Adaptacja metod badania wideofluoroskopowego jaskółki u ludzi do wykrywania i charakteryzowania dysfagii w modelach choroby myszy

Podsumowanie

To badanie z powodzeniem zaadaptowało metody ludzkiego wideofluoroskopowego badania połykania (VFSS) do użycia z modelami chorób mysich w celu ułatwienia badań nad dysfagią translacyjną.

Streszczenie

To badanie zaadaptowało metody ludzkiego wideofluoroskopowego połykania (VFSS) do użycia z modelami choroby mysiej w celu ułatwienia badań nad dysfagią translacyjną. Pomyślne wyniki zależą od trzech krytycznych elementów: komór testowych, które umożliwiają samodzielne karmienie w pozycji stojącej bez ograniczeń w ograniczonej przestrzeni, przepisów, które maskują awersyjny smak/zapach dostępnych na rynku doustnych środków kontrastowych oraz protokołu testowego krok po kroku, który pozwala na ilościowe określenie fizjologii połykania. Wyeliminowanie jednego lub więcej z tych składników będzie miało szkodliwy wpływ na wyniki badania. Co więcej, poziom energii systemu fluoroskopowego określi, które parametry połykania mogą być badane. Większość ośrodków badawczych posiada fluoroskopy o wysokiej energii przeznaczone do użytku z ludźmi i większymi zwierzętami, co skutkuje wyjątkowo niską jakością obrazu podczas testowania myszy i innych małych gryzoni. Pomimo tego ograniczenia zidentyfikowaliśmy siedem parametrów VFSS, które są konsekwentnie kwantyfikowalne u myszy przy użyciu fluoroskopu o wysokiej energii w połączeniu z nowym mysim protokołem VFSS. Niedawno otrzymaliśmy niskoenergetyczny system fluoroskopii o wyjątkowo wysokiej rozdzielczości obrazowania i możliwościach powiększenia, który został zaprojektowany do użytku z myszami i innymi małymi gryzoniami. Wstępne prace z wykorzystaniem tego nowego systemu, w połączeniu z nowym mysim protokołem VFSS, zidentyfikowały 13 parametrów jaskółki, które są konsekwentnie kwantyfikowalne u myszy, co stanowi prawie dwukrotnie większą liczbę niż uzyskano przy użyciu konwencjonalnych (tj. wysokoenergetycznych) fluoroskopów. Identyfikacja dodatkowych parametrów jaskółki jest oczekiwana w miarę optymalizacji możliwości tego nowego systemu. Dotychczasowe wyniki wskazują na użyteczność stosowania systemu fluoroskopowego o niskiej energii do wykrywania i ilościowego określania subtelnych zmian w fizjologii jaskółki, które w przeciwnym razie mogłyby zostać przeoczone podczas korzystania z fluoroskopów o wysokiej energii do badania modeli chorób myszy.

Wprowadzenie

Dysfagia (upośledzenie połykania) jest częstym objawem wielu schorzeń dotykających ludzi w każdym wieku. Przykłady obejmują udar, chorobę Parkinsona, chorobę Alzheimera, porażenie mózgowe, dystrofię mięśniową, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), chorobę Battena, raka głowy i szyi, przedwczesny poród i zaawansowane starzenie się. Dysfagia jest silnie skorelowana ze śmiertelnością, zazwyczaj w wyniku ciężkiego niedożywienia lub zapalenia płuc, które rozwija się, gdy do płuc zasysany jest obciążony bakteriami pokarm/płyn/ślina^1-4. Ten wyniszczający i zagrażający życiu stan chorobowy dotyka ponad 15 milionów ludzi każdego roku w samych Stanach Zjednoczonych³. Pomimo wysokiego rozpowszechnienia i związanych z tym negatywnych skutków, obecne opcje leczenia dysfagii ograniczają się do podejść paliatywnych (a nie leczniczych), takich jak modyfikacja diety (np. unikanie określonych konsystencji pokarmów/płynów), zmiany postawy (np. podwijanie podbródka podczas połykania), podejścia motoryczne (np. ćwiczenia ukierunkowane na mięśnie jamy ustnej, gardła i krtani), podejścia sensoryczne (np. wdrażanie stymulacji smakowej, temperatury i/lub mechanicznej) oraz karmienie przez zgłębnik (np. odżywianie i nawodnienie podawane przez zgłębnik nosowo-żołądkowy (NG) lub przezskórną endoskopową gastrostomię (PEG)). Terapie te służą jedynie jako terapia objawowa, a nie są ukierunkowane na podstawowe przyczyny problemu. Rzeczywiście, główną przeszkodą w odkrywaniu nowych, skutecznych metod leczenia dysfagii jest ograniczona wiedza naukowa na temat odpowiedzialnych za nią mechanizmów patologicznych, które prawdopodobnie są różne dla każdej choroby.

Diagnoza dysfagii jest głównie dokonywana za pomocą procedury radiograficznej zwanej wideofluoroskopowym badaniem połykania (VFSS), znanym również jako zmodyfikowane badanie połykania baru. W ciągu ostatnich ponad 30 lat ten test diagnostyczny został uznany za złoty standard w ocenie funkcji połykania^5-7. Test ten polega na tym, że pacjent siedzi lub stoi w obrębie wiązki promieniowania rentgenowskiego urządzenia do fluoroskopii, dobrowolnie spożywając pokarmy i płyny zmieszane z doustnym środkiem kontrastowym, zwykle siarczanem baru^8,9 lub joheksolem¹⁰. Gdy pacjent połyka, pokarm i płyn zawierający środek kontrastowy mogą być widoczne w czasie rzeczywistym na monitorze komputerowym podczas podróży z ust do żołądka. Struktury tkanek miękkich są również widoczne i można je ocenić w odniesieniu do struktury i funkcji. Pacjenci są proszeni o wykonanie kilku połknięć każdego pokarmu i konsystencji płynu, z których wszystkie są nagrywane na wideo w celu późniejszego oglądania i analizy klatka po klatce w celu ilościowego określenia obecności i stopnia dysfagii. Zazwyczaj analizowane są liczne fizjologiczne składniki połykania, takie jak anatomiczny punkt spustowy połykania gardłowego, czas przejścia bolusa przez gardło i przełyk, zakres i czas trwania uniesienia krtani, lokalizacja i ilość pozostałości po połknięciu oraz występowanie i fizjologiczna przyczyna aspiracji^7,11.

Aspekty ludzkiego protokołu VFSS zostały niedawno dostosowane do badania swobodnie zachowujących się szczurów; jednak wyniki były ograniczone, ponieważ szczury nie pozostawały w polu widzenia wideofluoroskopowego podczas testowania¹². VFSS nie był wcześniej próbowany na myszach. Udana adaptacja ludzkiego protokołu VFSS do użytku z myszami i szczurami dostarczyłaby nowej metody badawczej do zbadania setek obecnie istniejących mysich (mysich i szczurzych) modeli chorób, o których wiadomo, że powodują dysfagię u ludzi. Ta nowa metoda (odtąd nazywana mysim VFSS) przyspieszyłaby zatem identyfikację i walidację mysich modeli dysfagii, które są odpowiednie do badania podstawowych mechanizmów neurofizjologicznych w mięśniach, nerwach i tkance mózgowej, które są patologiczne i przyczyniają się do dysfagii u ludzi. Co więcej, mysi VFSS pozwoliłby na identyfikację obiektywnych miar (biomarkerów) funkcji/dysfunkcji połykania, które można by bezpośrednio porównać z ludźmi. Te międzygatunkowe biomarkery wideofluoroskopowe mogą następnie służyć jako nowe miary wyników do ilościowego określania skuteczności leczenia w badaniach przedklinicznych na myszach i szczurach, co lepiej przełożyłoby się na badania kliniczne z udziałem ludzi.

