)	X	X
Zakres wysunięcia żuchwy	X	X
Stosunek liczby lizaniami do liczby przełykań	X	X
Częstość połykania	X	X
Czas przejścia przez gardło (PTT)		X
Prędkość kęsa w gardle		X
Czas przejścia przez przełyk (ETT)		X
Prędkość przesuwania bolusa przez przełyk		X
Prędkość przemieszczania się kęsa przez gardło i przełyk	X	X
Obszar bolusa		X
Obszar resztek gardłowych		X
Objętość spożytej cieczy	X	X

Tabela 3: Parametry połykania możliwe do ilościowego oznaczenia przy użyciu systemów fluoroskopowych o wysokiej i niskiej energii.

Niedawno nabyliśmy system fluoroskopii o niskiej energii i dużym powiększeniu o nazwie The LabScope (Glenbrook Technologies, Randolph, NJ), który został zaprojektowany specjalnie dla naszego laboratorium do pracy z myszami i innymi małymi gryzoniami (Rysunek 10). Jednak znaczne poziomy powiększenia tego systemu uniemożliwiły obserwację całego mechanizmu połykania myszy w jednym polu widzenia. Zamiast tego wymagane są dwie pozycje testowe, jak pokazano na Rysunku 11. Pozycja 1 umożliwia wizualizację całej głowy i proksymalnego regionu klatki piersiowej. Pozycja ta jest niezbędna do oceny jamowego i gardłowego etapu połykania. Pozycja 2 umożliwia wizualizację od punktu wyzwalającego połykanie (t.j. zatoki krtaniowe) do przejścia żołądkowo-przełykowego (GE). Pozycja ta jest niezbędna do oceny przełykowego etapu połykania. Wstępne prace z wykorzystaniem The LabScope w połączeniu z nowym protokołem VFSS dla myszy pozwoliły zidentyfikować 13 obiektywnych parametrów połykania, które są konsekwentnie mierzalne u myszy, co stanowi niemal dwukrotność liczby uzyskanej przy użyciu fluoroskopów wysokenergetycznych (t.j. konwencjonalnych) (Tabela 3). Wynik ten przypisuje się zaawansowanym możliwościom powiększania systemu The LabScope, który pozwala na wizualizację licznych struktur anatomicznych (Rysunek 12), które były w zasadzie niewidoczne przy użyciu konwencjonalnych systemów: np. kości hyoidalnej, tchawicy i kręgów szyjnych. W rezultacie mogliśmy również analizować nagrania wideo pod kątem dowodów na penetrację i aspirację krtaniową. Ani penetracji, ani aspiracji nie zaobserwowano u żadnej myszy w niniejszym badaniu, niezależnie od stanu zdrowia czy obecności choroby.