W tym celu ustanowiono mysi protokół VFSS przy użyciu ~100 myszy obu płci. Wszystkie myszy były albo szczepami C57, albo hybrydowymi szczepami C57/SJL. Myszy C57 nie były genetycznie zmienione, podczas gdy C57 / SJL był szczepem tła dla kolonii transgenicznych myszy SOD1-G93A (lub SOD1), najczęściej stosowanego modelu zwierzęcego ALS. Kolonia SOD1 była w przybliżeniu mieszanką 50-50 myszy transgenicznych (tj. dotkniętych ALS) i nietransgenicznych (tj. niedotkniętych chorobą) rodzeństwa z miotu.

Mysi protokół VFSS składa się z trzech komponentów:

1. specjalnie zaprojektowane komory obserwacyjne, które umożliwiają dobrowolne karmienie i połykanie w pozycji stojącej bez skrępowania w zamkniętej przestrzeni wewnątrz urządzenia do fluoroskopii,
2. receptury, które maskują awersyjny smak/zapach doustnych środków kontrastowych i wytwarzają wystarczającą gęstość promieniowania, aby umożliwić odpowiednią wizualizację połykania,
3. Protokół testowy krok po kroku, który maksymalizuje przestrzeganie zaleceń przez zwierzęta, minimalizuje całkowity czas badania i narażenie na promieniowanie oraz umożliwia ilościowe określenie kilku parametrów połykania dla każdego etapu połykania (tj. ustnego, gardłowego i przełyku).

Połączony efekt tworzy komfortowe, mało stresujące, samodzielne środowisko do badania, które pozwala na ocenę typowych zachowań myszy podczas karmienia i połykania.

Protokół

Mysi protokół VFSS jest zgodny z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) oraz wytycznymi NIH.

1. Zbuduj komory obserwacyjne z rurek i folii poliwęglanowej (Rysunek 1)

1. Kwadratowe rurki poliwęglanowe o szerokości 5 cm (grubość ścianki ~2 mm) pociąć na odcinki 16 cm za pomocą frezarki ręcznej. Większość myszy odpowiednio mieści się w tych wymiarach, co skutkuje wąską komorą testową, która umożliwia chodzenie i obracanie się zgodnie z życzeniem. Grubość ścianki ~2 mm zapewnia odpowiednią sztywność bez znacznego tłumienia wiązki promieniowania rentgenowskiego.
   1. W tym protokole niezbędne są dwa rodzaje komór: "rurki wylewkowe", przeznaczone do dostarczania cieczy przez wylewkę, oraz "rurki wentylacyjne", przeznaczone do dostarczania płynów za pomocą miski kołkowej.
      1. W przypadku "rurek z wylewką" wykonaj mały podłużny otwór (12 x 8 mm) w górnej części każdej rurki w pobliżu jednego końca za pomocą ręcznej frezarki. Ten otwór służy do dostarczania roztworów do picia przez wylewkę rurki rozsączającej podczas warunkowania behawioralnego i testów VFSS.
      2. W przypadku "rurek wentylacyjnych" wywierć 9 małych otworów wentylacyjnych w górnej części każdej rurki w pobliżu jednego końca. Ta rurka jest używana podczas testów VFSS z miską kołkową zamiast rurki sipperowej.
      3. Możliwe jest użycie rurek wylewowych podczas dostarczania płynu przez miskę na kołki, jednak otwór w suficie komory musi być zablokowany, aby zapobiec rozpraszającym zachowaniom eksploracyjnym myszy (patrz krok 6.2.2).
2. Pokrój folię poliwęglanową (grubość 3/4") na zaślepki (50 x 50 mm, 2 na tubę) za pomocą frezarki komputerowej, zwanej również maszyną sterowaną numerycznie (CNC).
   1. Frezować jeden podłużny rowek (19 x 6 mm) w pobliżu jednej krawędzi wewnętrznej powierzchni każdej zaślepki. Użyj tego rowka, aby zabezpieczyć miskę na kołki, z której myszy mogą pić podczas testów VFSS.
   2. Wyfrezuj 5 okrągłych otworów wentylacyjnych (średnica 6 mm) przez każdą zaślepkę.
   3. Wyfrezuj jeden mniejszy okrągły otwór (średnica 5 mm) przez zaślepkę, bezpośrednio nad podłużnym rowkiem. Użyj tego otworu, aby dostarczyć płyn do miski kołka podczas testowania VFSS.
   4. Na zewnętrznej powierzchni zaślepki wyfrezuj pogłębiacz o średnicy 9/16" o głębokości 1/4 cala wokół tego mniejszego otworu.
   5. Wyfrezuj 2 mm wzdłuż obwodu wewnętrznej powierzchni zaślepki końcowej na głębokość 7 mm, aby wykonać stopień, który łatwo wsuwa się w koniec rury.
   6. Frezuj rowek o średnicy 1 mm w stopniu zaślepki, aby pomieścić pierścień uszczelniający o przekroju okrągłym, który jest niezbędny, aby zapobiec wypadnięciu zaślepki z końca rury.
   7. Zaokrąglij odsłonięte krawędzie i ukosuj wszystkie rogi zaślepek, aby zapobiec gryzieniu przez myszy.
3. Wykonaj miski na kołki z folii poliwęglanowej za pomocą maszyny CNC. Wymiary całkowite powinny wynosić 24 x 19 x 6 mm^{3 ,} z wgłębieniem w kształcie misy 10 x 3 mm² na jednym końcu. Do każdej rurki potrzebna jest jedna miska na kołki. Miseczki na kołki powinny dobrze wsunąć się w podłużny rowek w zaślepkach końcowych (Rysunek 2).

Rysunek 1: Komory obserwacyjne. Komory obserwacyjne zostały zaprojektowane tak, aby utrzymać swobodnie zachowujące się zwierzęta w polu widzenia fluoroskopii. Zdjęcia te przedstawiają elementy komory niezbędne do prowadzenia VFSS. Góra: "rurka wylewkowa", przeznaczona do dostarczania płynów przez wylewkę. Dół: "rura wentylacyjna", przeznaczona do dostarczania płynów za pomocą cybu kołkowego. Dwie zaślepki są wymienne między wylewką a rurkami wentylacyjnymi.

Rysunek 2: Miski na kołki. Każda miska na kołki zatrzaskuje się w rowku w wewnętrznej powierzchni każdej zaślepki. Po lewej: niezmontowane komponenty. Środek: zmontowane komponenty. Po prawej: zewnętrzna powierzchnia zaślepki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Zbuduj butelki z rurkami do ssania z probówek wirówek, silikonowych korków i metalowych wylewek (Rysunek 3)

1. Użyj świdra korkowego (5/16"), aby zrobić środkowy otwór przez każdy silikonowy korek.
2. Nałóż kilka kropel oleju mineralnego do otworu wiertniczego i ręcznie włóż metalowy dziobek do szerokiego końca korka. Preferowane są proste wylewki kulkowe, ponieważ proste, otwarte wylewki powodują nadmierne przeciekanie i rozpryskiwanie środka kontrastowego w komorze obserwacyjnej, co może zakłócać wizualizację podczas testowania.
3. Wyreguluj długość dziobka tak, aby rozciągała się na całej długości silikonowego korka i wystawała około 3 cm poza szeroki koniec korka.
4. Włożyć wąski koniec każdego korka (zawierającego probówkę do siku) do probówki wirówkowej o pojemności 30 ml.
5. Sprawdź, czy długość wylewki jest odpowiednia, wkładając ją przez podłużny otwór w górnej części komory obserwacyjnej. Końcówka wylewki powinna spoczywać około 1 cm od sufitu komory, który jest wystarczająco długi, aby zdrowe dorosłe myszy mogły do niego dotrzeć.
   UWAGA: Dłuższe długości powodują, że myszy piją podczas obracania/przechylania głowy, co zasłania wizualizację połykania podczas VFSS.
6. Wydłuż długość dziobka, aby pomieścić młodsze myszy, mniejsze szczepy myszy i modele chorób myszy, które nie mogą dotrzeć do wylewki z powodu upośledzenia motorycznego kończyn.
7. Umyj nowo wykonane wylewki przed użyciem, aby usunąć olej mineralny, zanieczyszczenia silikonowe i inne zanieczyszczenia podczas obsługi.

Rysunek 3: Butelki z rurką do ssania. Po lewej: niezmontowane komponenty. Środek: zmontowane komponenty. Po prawej: mysz pijąca z rurki sipper w komorze obserwacyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Zbuduj system dostarczania strzykawki do użytku z miską na kołki (Rysunek 4)

1. Za pomocą tokarki wykonaj adaptery do łączenia rurek z polietylenu (PE) z zaślepkami komory obserwacyjnej, opisanymi poniżej.
   1. Pokrój pręt z żywicy acetalowej o średnicy 1/2" na odcinki o długości 1 1/4", zwane tutaj adapterami rur (lub adapterami).
   2. Na jednym końcu każdego adaptera zmniejsz odcinek o długości 1/2" na końcówce do średnicy 3/16", zwanej tutaj wąskim końcem.
   3. Dla pozostałej sekcji o długości 3/4" każdego adaptera (tj. końcówki o średnicy 1/2"), należy obrobić rowki do ręcznego chwytania podczas użytkowania. Ta sekcja jest tutaj określana jako szeroki koniec.
   4. W szerokim końcu każdego adaptera wywierć środkowy otwór o średnicy 0.098 cala i głębokości 1 cala.
   5. Wywierć i rozwierc pozostałą część środkowego otworu w każdym adapterze na 0.096 cala, aby zapewnić dokładne dopasowanie do rurki PE.
2. Przyciąć rurkę PE (PE 240, średnica wewnętrzna 1,67 mm) na żądaną długość za pomocą nożyczek. Długość 3-4 stóp wystarczająco zwiększa odległość między badaczem a fluoroskopem podczas badania VFSS, aby poprawić bezpieczeństwo przed promieniowaniem.
   UWAGA: Dłuższe dawki będą wykorzystywać większą objętość roztworu środka kontrastowego podczas testów VFSS, być może większą niż standardowa receptura 30 ml.
3. Włóż igłę 15 G z końcówką całkowicie do jednego końca rurki PE. Oprawa powinna być dobrze dopasowana.
4. Włóż drugi (wolny) koniec rurki PE przez środkowy otwór rurki adaptera, zaczynając od szerokiego końca.
5. Wyciągnij rurkę PE z wąskiego końca adaptera tak, aby wystawała na ~2 mm.
6. Włóż wąską końcówkę adaptera (z wystającą z niej rurką PE ~2 mm) do zaślepki rurki obserwacyjnej; powinna ona ściśle przylegać do pogłębionego otworu znajdującego się bezpośrednio nad miską kołka.
7. Wyreguluj długość rurki PE na wąskim końcu adaptera tak, aby ledwo wystawała ponad wgłębienie miski w misce kołka.
8. Napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml (bez dołączonej igły) wodą ze zlewki i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
9. Przymocować napełnioną strzykawkę do końcówki igły rurki PE.
10. Powoli wcisnąć tłok strzykawki, aby wprowadzić wodę do miski na kołki w komorze obserwacyjnej. Zatrzymaj się, gdy miska na kołki jest prawie pełna. Unikaj przepełnienia, które spowoduje rozpryskiwanie się podczas picia.
11. Jeśli miska na kołki nie napełnia się prawidłowo, wyreguluj długość rurki PE wystającej ponad miskę na kołki.
12. Nadmierne wydłużenie rurki PE zachęci myszy do żucia jej podczas testów, zamiast picia z miski na kołki.
13. Jeśli rurka PE nie zostanie wystarczająco wysunięta, płyn będzie spływał na podłogę komory obserwacyjnej, zamiast wypełniać miskę kołkową.
14. Po użyciu należy odłączyć strzykawkę i umyć cały system podawania strzykawki wodą z mydłem. Użyj strzykawki o pojemności 10 ml, aby przepchnąć powietrze przez rurkę PE w celu usunięcia wody. W razie potrzeby sterylizować w autoklawie.

Rysunek 4: System podawania strzykawki. Po lewej: niezmontowane komponenty. Środek: zmontowane komponenty. Po prawej: mysz pijąca z cybucha w komorze obserwacyjnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Zbuduj zmotoryzowany podnośnik nożycowy do zdalnego pozycjonowania komory obserwacyjnej (Rysunek 5)

1. Zbuduj podnośnik nożycowy z platformą o wymiarach 12 x 12 cm, którą można podnosić i opuszczać o 5 cm, aby pomieścić myszy oglądające w różnych pozycjach w polu widzenia fluoroskopii. Materiał podnośnika powinien być metalowy lub plastikowy, aby ułatwić czyszczenie środkami dezynfekującymi.
2. Zamontuj silniki krokowe, aby wyregulować wysokość i położenie wzdłużne podnośnika.
3. Sprzęgnij pierwszy silnik krokowy z mechanizmem podnośnika nożycowego, aby kontrolować wysokość poprzez przesunięcie poprzeczki. To sprzęgło może być śrubą pociągową lub przekładnią zębatkową.
4. Sprzęgnij drugi silnik krokowy z ramą podnośnika nożycowego, aby kontrolować położenie wzdłużne poprzez przesunięcie całej ramy podnośnika względem stołu. To sprzęgło może być śrubą pociągową lub przekładnią zębatkową.
5. Podłącz system zdalnego sterowania do silników krokowych, aby umożliwić regulację położenia komory obserwacyjnej podczas obrazowania, jednocześnie minimalizując narażenie badacza na promieniowanie.
6. Interfejs: ręczne przyciski zdalnego sterowania z chipem mikrokontrolera do sterowania aktywacją i kierunkiem każdego silnika krokowego.