Rysunek 10: Urządzenie LabScope. Po lewej: LabScope służy jako pulpitowy fluoroskop do małych zwierząt. Po prawej: Widok z bliska urządzenia LabScope z opisanymi komponentami. Podnośnik nożycowy pozycjonuje komorę obserwacyjną w polu widzenia fluoroskopu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 11: System niskenergetycznej fluoroskopii. Obrazy myszy uzyskane przy użyciu systemu niskenergetycznej fluoroskopii. Należy zauważyć, że możliwość dużego powiększenia uniemożliwia wizualizację całego mechanizmu połykania w polu widzenia fluoroskopu. Lewo: Pozycja 1 – umożliwia wizualizację całej głowy i proksymalnego regionu klatki piersiowej. Punkt wyzwalający połykanie (czarna strzałka) znajduje się w centrum pola widzenia. Prawo: Pozycja 2 – umożliwia wizualizację od punktu wyzwalającego połykanie (czarna strzałka) do połączenia żołądkowo-przełykowego (biała gwiazdka). Zauważalny jest kęs przechodzący przez dystalną część przełyku (biała strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 12: Struktury anatomiczne widoczne przy użyciu niskoenergetycznego systemu fluoroskopii. Nawet przy najniższym ustawieniu powiększenia (po lewej), struktury kostne głowy i szyi myszy są wyraźnie widoczne przy użyciu naszego niskoenergetycznego systemu fluoroskopii (t.j. The LabScope). Struktury anatomiczne znajdujące się w czarnym kwadracie są przedstawione (i opisane) przy większym powiększeniu po prawej stronie. Poprawiona wizualizacja struktur kostnych umożliwia kwantyfikację kilku dodatkowych parametrów połykania, których analiza była niemożliwa przy użyciu wysokoenergetycznych fluoroskopów. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Częstość połykania oraz odstęp między połykaniami są reprezentatywnymi parametrami VFSS, które można określić ilościowo, wykorzystując systemy fluoroskopii o niskiej lub wysokiej energii w połączeniu z nowym protokołem VFSS dla myszy. Te dwa parametry połykania określono dla trzech grup myszy: transgenicznych myszy SOD1-G93A (SOD1) (tj. modelu ALS) w końcowym stadium choroby w wieku od 4 do 5 miesięcy, starych myszy C57 (w wieku 18–24 miesięcy) oraz grupy kontrolnej młodych, zdrowych myszy (w wieku 4–8 miesięcy) rasy C57 i nietransgenicznych osobników z miotu z kolonii SOD1. Wszystkie dane dotyczą wyłącznie picia z poidełka przy użyciu systemu fluoroskopii o niskiej lub wysokiej energii. Nie stwierdzono istotnych różnic między młodymi myszami C57 a młodymi nietransgenicznymi myszami (kontrolnymi) z kolonii SOD1 w odniesieniu do tych dwóch parametrów połykania; dlatego dane połączono w ogólną grupę „kontrolną” młodych, zdrowych myszy w celu porównania ich ze starymi myszami C57 i myszami SOD1 w stadium końcowym. Częstość połykania (tj. liczba połyknięć podczas 2 kolejnych sekund nieprzerwanego picia) była istotnie niższa u myszy SOD1 w porównaniu ze starymi myszami C57 i grupą kontrolną. Odstęp między połykaniami (tj. czas między dwoma kolejnymi połyknięciami) nie różnił się istotnie między grupami. Wyniki te wspierają tezę, że profile dysfagii są prawdopodobnie wyraźnie odmienne dla każdego stanu chorobowego (Rysunek 13).

Rysunek 13: Wstępne wyniki. Na rysunku przedstawiono reprezentatywne wstępne wyniki dla dwóch parametrów połykania w badaniu VFSS, ilościowo określonych zgodnie z mysim protokołem VFSS: częstotliwości połykania (po lewej) oraz odstępu między połykaniami (po prawej). Częstotliwość połykania była znacząco niższa u myszy SOD1 w porównaniu do starszych myszy C57 i grupy kontrolnej. Nie stwierdzono istotnych różnic między grupami w zakresie odstępu między połykaniami. Linie nad słupkami wskazują statystycznie istotne różnice (p < 0.05) między grupami, wyznaczone za pomocą parowych porównań Bonferroniego. Słupki błędów reprezentują ± 1 SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Setki modeli mysich (myszy i szczurów) są dostępne na rynku do badania chorób ludzkich. Jednak tylko trzy modele choroby mysiej zostały specjalnie zbadane w odniesieniu do dysfagii: mysi model ALS^13,14 i szczurzy model choroby Parkinsona^12,15-17 i udar¹⁸. W każdym z tych wstępnych badań wykorzystano różne metodologie oceny dysfagii, co uniemożliwiło uzyskanie znaczących porównań między gatunkami i chorobami. To poważne ograniczenie może zostać przezwyciężone w przyszłych badaniach poprzez wykorzystanie nowo opracowanego mysiego protokołu VFSS, który umożliwia obiektywną kwantyfikację wielu parametrów jaskółki u zwierząt samożywiących się.

Pomyślne wyniki VFSS zależą od trzech krytycznych elementów: 1) komór testowych, które umożliwiają samodzielne odżywianie się w pozycji nieskrępowanej w ograniczonej przestrzeni, 2) receptur, które maskują awersyjny smak/zapach dostępnych na rynku doustnych środków kontrastowych oraz 3) protokołu testowego krok po kroku, który pozwala na ilościowe określenie fizjologii jaskółki. Połączony efekt tworzy komfortowe, bezstresowe, samodzielne środowisko badania, które przywołuje typowe zachowania związane z karmieniem i połykaniem. Wyeliminowanie jednego lub więcej z tych składników będzie miało szkodliwy wpływ na wyniki badania. Przykłady negatywnych skutków obejmują niezdolność do utrzymania zwierząt w polu widzenia fluoroskopii, niepożądane zachowania, które odwracają uwagę od picia, niechęć do doustnego środka kontrastowego oraz niemożność ilościowego określenia parametrów połykania z powodu niewystarczającej liczby epizodów picia.