Rysunek 5: Zdalnie sterowany podnośnik nożycowy. Po lewej: widok z boku podnośnika nożycowego. Po prawej: stół podnośny z komorą obserwacyjną umieszczoną we fluoroskopie. Podnośnik stołu dostosowuje położenie komory obserwacyjnej, aby utrzymać myszy w polu widzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Przeprowadź warunkowanie behawioralne przed testami VFSS, aby zapewnić maksymalne uczestnictwo

.

1. Na 1-2 tygodnie przed badaniem VFSS poddaj myszy jednemu nocnemu (12-16 godzin) okresowi regulacji wody w celu wywołania pragnienia, podczas którego woda jest wstrzymywana z klatki domowej. Celem regulacji wody jest, aby zwierzęta były spragnione, a nie odwodnione. Zwierzęta powinny pozostać czujne i reagować. Ten czas trwania i ramy czasowe są niezbędne, aby zapobiec odwodnieniu, które może wystąpić w wyniku 2 epizodów regulacji wody w ciągu 1 tygodnia (tj. Jeden w celu warunkowania behawioralnego, a drugi w przypadku testów VFSS).
2. Umieść pojedynczą "rurkę dziobkową" (z jednym końcem zamkniętym zaślepką) na podłodze domowej klatki zawierającej świeżą ściółkę. Zamknięty koniec powinien znajdować się najbliżej otworu wylewki w suficie studzienki. Ten krok zapewnia odpowiednią wentylację, podczas gdy wiele myszy śpi skulonych w głębi komory przez noc. Otwarty koniec pozwala myszom swobodnie wchodzić/wychodzić z komory.
3. Usuń inne materiały wzbogacające (np. gniazdo i chatę), aby zachęcić myszy do eksploracji i spania w komorze przez noc (ryc. 6). Ten krok zapewnia, że myszy są przyzwyczajone do przebywania w komorze przez długi czas przed testem VFSS.
4. Na podłodze klatki należy położyć jedną standardową granulkę pokarmu na mysz do jedzenia w nocy; nie należy dostarczać wody ani innych źródeł nawodnienia.
5. Użyj standardowej pokrywy filtra, aby zatrzymać myszy w klatce na noc, ponieważ wymiary komory obserwacyjnej uniemożliwiają zmieszczenie się w klatce standardowej pokrywy drucianej. Przechowuj zdjętą drucianą pokrywę (zawierającą butelkę z jedzeniem i wodą) na górze filtra, aby obciążyć pokrywę i zapobiec ucieczce myszy.
6. Następnego ranka wykonaj test smakowitości, opisany w następujący sposób.
   1. Przygotować roztwór testowy o smaku czekoladowym w 30 ml butelce z rurką do łykania, bez dodawania środka kontrastowego (tj. zastąpienia joheksolu wodą). Przepis ten opisano w tabeli 1. Przygotuj jedną butelkę na klatkę do testu.
   2. Wyjmij komorę obserwacyjną i załóż standardową pokrywę z drutu. Oferuj roztwór o smaku czekoladowym (temperatura pokojowa, ~22 °C) przez 2 minuty na klatkę, włożony przez drucianą pokrywkę.
   3. Oceń smakowitość, obserwując zachowania związane z piciem podczas 2-minutowego okresu testowego.
   4. Oceń smakowitość według następujących kryteriów:
      1. Opóźnienie do momentu, gdy pierwsza mysz napije się z dziobka przez co najmniej 5 sekund bez przerwy.
      2. Procent myszy w klatce, które piją roztwór.
      3. Liczba myszy, które jednocześnie piją z dziobka.
   5. Roztwór uważa się za smaczny, jeśli większość myszy w każdej klatce ma wiele długich (>5 sek.) napadów picia i jeśli wiele myszy jednocześnie pije z dziobka (ryc. 7).
   6. Jeśli roztwór o smaku czekoladowym nie jest smaczny, powtórz testy smakowitości z innymi wzmacniaczami smaku w różnych stężeniach, aby zidentyfikować jeden preferowany roztwór.
   7. Oferuj do czterech różnych roztworów (w różnych stężeniach) pojedynczo w losowej kolejności wielu klatkom myszy w ciągu jednego dnia testowego, bez okresu wymywania lub roztworu wymłukiwania. Odpowiednie wzmacniacze smaku do rozważenia dla myszy to cukier, ser, masło orzechowe, różne smaki owocowe i orzechowe oraz mleko.
      UWAGA: Nie wykonuj testów smakowitości częściej niż raz w tygodniu, aby zapobiec odwodnieniu spowodowanemu powtarzającymi się epizodami regulacji wody.
   8. Może minąć kilka tygodni, zanim uda się zidentyfikować preferowane rozwiązanie dla każdego szczepu myszy. Celem jest zidentyfikowanie potencjalnych smaków, które powodują wiele długich (>5 sek.) napadów picia przez myszy natychmiast (<30 sek.) po ekspozycji, ponieważ kwalifikacje te są uważane za niezbędne do uzyskania pomyślnych wyników VFSS.
7. Po zidentyfikowaniu preferowanego roztworu smakowego, zwróć komorę obserwacyjną do każdej klatki domowej, aby kontynuować warunkowanie behawioralne, opisane w następujący sposób.
   1. Przymocuj jedną zaślepkę do komory obserwacyjnej na końcu najbliżej owalnego otworu (wylewki).
   2. Podawaj myszom roztwór o smaku czekoladowym przez 2-3 godziny, wkładając butelkę z rurką do łykania przez owalny otwór w górnej części komory. Ten krok zapewnia, że wszystkie myszy zostały przyzwyczajone do picia głęboko w komorze obserwacyjnej.
   3. Zdejmij drucianą pokrywę, aby pomieścić komorę obserwacyjną.
   4. Umieść 1 granulkę pokarmu na mysz na podłodze klatki do spożycia ad libitum w okresie testowym.
   5. Przykryj klatkę standardowym filtrem, aby zapobiec ucieczce myszy przez pozostałą część okresu warunkowania behawioralnego. Przechowuj zdjętą drucianą pokrywę (zawierającą butelkę z żywnością i wodą) na górze filtra, aby obciążyć pokrywę.
8. Zapewnij wodę i pożywienie ad libitum w klatce domowej, gdy warunkowanie behawioralne zostanie zakończone.
9. Umyć komory obserwacyjne (probówki i zaślepki) oraz butelki z probówkami (dziobki i probówki wirówkowe) wodą z mydłem; w razie potrzeby wysterylizować w autoklawie. Unikaj używania acetonu do czyszczenia probówek, ponieważ powoduje on trwały efekt zmętnienia, który sprawia, że rurka jest nieprzezroczysta, a nie przezroczysta.

Ryc. 6: Myszy eksplorujące komory obserwacyjne. Myszy są naturalnie skłonne do szukania schronienia w małych przestrzeniach. W rezultacie swobodnie wchodzą i eksplorują tubę obserwacyjną, gdy jest ona umieszczona w klatce domowej. Większość myszy śpi w komorze rano. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

SKŁADNIKI	Roztwór czekolady (do badania smakowitości)	Iohexol o smaku czekoladowym (do testów VFSS)
Syrop czekoladowy	Pojemność 3 ml	Pojemność 3 ml
Iohexol (350 mg jodu/ml)	Ilość 0 ml	Pojemność 15 ml
Woda (DI lub filtrowana)	Dostosować do 30 ml końcowej objętości (27 ml)	Dostosować do 30 ml końcowej objętości (12 ml)
Ostatni tom	Pojemność 30 ml	Pojemność 30 ml

Tabela 1: Roztwór testowy o smaku czekoladowym preferowany przez szczepy myszy C57 i C57/SJL.