Dużym wyzwaniem w uzyskaniu optymalnych wyników VFSS było zaprojektowanie odpowiedniej komory testowej. Liczne poprawki naszego prototypowego projektu zakończyły się stworzeniem komory obserwacyjnej, która w wystarczającym stopniu utrzymuje myszy w polu widzenia i zapobiega zachowaniom odwracającym uwagę od picia. Komory zostały wykonane przy użyciu frezarek w celu uzyskania jednolitych wymiarów rur i zaślepek, zapewniając tym samym wymienność komponentów dla kilku komór obserwacyjnych o tej samej średnicy. Wewnętrzne wymiary (średnica i długość) zostały dopasowane tak, aby były nieco większe niż rozmiar ciała dorosłej myszy, co zaowocowało wąską komorą testową, która wystarczająco pozwala na chodzenie w linii prostej i obracanie się. Wąska konstrukcja, w połączeniu ze strategicznym umieszczeniem dziobka i miski na kołku tylko na końcu, utrzymuje głowę i ciało myszy w jednej linii wzdłuż komory podczas picia. Po zaangażowaniu w picie myszy pozostają niezwykle stabilizowane przy dziobku lub misce przez kilka sekund na raz, co skutkuje minimalnym artefaktem ruchu, który zakłóca testy. W ten sposób możliwe jest uzyskanie niezakłóconej, bliskiej obserwacji/zapisu wideo i obrazowania wideofluoroskopowego myszy podczas picia w płaszczyźnie bocznej i grzbietowo-brzusznej.

Myszy (i inne małe gryzonie) są naturalnie skłonne do szukania schronienia w małych przestrzeniach. W rezultacie swobodnie wchodzą do komory testowej (z jednym końcem już zamkniętym zaślepką) po umieszczeniu go w klatce domowej, eliminując w ten sposób stres/niepokój spowodowany obsługą (tj. ręcznym podnoszeniem zwierzęcia w celu umieszczenia go w komorze). Gdy mysz wejdzie do komory, drugi koniec jest zamykany poprzez przymocowanie 2^{. zaślepki} . Taka konstrukcja zapobiega ucieczce, tworząc jednocześnie komorę testową o niskim poziomie lęku, w której myszy mogą swobodnie eksplorować.

Kwadratowy kształt komory zapewnia wbudowaną stabilność ruchu, która pozwala na używanie jej w pozycji wolnostojącej, eliminując w ten sposób potrzebę testowania w standardowej klatce dla gryzoni. Całe urządzenie jest lekkie, przenośne, można je układać w stosy w celu przechowywania, jest wytrzymałe, łatwe do czyszczenia i może być sterylizowane w autoklawie. Chociaż komory zostały początkowo zaprojektowane do użytku z fluoroskopią, są one również kompatybilne z radiografią punktową, neuroobrazowaniem (np. MRI, PET, CT) oraz obserwacją wizualną/nagrywaniem wideo różnych zachowań.

Drugim poważnym wyzwaniem do pokonania było maskowanie awersyjnego smaku/zapachu doustnych środków kontrastowych (tj. siarczanu baru i joheksolu). Biorąc pod uwagę, że wrażliwość smakowa różni się znacznie wśród szczepów myszy w^{wieku 19-21} lat, a być może w wieku^22,23 lat, konieczne było zidentyfikowanie jednego roztworu testowego, który byłby smaczny dla wszystkich myszy, niezależnie od szczepu i wieku. Wynik ten jest niezbędny, aby umożliwić bezpośrednie porównanie funkcji/dysfunkcji jaskółki w różnych szczepach i wieku, przy jednoczesnym wyeliminowaniu mylących wyników wynikających z różnic w właściwościach reologicznych (np . lepkość, gęstość itp.) i chemicznych badanych roztworów. W tym celu opracowaliśmy proste, szybkie podejście do badania przesiewowego smakowitości, aby zidentyfikować preferowany wzmacniacz smaku, aby zamaskować awersyjny smak/zapach doustnych środków kontrastowych podczas mysiego VFSS. Metody zostały wzorowane na teście krótkiej ekspozycji, który wymaga lizometru (tj. czujnika lizania) do rejestrowania szybkości lizania w ciągu pierwszych 2 minut po okresie regulacji wody (tj. wstrzymaniu wody przez noc) w celu wywołania pragnienia^24,25. Lizometr nie był dostępny do tego badania; W związku z tym preferencje oceniono na podstawie obserwacji behawioralnych, a także standardowych metod nagrywania wideo dla szybkości lizania, które zostały wcześniej zwalidowane w naszym laboratorium^13,14. Stosując to podejście do badania smakowitości, czekolada została zidentyfikowana jako preferowany wzmacniacz smaku przez szczepy C57 i C57/SJL. W szczególności 100% myszy w każdej klatce chętnie piło roztwory o smaku czekoladowym w ciągu 30 sekund od ekspozycji, przy czym wiele myszy jednocześnie piło przy wylewce. Jednak dodanie baru powodowało tylko krótkie napady picia u większości myszy, niezależnie od stężenia baru lub czekolady.

Alternatywą dla baru jest joheksol, środek kontrastowy na bazie jodu, który dopiero niedawno został uznany za odpowiednią alternatywę dla siarczanu baru dla ludzkiego VFSS¹⁰; W związku z tym nie został jeszcze ustandaryzowany do tego celu. Myszom zaoferowano kilka różnych stężeń ioheksolu o smaku czekoladowym. Przepisy zawierające do 50% roztworu joheksolu (350 mg jodu na ml) były chętnie spożywane przez większość myszy po całonocnym okresie regulacji wody. Wyższe stężenia skutkowały zachowaniami unikającymi. 50% roztwór joheksolu (350 mg jodu na ml) wytwarzał wystarczającą gęstość promieniowania podczas połykania przez myszy, podczas gdy niższe stężenia były znacznie mniej widoczne i utrudniały ilościowe określenie fizjologii jaskółki. W związku z tym zidentyfikowano optymalne rozwiązanie testowe dla VFSS u myszy, jako 50% roztwór joheksolu z dodatkiem aromatu czekoladowego. Wielokrotne testy smakowitości nie skutkowały zachowaniami unikającymi ani zdarzeniami niepożądanymi.

Trzecim wyzwaniem do pokonania było zapobieganie obracaniu/przechylaniu głowy myszy podczas picia, co zaciemnia wizualizację mechanizmu połykania podczas VFSS. Picie z miski umieszczonej tuż nad podłogą na jednym końcu komory rozwiązało ten problem. Istnieje kilka dodatkowych zalet korzystania z miski na kołki zamiast butelki z rurką do sikania. Na przykład, skalibrowana objętość cieczy może być pipetowana do miski kołkowej przez otwór wentylacyjny w zaślepce rurki obserwacyjnej. Takie podejście pozwala na ilościowe określenie minutowej objętości roztworu testowego zużytego podczas krótkiego czasu trwania badania VFSS. Co więcej, zwiększona powierzchnia badanego roztworu w misce kołka, w porównaniu z małym otworem rurki sipper, może zapewnić zwiększoną stymulację węchową w celu dalszego motywowania do picia. Miski na kołki mogą lepiej nadawać się do badania młodych lub mniejszych szczepów myszy, ponieważ wysokość miski jest ustandaryzowaną odległością od podłogi. W przeciwieństwie do tego, długości rurki sipper muszą być dostosowane, aby pomieścić myszy o różnych rozmiarach, co dodaje kolejną potencjalnie mylącą zmienną do rozważenia. Ponadto mysie modele chorób neurologicznych mogą mieć trudności z dotarciem do butelki z rurką z łykiem z powodu upośledzenia motorycznego kończyn, podczas gdy mogą łatwo dotrzeć do miski z kołkami. Myszy z dysfunkcją języka i/lub szczęki mogą nie być w stanie wystarczająco nacisnąć kulki w dziobku, aby uzyskać dostęp do płynu; Korzystanie z misek na kołki może wyeliminować ten problem. Z tych powodów stosowanie misek na kołki zamiast butelek z rurką sipper jest preferowaną metodą testowania mysich VFSS. Jednak komory obserwacyjne zostały zaprojektowane tak, aby w razie potrzeby pomieścić picie dziobków. Ważnym zastrzeżeniem do rozważenia jest to, że wiadomo, że tempo lizania różni się między wylewką a miską^13,26. W związku z tym wybór wylewki lub miski kołkowej dla VFSS musi być spójny w ramach eksperymentów i między nimi.