Rysunek 7: Badanie smakowitości. Jednym ze wskaźników preferencji smakowych podczas badania smakowitości jest liczba myszy, które jednocześnie piją z jednego dziobka w domowej klatce. To zdjęcie przedstawia cztery myszy jednocześnie pijące roztwór o smaku czekoladowym, który został zidentyfikowany jako preferowany wzmacniacz smaku przez szczepy C57 i C57/SJL.

6. Przygotowanie do testów VFSS

1. Poddaj myszy nocnemu okresowi regulacji wody (tj. wstrzymaj wodę przez 12-16 godzin), jak opisano w kroku 5 powyżej.
   1. Umieść pojedynczą rurkę wentylacyjną (z jednym końcem zamkniętym zaślepką) na podłodze domowej klatki zawierającej świeżą ściółkę. Zamknięty koniec powinien znajdować się najbliżej otworów wentylacyjnych w suficie komory. Ten krok zapewnia odpowiednią wentylację, podczas gdy wiele myszy śpi skulonych w głębi komory przez noc. Otwarty koniec pozwala myszom swobodnie wchodzić/wychodzić z komory.
2. Następnego ranka wyjmij zabrudzone komory obserwacyjne z klatek i krótko spłucz wodą z kranu i całkowicie wysusz, przygotowując się do badania VFSS.
   1. Wyjmuj i czyść tylko jedną komorę na raz, aby zapobiec mieszaniu się komór między klatkami, co może powodować nadmierne zachowania eksploracyjne, które znacznie zakłócają testowanie VFSS.
   2. Jeśli do testowania VFSS używane są "rurki wylewowe" zamiast "rurek wentylacyjnych", włóż silikonową zatyczkę do otworu wylewki w suficie komory obserwacyjnej, aby zapobiec zachowaniom eksploracyjnym (rysunek 8).
   3. Oznacz każdą komorę (np. numerem klatki domowej), aby zapobiec pomieszaniu.
      UWAGA: Użyj markera suchościeralnego, aby oznaczyć każdą oczyszczoną tubkę przed umieszczeniem jej z powrotem w klatce domowej. Należy unikać markerów permanentnych, ponieważ są one wchłaniane przez materiał tubki i nie zmywają się, nawet alkoholem lub acetonem.
3. Przygotuj roztwór joheksolu o smaku czekoladowym (lub inny smaczny roztwór).
   1. Sporządzić pojedynczą recepturę (30 ml) roztworu badanego (tabela 1) dla kilku klatek.
   2. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE IOHEKSOLU: Nieotwarte butelki z joheksolem należy przechowywać w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Otwarte butelki z ioheksolem należy zużywać w ciągu 24 godzin, ponieważ lepkość i smak mogą ulec zmianie w ciągu około jednego dnia po wystawieniu na działanie powietrza. Alternatywnie, zamrozić porcje pojedynczych porcji (15 ml) w probówkach wirówkowych w celu długotrwałego przechowywania. Przygotowane roztwory testowe joheksolu należy zużyć w ciągu kilku godzin, aby zapewnić świeżość i zapobiec unikaniu przez myszy. Roztwory joheksolu należy podawać w temperaturze pokojowej, aby uniknąć zakłóceń w badaniu ze względu na wpływ temperatury na czynność połykania. Nie zamrażać pozostałego przygotowanego roztworu testowego, ponieważ smak czekolady staje się gorzki po zamrożeniu i powoduje unikanie go przez myszy.
4. Przygotuj środowisko do fluoroskopii.
   1. Użyj zapasowej (pustej) komory obserwacyjnej i miski na kołki (lub wylewki rurki sipper), aby określić optymalną wysokość i położenie w wiązce fluoroskopu, która umożliwia wizualizację picia w płaszczyźnie bocznej (poziomej).
   2. Ustaw liczbę klatek na sekundę fluoroskopii na 30 klatek na sekundę; można użyć wyższej (ale nie niższej) liczby klatek na sekundę, jeśli są dostępne.
   3. Upewnij się, że nieprzepuszczalny dla promieni rentgenowskich znacznik kalibracyjny jest odpowiednio umieszczony na kamerze/detektorze fluoroskopowym, tak aby był widoczny na monitorze wyświetlacza podczas całego testu. Etap ten jest niezbędny, aby umożliwić kalibrację pomiarów długości stosowanych do ilościowego określania parametrów jaskółki.

Rysunek 8: Silikonowa zatyczka podczas korzystania z misek na kołki. Po lewej: silikonowa zatyczka. Po prawej: Silikonowa zatyczka jest przeciągana przez otwór rurki rozsączającej w górnej części komory obserwacyjnej. Ta wtyczka zapobiega rozpraszaniu się myszy przez otwór wylewki podczas korzystania z miski kołkowej, a nie rurki rozsączającej podczas testów VFSS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Testowanie VFSS na myszach