Czwartym wyzwaniem było zidentyfikowanie wymiernych parametrów połykania u myszy, które są porównywalne z parametrami VFSS powszechnie stosowanymi w badaniach naukowych na ludziach i praktyce klinicznej. Nasze wstępne wyniki wykazały, że rodzaj systemu fluoroskopowego określa, jakie parametry połykania można badać u myszy. Większość ośrodków badawczych i placówek medycznych posiada fluoroskopy o wysokiej energii (75-95 kV, 1-5 mA) przeznaczone do użytku z ludźmi i większymi zwierzętami, co skutkuje wyjątkowo niską jakością obrazu podczas testowania myszy i innych małych zwierząt. Na przykład niedawne badanie z użyciem fluoroskopu o wysokiej energii na szczurach było w stanie zidentyfikować tylko 4 wymierne parametry połykania¹², a my byliśmy w stanie zidentyfikować tylko 7 parametrów połykania dla myszy w tym badaniu. Aby przezwyciężyć to poważne ograniczenie, niedawno uzyskaliśmy system fluoroskopii o niskiej energii o nazwie The LabScope (Glenbrook Technologies). System jest miniaturowym fluoroskopem, który generuje ciągłą wiązkę stożkową promieniowania rentgenowskiego o energiach fotonów od 15 do 40 kV i szczytowym prądzie lampy 0,2 mA (maksymalna moc 8 W). Niższe poziomy energii tego systemu są lepiej tłumione przez cienką kość i tkankę miękką myszy, a tym samym zapewniają wyższą rozdzielczość kontrastu niż konwencjonalne (tj. wysokoenergetyczne) fluoroskopy. Wiązka promieniowania rentgenowskiego LabScope jest kierowana na wzmacniacz obrazu o średnicy 5 cm, który jest znacznie mniejszy niż wzmacniacz obrazu o średnicy 15-57 cm w konwencjonalnych fluoroskopach. Minimalna odległość między źródłem a wzmacniaczem (SID) LabScope wynosi ~6 cm (w przeciwieństwie do ~30 cm w przypadku konwencjonalnych fluoroskopów), co zapewnia zwiększone możliwości powiększenia. Ponadto LabScope wykorzystuje opatentowaną technologię, która cyfrowo powiększa obraz do 40 razy w czasie rzeczywistym, bez zmiany SID. Rezultatem jest w istocie mikroskop rentgenowski, który może powiększać i pomniejszać w czasie rzeczywistym, aby zobaczyć małe obszary zainteresowania, takie jak mechanizm połykania myszy.

Główną zaletą tego niskoenergetycznego systemu fluoroskopii jest poprawa bezpieczeństwa radiacyjnego. Oprócz tego, że zwierzęta otrzymują niższe dawki promieniowania za pomocą LabScope, naukowcy korzystający z systemu są narażeni na znacznie mniejsze rozproszenie promieniowania. Narażenie na promieniowanie bezpośrednio przed urządzeniem na panelu sterowania wynosi 10,3 mR/h. W odległości 1 m przed urządzeniem ekspozycja spada do 580 μR/h. Większość innych miejsc w pomieszczeniu ma bardzo niską ekspozycję poniżej 10 μR/h. Pomimo tej poprawy podjęliśmy dodatkowe środki w celu poprawy bezpieczeństwa radiologicznego. Na przykład wokół LabScope dodano osłonę z akrylu ołowiowego, aby blokować rozproszone fotony promieniowania rentgenowskiego, co umożliwia naukowcom przeprowadzanie mysich testów VFSS bez noszenia osobistych osłon (np. fartuchów ołowianych, osłon tarczycy i okularów). Dodatkowo przezroczysty akryl pozwala na wizualizację myszy z daleka. Dodatkowe bezpieczeństwo radiacyjne zapewnia zmotoryzowany podnośnik nożycowy, który jest sterowany zdalnie przez badacza. Z odległości do 3 m od fluoroskopu naukowcy mogą za pomocą zdalnie sterowanego urządzenia regulować pionowe i poziome położenie komory obserwacyjnej w obrębie wiązki promieniowania rentgenowskiego. W rezultacie, anatomiczne obszary zainteresowania mogą być utrzymywane w polu widzenia fluoroskopii, podczas gdy mysz swobodnie porusza się w komorze obserwacyjnej. Chociaż podnośnik nożycowy został zaprojektowany do użytku z The LabScope, jest również kompatybilny z konwencjonalnymi fluoroskopami w celu poprawy bezpieczeństwa radiacyjnego dla badaczy. Ostatnim krokiem w celu poprawy bezpieczeństwa radiacyjnego podczas mysiego VFSS jest zastosowanie strzykawkowego systemu dostarczania płynów. System ten zawiera rurkę PE o długości 3-4 stóp (lub dłuższą, jeśli to konieczne), która umożliwia szybkie i wydajne dostarczanie płynów do miski kołkowej z dużej odległości. Ten strzykawkowy system podawania płynów, w połączeniu z komorami obserwacyjnymi, może być również używany z konwencjonalnymi fluoroskopami.