1. Obserwuj każdą klatkę, aby określić, kiedy mysz swobodnie wchodzi do komory obserwacyjnej.
   1. Wyjmij komorę z klatki i delikatnie załóż 2. zaślepkę (z dołączoną miseczką na kołki, jeśli rurka sipper nie będzie używana), uważając, aby nie przyciąć myszy (zwłaszcza ogona).
      UWAGA: Takie podejście minimalizuje reakcję myszy na stres spowodowany obsługą, co jest szczególnie ważne w przypadku myszy, które są testowane po raz pierwszy.
   2. Dzięki wielokrotnym testom myszy można łatwo nakłonić do wejścia do komory, gdy jest ona umieszczona przed nimi w klatce lub gdy jest zawieszona za ogon nad otworem komory.
2. Umieść komorę obserwacyjną (zawierającą mysz) w maszynie do fluoroskopii, aby rozpocząć badanie VFSS w płaszczyźnie bocznej (tj. poziomej wiązce promieniowania rentgenowskiego).
3. Roztwór joheksolu o smaku czekoladowym (Tabela 1) należy dostarczyć do miski na kołki lub butelki z rurką do łykania.
   1. W przypadku korzystania z miski na kołki, dostarczyć roztwór za pomocą systemu dostarczania strzykawki opisanego w kroku 3 powyżej. System ten umożliwia szybkie i łatwe napełnianie miski na kołki w razie potrzeby.
   2. Jeśli używasz butelki z rurką sympikową, włóż rurkę symfla przez owalny otwór w górnej części komory obserwacyjnej. Przechyl butelkę tak, aby dziobek był skierowany w stronę środka komory.
4. Rozpocznij nagrywanie wideofluoroskopii, gdy mysz zacznie pić.
   1. Wyreguluj położenie komory obserwacyjnej (za pomocą zdalnie sterowanego podnośnika nożycowego opisanego w kroku 4) tak, aby mechanizm połykający był widoczny w polu view.
   2. Wstrzymaj nagrywanie za każdym razem, gdy mysz odwróci się od miski na kołki lub dziobka, aby zminimalizować czas ekspozycji na promieniowanie.
   3. Wznów nagrywanie, gdy mysz powróci do dziobka lub miski na kołki.
   4. W razie potrzeby napełnij miskę na kołki.
   5. Przerwij testowanie, jeśli mysz nie wypije w ciągu 5 minut. Celem jest zarejestrowanie kilku długich (>5 sekund) napadów ciągłego picia, co jest typowe dla większości myszy w ciągu pierwszych 2 minut testowania.
   6. Zwróć myszy niespełniające wymagań do klatki domowej (bez wody) w celu ponownego przetestowania w późniejszym czasie tego samego dnia; nie przekraczaj 24-godzinnego okresu regulacji wody. Myszy, które nie przestrzegają zaleceń w trzech badaniach, są usuwane z badania.
5. W razie potrzeby zmień położenie fluoroskopu, aby przetestować myszy w płaszczyźnie grzbietowo-brzusznej (tj. pionowa wiązka promieniowania rentgenowskiego). Płaszczyzna ta służy do identyfikacji odchyleń w przepływie bolusa przez gardło i przełyk podczas połykania.
6. Podczas testowania wielu myszy z tej samej klatki domowej:
   1. Wyczyść miskę na kołki (i końcówkę rurki PE) lub wylewkę rurki rozsączającej suchym ręcznikiem papierowym między myszami.
   2. W razie potrzeby wyczyść komorę obserwacyjną między myszami, aby usunąć wszelkie rozpryskiwane joheksol ze ścianek komory. Opłucz komorę wodą z kranu i osusz ręcznikiem papierowym.
7. Podczas testowania myszy z innej klatki domowej:
   1. Użyj nowej miski na kołki (lub wymień wylewkę rurki rozsączającej). W przeciwnym razie myszy mogą być rozproszone przez zapach innych myszy, które piły z tej samej miski na kołki lub rurki do sikania. Miski na kołki i rurki do rozsyłania powinny być oznaczone, aby uniknąć nieporozumień.
8. Po zakończeniu testowania wszystkich myszy w jednej klatce, zapewnij wodę i jedzenie w klatce domowej.
9. Umyj komory obserwacyjne (probówki i zaślepki), miski na kołki, system dostarczania strzykawki i butelki z rurkami do strzykawek (dziobki i probówki wirówkowe, jeśli są używane) wodą z mydłem; w razie potrzeby sterylizuj w autoklawie.
10. Wszelkie pozostałe roztwory joheksolu należy usunąć zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa; w większości obiektów dopuszczalne jest usuwanie z odpływu.

8. Analiza wideo

1. Użyj oprogramowania do edycji wideo, które umożliwia analizę klatka po klatce nagrań wideofluoroskopii w celu ilościowego określenia interesujących parametrów połykania (Tabela 2).
2. Wyznacz co najmniej dwóch przeszkolonych weryfikatorów, którzy będą analizować każdy film w sposób niezaślepiony: głównego weryfikatora i jednego lub dwóch dodatkowych weryfikatorów.
   1. Główny recenzent: Obejrzyj każdy film, aby zidentyfikować i przeanalizować 3-5 długich (około 5 sekund) napadów picia. Kryterium to opiera się na opublikowanych nieradiograficznych badaniach połykania na myszach^13,14 i VFSS na szczurach¹², które pokazują, że do analiz statystycznych wystarczy 3 - 5 pomiarów na parametr jaskółki.
   2. Recenzenci dodatkowi: Niezależna analiza 3–5 pomiarów na parametr jaskółki dla każdej myszy, które zostały początkowo zidentyfikowane i przeanalizowane przez głównego recenzenta.
3. Zidentyfikuj rozbieżności między recenzentami dla każdej myszy. Ponownie przeanalizuj wszystkie rozbieżności jako grupa recenzentów, aby osiągnąć 100% konsensusu.
4. Uśrednij 3-5 wartości konsensusu (tj. bezspornych) dla każdego parametru połykania, aby uzyskać średnią wartość dla każdej myszy do wykorzystania w analizach statystycznych. W przypadku uzyskania mniej niż 3 miar dla jednego parametru jaskółki dla danej myszy, należy wprowadzić brakującą wartość (tj. nie zero) w statystycznej bazie danych dla odpowiedniego parametru jaskółki.

PARAMETRY PŁYTKIE	opis
Interwał między połykaniami (ISI)	Liczba klatek wideo pomiędzy dwoma kolejnymi, nieprzerwanymi jaskółkami. Ramką początkową do obliczania ISI jest "klatka spoczynkowa", która bezpośrednio poprzedza widoczne przeniesienie bolusa z zastawek do przełyku. Ramka końcowa jest "ramką spoczynkową" następnej jaskółki. Liczba klatek między dwoma kolejnymi jaskółkami jest następnie dzielona przez 30 klatek na sekundę (fps) w celu przeliczenia na czas (s).
Szybkość wychylania szczęki (ekwiwalent szybkości lizania)	Język nie jest wyraźnie widoczny podczas VFSS, aby umożliwić ilościowe określenie szybkości lizania; jednak szybkość wychylania szczęki jest łatwa do oszacowania. Podczas lizania szczęka musi się otworzyć, aby język mógł wystawać z ust. W związku z tym liczba cykli otwierania/zamykania szczęki (wychylenia) na sekundę (30 klatek) podczas picia jest równoważna szybkości lizania. Każdy cykl ruchu szczęki rozpoczyna się od maksymalnego otwarcia szczęki (co zbiega się z wysunięciem języka) i kończy się, gdy szczęka powróci do pozycji maksymalnie otwartej. Kolejne cykle zamykania i ponownego otwierania szczęki liczone są jako pojedyncze epizody wychylania szczęki.
Odległość wychylenia szczęki	Odległość, na jaką szczęka otwiera się podczas cykli wychylania szczęki, mierzona w mm między siekaczami szczęki i żuchwy.
Stosunek lizania do połykania	Liczba cykli wychylania szczęki, które występują podczas każdego ISI (tj. między dwoma kolejnymi, nieprzerwanymi połknięciami).
Wskaźnik połykania	Liczba połknięć występujących podczas każdego 2-sekundowego epizodu nieprzerwanego picia przy wylewce.
Czas pasażu gardłowego (PTT)	Czas potrzebny do połknięcia bolusa przez gardło. Ramka początkowa jest identyczna z ramką początkową ISI (tj. "ramką spoczynkową", która bezpośrednio poprzedza widoczne przeniesienie bolusa z zastawek). Rama końcowa ma miejsce, gdy ogon bolusa całkowicie minął 2.kręg szyjny (C2), który jest najbardziej oczywistym anatomicznym punktem orientacyjnym w odcinku szyjnym kręgosłupa myszy. Liczba klatek między klatką początkową i końcową jest następnie dzielona przez 30 kl./s i konwertowana na milisekundy (ms).
Bolus Szybkość przez gardło	Szybkość bolusa gardłowego jest mierzona w stosunku do PTT (opisanego powyżej). Za pomocą oprogramowania ImageJ mierzona jest odległość (mm) od kości szczękowej do kręgu C2, skalowana za pomocą znacznika kalibracyjnego. Odległość ta (mm) jest następnie dzielona przez PTT (ms) w celu określenia prędkości bolusa (mm/ms).
Czas pasażu przełykowego (ETT)	Ramka startowa ETT jest identyczna z ramką końcową PTT (opisaną powyżej). Ramka końcowa ETT ma miejsce, gdy bolus całkowicie dostał się do żołądka, co definiuje się jako zniknięcie bolusa z przełyku. Liczba klatek między klatką początkową i końcową ETT jest następnie dzielona przez 30 kl./s i konwertowana na ms.
Szybkość bolusa przez przełyk	Szybkość bolusa przełyku jest mierzona w stosunku do ETT (opisanej powyżej). Za pomocą oprogramowania ImageJ zmierzona odległość (w mm) jest mierzona od kręgu C2 do połączenia żołądkowo-przełykowego, skalowana za pomocą markera kalibracyjnego. Odległość ta (mm) jest następnie dzielona przez ETT (ms) w celu określenia prędkości bolusa (mm/ms).
Szybkość bolusa przez gardło i przełyk	Parametr ten jest używany, gdy C2 nie jest łatwo widocznym anatomicznym punktem orientacyjnym, dlatego nie jest możliwe rozróżnienie między gardłowymi i przełykowymi etapami połykania. W takich przypadkach prędkość bolusa przez gardło i krtań jest łączona w jeden parametr połykania. Ramka początkowa jest identyczna z ramką startową PTT (tj. "ramką spoczynkową", która bezpośrednio poprzedza widoczne przeniesienie bolusa z zastawek). Ramka końcowa jest identyczna z ramką końcową ETT (tj. gdy bolus całkowicie dostał się do żołądka). Liczba klatek między tymi dwoma zdarzeniami jest dzielona przez 30 kl./s i konwertowana na ms.
Obszar bolusa	Za pomocą oprogramowania ImageJ mierzy się obszar bolusa w "ramce spoczynkowej" zastawki przed rozpoczęciem połykania gardłowego, skalując go za pomocą markera kalibracyjnego.
Obszar pozostałości gardłowych	Obszar pozostałości gardłowych jest mierzony za pomocą oprogramowania ImageJ, skalowany za pomocą markera kalibracyjnego.
Objętość spożytego płynu	Objętość płynu spożywanego z butelki z rurką sipper jest trudna do oszacowania ze względu na wyciek z dziobka. Jednak objętość płynu zużytego z miski kołkowej można dokładniej obliczyć w następujący sposób: 1) określić gęstość (tj. stosunek masy do objętości) skalibrowanej objętości płynu, który został podany do miski na kołki, 2) określić wagę miski na kołki zawierającej pozostałą ciecz, 3) wprowadzić te wartości do przelicznika masy na objętość (np. http://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php.

Tabela 2: Parametry jaskółki kwantyfikowalne podczas mysiego VFSS.

Wyniki

Udało nam się zaprojektować nowatorski i powtarzalny protokół VFSS dla myszy, który zawiera komory testowe umożliwiające samodzielne karmienie, przepisy na aromatyzowanie doustnych środków kontrastowych oraz protokół testowy krok po kroku, który pozwala na ilościowe określenie fizjologii jaskółki. Zdolność systemu fluoroskopowego do pomiaru poziomu energii pozwoliła określić, jakie parametry połykania można badać u myszy. Początkowo używaliśmy fluoroskopów o wysokiej energii przeznaczonych do użytku z ludźmi i większymi zwierzętami (np. GE Advantx, GE OEC 9600 i Omega Cardiac Cath CS-25, każdy z prędkością 30 klatek na sekundę). Jednak systemy te miały niewystarczające możliwości powiększenia do testowania myszy, co spowodowało, że zwierzę wypełniło tylko niewielką część pola widzenia (ryc. 9). W efekcie jakość obrazu była wyjątkowo niska, co uniemożliwiało wizualizację większości struktur mechanizmu połykania. Pomimo tego ograniczenia zidentyfikowaliśmy 7 obiektywnych parametrów połykania VFSS, które były konsekwentnie kwantyfikowalne dla myszy przy użyciu konwencjonalnego (tj. Wysokoenergetycznego) fluoroskopu w połączeniu z nowym mysim protokołem VFSS (Tabela 3). Ponadto zidentyfikowaliśmy przestrzeń zastawkową jako anatomiczny punkt spustowy do połykania u zdrowych dorosłych myszy (w wieku 3-17 miesięcy), a także myszy ze stanami zaawansowanego wieku (>18 miesięcy) i schyłkowym stadium ALS.

Rycina 9: Wysokoenergetyczne systemy fluoroskopowe. Po lewej: Reprezentatywny obraz myszy uzyskany przy użyciu wysokoenergetycznych (tj. konwencjonalnych) systemów fluoroskopowych. Należy zauważyć, że mysz wypełnia tylko niewielką część pola widzenia fluoroskopii, demonstrując w ten sposób niewystarczające możliwości powiększenia konwencjonalnych fluoroskopów do obrazowania gryzoni. Po prawej: Ten sam obraz powiększony po przechwyceniu za pomocą programu do edycji wideo. strzałka: punkt spustowy jaskółki (valleculae). Biała strzałka: bolus w dystalnej części przełyku, bezpośrednio przed przejściem przez złącze GE (biała gwiazdka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

PARAMETRY POŁYKANIA	System wysokoenergetyczny	System o niskim zużyciu energii
Interwał między połykaniami (ISI)	Z	Z
Szybkość wychylania szczęki (ekwiwalent szybkości lizania)	Z	Z
Odległość wychylenia szczęki	Z	Z
Stosunek lizania do połykania	Z	Z
Wskaźnik połykania	Z	Z
Czas pasażu gardłowego (PTT)		Z
Bolus Szybkość przez gardło		Z
Czas pasażu przełykowego (ETT)		Z
Szybkość bolusa przez przełyk		Z
Szybkość bolusa przez gardło i przełyk	Z	Z
Obszar bolusa		Z
Obszar pozostałości gardłowych		Z
Objętość spożytego płynu	Z	Z

Tabela 3: Parametry połykania kwantyfikowalne przy użyciu systemów fluoroskopii o wysokiej i niskiej energii.

Niedawno otrzymaliśmy system fluoroskopii o niskiej energii o nazwie The LabScope (Glenbrook Technologies, Randolph, NJ), który został specjalnie zaprojektowany dla naszego laboratorium do użytku z myszami i innymi małymi gryzoniami (Rysunek 10). Jednak znacznie większe powiększenia tego systemu uniemożliwiały oglądanie całego mechanizmu połykania myszy w jednym polu widzenia. Zamiast tego wymagane są dwie pozycje testowe, jak pokazano na rysunku 11. Pozycja 1 umożliwia wizualizację całej głowy i bliższego odcinka piersiowego. Ta pozycja jest niezbędna do oceny etapów połykania w jamie ustnej i gardle. Pozycja 2 umożliwia wizualizację od punktu spustowego połykania (tj. Valleculae) do połączenia żołądkowo-przełykowego (GE). Ta pozycja jest niezbędna do oceny przełykowego etapu połykania. Wstępne prace z wykorzystaniem LabScope w połączeniu z nowym mysim protokołem VFSS zidentyfikowały 13 obiektywnych parametrów połykania, które są konsekwentnie kwantyfikowalne u myszy, co stanowi prawie dwukrotnie większą liczbę niż liczba uzyskana przy użyciu fluoroskopów o wysokiej energii (tj. konwencjonalnych) (Tabela 3). Wynik ten przypisuje się zaawansowanym możliwościom powiększania LabScope, które pozwalają na wizualizację wielu struktur anatomicznych (ryc. 12), które były zasadniczo niewidoczne przy użyciu konwencjonalnych systemów: np. kości gnykowej, tchawicy i kręgów szyjnych. W rezultacie byliśmy również w stanie przeanalizować filmy pod kątem dowodów na penetrację i aspirację krtani. W tym badaniu nie zaobserwowano ani penetracji, ani aspiracji u żadnej myszy, niezależnie od stanu zdrowia lub choroby.