Wstępne prace z wykorzystaniem LabScope, w połączeniu z nowym mysim protokołem VFSS, pokazują główną przewagę nad konwencjonalnymi systemami: liczba parametrów połykania, które można wiarygodnie określić ilościowo, jest prawie podwojona. Jednak struktury tkanek miękkich mechanizmu połykania (np. język, velum, tylna ściana gardła i nagłośnia) myszy nie są łatwo widoczne podczas korzystania z systemów fluoroskopii o niskiej lub wysokiej energii. Dlatego skupiliśmy się na ilościowym określeniu miar przepływu w bolusie, a nie na biomechanice połykania. Interesowały nas przede wszystkim parametry, które można określić ilościowo na podstawie jednostek czasu, powierzchni, odległości, objętości itp., a nie przy użyciu miar w skali Likerta. W literaturze dotyczącej VFSS u ludzi opisano liczne parametry przepływu bolusa spełniające to wymaganie, takie jak czas pasażu doustnego^27-29, czas pasażu gardłowego^27-33 i czas pasażu przełykowego^34-36, by wymienić tylko kilka. Transport bolusa przez jamę ustną nie był łatwo widoczny u myszy, prawdopodobnie ze względu na mały rozmiar bolusa podczas spontanicznego picia. Udało nam się jednak wiarygodnie określić ilościowo czas pasażu przez gardło i przełyk, a także kilka innych pomiarów związanych z przepływem i klirensem bolusa. Oczekuje się, że identyfikacja dodatkowych parametrów połykania translacyjnego będzie oczekiwana w miarę optymalizacji możliwości The LabScope.

Wyniki tego badania wykazały, że myszy wykonują kilka rytmicznych liźnięć na łyk podczas spontanicznego picia, przy czym każdy mały płynny bolus sekwencyjnie wypełnia przestrzeń zastawkową przed uruchomieniem połknięcia gardłowego. To zachowanie, które jest typowe dla ssaków, które używają lizania jako podstawowego sposobu spożywania płynu^37-40, przypomina rytmiczny wzorzec ssania i połykania ludzkiego niemowlęcia i wszystkich młodych ssaków w ogóle. Fizjologia połykania niemowląt charakteryzuje się kilkoma rytmicznymi ssaniami, po których następuje odruchowe połykanie gardłowe, powszechnie opisywane jako cykl ssania-połykania^37,41-43. Tak więc rytmiczne ruchy języka i żuchwy związane z lizaniem po spożyciu myszy mogą być bardziej porównywalne z zachowaniami ssania po spożyciu ludzkich niemowląt, a nie z piciem kubka przez dzieci i dorosłych. W związku z tym określaliśmy ilościowo częstość lizania i stosunek lizania do połykania myszy w celu przyszłych porównań z częstością ssania i stosunkiem ssania do połykania ludzkich niemowląt. Być może badania nad mysimi VFSS dostarczą wglądu w rozwojowe zaburzenia połykania.

Jak w przypadku każdej nowej metody badawczej, zidentyfikowano obszary wymagające poprawy. Na przykład mysi protokół VFSS został opracowany przy użyciu tylko szczepów myszy C57 i C57/SJL; Nie został jeszcze przetestowany na szczurach. Komory obserwacyjne będą musiały zostać powiększone pod względem rozmiaru (średnicy i długości), aby pomieścić większe rozmiary ciała szczurów. Nie wiadomo również, czy joheksol o smaku czekoladowym jest odpowiedni jako uniwersalny roztwór testowy VFSS u myszy. Dlatego w tym celu uzasadnione jest przeprowadzenie testów na większą skalę z wieloma szczepami myszy i szczurów. Nie należy również wykluczać stosowania baru jako środka kontrastowego w mysich VFSS. Myszy wyraźnie preferowały receptury joheksolu od baru; Jednak bardziej rygorystyczne i systematyczne próby maskowania awersyjnego smaku/zapachu baru mogą stanowić smaczną alternatywę dla johexolu. Przyszłe badania porównujące wpływ joheksolu i siarczanu baru (a także innych potencjalnych doustnych środków kontrastowych) na preferencje smakowe i fizjologię połykania u myszy i szczurów bez wątpienia dostarczą ważnych informacji, które są bezpośrednio istotne i translacyjne dla ludzkich VFSS.

VFSS u ludzi obejmuje kilka konsystencji pokarmów i płynów, a dysfagia jest najbardziej widoczna podczas połykania rzadkich płynów i suchych, stałych pokarmów^44,45. Mysi protokół VFSS jest zatem rozszerzany o dodatkowe konsystencje, które mogą ułatwić wykrywanie i kwantyfikację dysfagii w modelach choroby. Konieczne będzie również przeprowadzenie badań lepkości płynnych receptur mysich VFSS w celu dostosowania lepkości do tych stosowanych podczas VFSS u ludzi. Zajęcie się tymi ograniczeniami ułatwi identyfikację translacyjnych biomarkerów dysfagii VFSS, które można bezpośrednio porównać między myszami, szczurami i ludźmi.

Użyteczność mysiego VFSS może zostać znacznie zwiększona poprzez wszczepienie markerów nieprzepuszczających promieni rentgenowskich do struktur tkanek miękkich mechanizmu połykania, które w inny sposób nie są widoczne, umożliwiając w ten sposób badania biomechaniki połykania. Podejście to jest z powodzeniem stosowane od wielu lat do badania biomechaniki połykania u młodych świń, przy użyciu asortymentu metalowych klipsów i drutów^37,42. Spodziewamy się, że zastosowanie podobnych, ale mniejszych markerów u myszy pozwoli na ilościowe określenie kilku dodatkowych parametrów jaskółki w celu porównania z większymi ssakami, w tym ludźmi. Obecnie opracowujemy metodologię wszczepiania markerów nieprzepuszczających promieni rentgenowskich do języka, podniebienia miękkiego, gardła, krtani i bliższego przełyku myszy, aby przetestować tę hipotezę.

Liczba klatek na sekundę podczas nagrywania wideo w LabScope i konwencjonalnych fluoroskopach jest ograniczona do 30 klatek na sekundę (fps). Jednak nasze wstępne wyniki wykazały, że cały gardłowy etap połykania u zdrowych myszy następuje w czasie krótszym niż 66 ms (tj. 2 ramki), czyli około 10 razy szybciej niż u ludzi. Tak więc gardłowa faza połykania u myszy zachodzi tak szybko, że szczegóły nie są odczuwalne przy użyciu kamery 30 kl./s. Wyższa liczba klatek na sekundę (prawdopodobnie >100 kl./s) będzie konieczna, aby wystarczająco zobrazować i określić ilościowo niezwykle szybkie i złożone ruchy gardła podczas połykania u myszy i innych gryzoni. W połączeniu z wyższą liczbą klatek na sekundę, włączenie technologii dwupłaszczyznowej do obrazowania fluoroskopowego 3D z pewnością rozszerzyłoby użyteczność mysich VFSS. W związku z tym przyszłe rozważania projektowe powinny obejmować kamerę o większej liczbie klatek na sekundę i możliwości obrazowania dwupłaszczyznowego.

Wreszcie, wykazano, że niskie dawki promieniowania powodują bezpłodność u samic myszy C57, co skutkuje zmienionym poziomem hormonów stymulowanych przez jajniki, co może zakłócić badania długości życia⁴⁶. Wyniki odnoszące się konkretnie do skutków powtarzającego się narażenia na niskie dawki promieniowania związanego z testami VFSS nie zostały jeszcze zbadane na myszach, innych zwierzętach lub ludziach. Jednak dysfunkcja jajników (niezwiązana z ekspozycją na promieniowanie) u kobiet została powiązana z zaburzeniami motoryki przewodu pokarmowego, a w szczególności z dysfagią w niektórych przypadkach⁴⁷, co stanowi kolejne zastrzeżenie do rozważenia przy projektowaniu przyszłych badań VFSS, które obejmują kobiety (zwierzęta i ludzi). Należy unikać wykluczania samic, ponieważ znaczące różnice między płciami w funkcji połykania zostały zgłoszone u ludzi^48,49 i byłyby ważne do wykrycia i scharakteryzowania również w modelach chorób zwierzęcych. Dlatego wyniki podłużnych badań VFSS na myszach i szczurach obu płci mają ogromny potencjał translacyjny dla ludzi w odniesieniu do dysfagii, a także do ryzyka narażenia na niskie dawki promieniowania związanego z powtórnymi testami VFSS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurki poliwęglanowe do komór obserwacyjnych	McMaster-Carr	3161T41	Korpus tub obserwacyjnych, średnica 2"X2", grubość ścianki 0,080"
Arkusz poliwęglanowy  do komór obserwacyjnych	McMaster-Carr	9115K71	Zaślepki do tub obserwacyjnych, 2"x12"x3/4"
Arkusz poliwęglanowy  do komór obserwacyjnych	McMaster-Carr	8574K281	Miski kołkowe do tub obserwacyjnych
O-ringi silikonowe  do zaślepek komór obserwacyjnych	McMaster-Carr	9396K108	S1138 AS568-029, opakowanie 25 http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r
Korki silikonowe do komór obserwacyjnych	McMaster-Carr	2903K22	Zestaw 10 korków do zatykania owalnego otworu w górnej części komory obserwacyjnej przy użyciu miski kołkowej http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at
Probówki wirówkowe do butelek z rurką sipper	Evergreen Scientific	222-3530-G80	Probówki wirówkowe wolnostojące o pojemności 30 ml, z nakrętkami, sterylne https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/
Korki silikonowe do butelek z rurką do łykania	Saint-Gobain Performance Plastics	DX263031-10	Numer 31D, rozmiar: 26 mm na dole, 32 mm na górze, 30 mm na wysokości; 10 sztuk;   http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS
Wiertła korkowe do butelek z rurką do łykania Thomas	Scientific	3276G40	Zestaw świdrów korkowych o rozmiarach od 3/16-15/16 cala  http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt
Rurki do picia do butelek z rurką	Ancare	TD-100	Rurki do picia o długości 2 1/2" z otworem 5/16", prosta wylewka kulowa http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point
Iohexol do sporządzania doustnego roztworu środka kontrastowego	GE Healthcare		350 mg jodu na ml http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque
Syrop czekoladowy do aromatyzowania doustnego środka kontrastowego	Herseys
10 ml strzykawka do systemu podawania strzykawki	Becton, Dickinson and Company	309604	Strzykawka z końcówką Luer lock bez igły, 100 sztuk w opakowaniu http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp
Rurka cewnika do systemu podawania strzykawki	Becton, Dickinson and Company	427451	Rurka polietylenowa (niesterylna) (PE 240) 100' http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp
Igła do systemu dostarczania strzykawki	Becton, Dickinson and Company	427560	Igła o rozmiarze 15, pasuje do rurki cewnika PE 240 http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp
Pręt z żywicy acetalowej Delrin do systemu dostarczania strzykawki	McMaster-Carr	8576K15	o średnicy 1/2 cala, http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf
Folia akrylowa do podnośnika nożycowego	Ponoko		Laser cut http://www.ponoko.com
Drukowana w 3D rama ABS	Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri
Pręty mosiężne do podnośnika nożycowego	Amazon	TTRB-03-12-03	wykonane w osiach http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M
Prowadnica do szuflady do podnośnika nożycowego	Richelieu	10292G116	Mocowany do podstawy podnośnika nożycowego http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754
28BYJ-48 silnik krokowy do podnośnika			po 2
ULN2003 Układ tranzystorów Darlington do podnośnika nożycowego	Toshiba	ULN2003APG	Używany jako sterowniki krokowe (po 2 szt
ATTINY85 mikrokontroler do podnośnika nożycowego	Atmel	ATTINY85-20PU	2 każda http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html
Nylonowa przekładnia czołowa	McMaster-Carr	57655K34	2 każda http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz
Nylonowa zębatka czołowa	McMaster-Carr	57655K62	2 każda http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9
4-40 nylonowe maszynowe	McMaster-Carr	95133A315	Zespół podnoszenia http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q
4-40 nylonowe nakrętki sześciokątne	McMaster-Carr	94812A200	Zespół podnośnika http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29
O-ring Buna-N AS568A Deska rozdzielcza nr 104	McMaster-Carr	9452K318	Zespół podnośnika http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7

nożycowego