Rysunek 10: LabScope. Po lewej: LabScope pełni funkcję fluoroskopu biurkowego dla małych zwierząt. Po prawej: Zbliżenie na LabScope z oznaczonymi komponentami. Podnośnik nożycowy ustawia komorę obserwacyjną w polu widzenia fluoroskopu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 11: System fluoroskopii o niskiej energii. Obrazy myszy uzyskane przy użyciu systemu fluoroskopowego o niskiej energii. Należy pamiętać, że możliwość dużego powiększenia uniemożliwia wizualizację całego mechanizmu połykania w polu widzenia fluoroskopii. Po lewej: Pozycja 1 – umożliwia wizualizację całej głowy i bliższego odcinka piersiowego. Punkt spustowy jaskółki (strzałka) jest zasadniczo wyśrodkowany w polu widzenia. Po prawej: Pozycja 2 – umożliwia wizualizację od punktu spustowego jaskółki (strzałka) do złącza GE (biała gwiazdka). Zwróć uwagę na bolus przechodzący przez dystalny przełyk (biała strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 12: Struktury anatomiczne widoczne przy użyciu systemu fluoroskopii o niskiej energii. Nawet przy najniższym ustawieniu powiększenia (po lewej) struktury kostne głowy i szyi myszy są łatwo widoczne za pomocą naszego niskoenergetycznego systemu fluoroskopii (tj. LabScope). Struktury anatomiczne w czarnym kwadracie są pokazane (i oznaczone) w większym powiększeniu po prawej stronie. Ulepszona wizualizacja struktur kostnych pozwala na ilościowe określenie kilku dodatkowych parametrów jaskółki, które były niemożliwe do przeanalizowania przy użyciu fluoroskopów o wysokiej energii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Szybkość połykania i odstęp między połknięciami są reprezentatywnymi parametrami VFSS, które mogą być określone ilościowo za pomocą systemów fluoroskopii o niskiej lub wysokiej energii w połączeniu z nowym mysim protokołem VFSS. Te dwa parametry jaskółki określono ilościowo dla trzech grup myszy: myszy transgenicznych SOD1-G93A (SOD1) (tj. Model ALS) w końcowym stadium choroby w wieku 4-5 miesięcy, myszy w wieku C57 (18-24 miesiące) oraz grupa kontrolna zdrowych młodych (4-8 miesięcy) myszy C57 i nietransgenicznych rodzeństwa z kolonii SOD1. Wszystkie dane dotyczą wyłącznie picia wylewki, przy użyciu systemu fluoroskopii o niskiej lub wysokiej energii. Nie stwierdzono istotnych różnic między młodymi myszami C57 a młodymi nietransgenicznymi (kontrolnymi) myszami z kolonii SOD1 w odniesieniu do tych dwóch parametrów jaskółki; w związku z tym dane połączono w ogólną "kontrolną" grupę młodych zdrowych myszy w celu porównania z sędziwymi myszami C57 i myszami w końcowym stadium SOD1. Szybkość połykania (tj. liczba połykań podczas 2 kolejnych sekund nieprzerwanego picia) była znacznie wolniejsza dla myszy SOD1 w porównaniu z wiekowymi myszami C57 i grupą kontrolną. Interwał między połknięciami (tj. czas między dwoma kolejnymi połknięciami) nie różnił się istotnie między grupami. Wyniki te potwierdzają pogląd, że profile dysfagii mogą być wyraźnie różne dla każdego stanu chorobowego (ryc. 13).

Rysunek 13: Wstępne ustalenia. Rysunek ten przedstawia reprezentatywne wstępne wyniki dla dwóch parametrów połykania VFSS określonych ilościowo przy użyciu mysiego protokołu VFSS: szybkość połykania (po lewej) i interwał między połknięciami (po prawej). Szybkość połykania była znacznie wolniejsza u myszy SOD1 w porównaniu ze starszymi myszami C57 i grupą kontrolną. Nie stwierdzono istotnych różnic w grupach w odniesieniu do odstępów między połykaniami. Linie w górnej części słupków wskazują statystycznie istotne różnice (p < 0,05) między grupami, zidentyfikowane za pomocą porównań parami Bonferroniego. Słupki błędów reprezentują ± 1 SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Setki modeli mysich (myszy i szczurów) są dostępne na rynku do badania chorób ludzkich. Jednak tylko trzy modele choroby mysiej zostały specjalnie zbadane w odniesieniu do dysfagii: mysi model ALS^13,14 i szczurzy model choroby Parkinsona^12,15-17 i udar¹⁸. W każdym z tych wstępnych badań wykorzystano różne metodologie oceny dysfagii, co uniemożliwiło uzyskanie znaczących porównań między gatunkami i chorobami. To poważne ograniczenie może zostać przezwyciężone w przyszłych badaniach poprzez wykorzystanie nowo opracowanego mysiego protokołu VFSS, który umożliwia obiektywną kwantyfikację wielu parametrów jaskółki u zwierząt samożywiących się.

Pomyślne wyniki VFSS zależą od trzech krytycznych elementów: 1) komór testowych, które umożliwiają samodzielne odżywianie się w pozycji nieskrępowanej w ograniczonej przestrzeni, 2) receptur, które maskują awersyjny smak/zapach dostępnych na rynku doustnych środków kontrastowych oraz 3) protokołu testowego krok po kroku, który pozwala na ilościowe określenie fizjologii jaskółki. Połączony efekt tworzy komfortowe, bezstresowe, samodzielne środowisko badania, które przywołuje typowe zachowania związane z karmieniem i połykaniem. Wyeliminowanie jednego lub więcej z tych składników będzie miało szkodliwy wpływ na wyniki badania. Przykłady negatywnych skutków obejmują niezdolność do utrzymania zwierząt w polu widzenia fluoroskopii, niepożądane zachowania, które odwracają uwagę od picia, niechęć do doustnego środka kontrastowego oraz niemożność ilościowego określenia parametrów połykania z powodu niewystarczającej liczby epizodów picia.

Dużym wyzwaniem w uzyskaniu optymalnych wyników VFSS było zaprojektowanie odpowiedniej komory testowej. Liczne poprawki naszego prototypowego projektu zakończyły się stworzeniem komory obserwacyjnej, która w wystarczającym stopniu utrzymuje myszy w polu widzenia i zapobiega zachowaniom odwracającym uwagę od picia. Komory zostały wykonane przy użyciu frezarek w celu uzyskania jednolitych wymiarów rur i zaślepek, zapewniając tym samym wymienność komponentów dla kilku komór obserwacyjnych o tej samej średnicy. Wewnętrzne wymiary (średnica i długość) zostały dopasowane tak, aby były nieco większe niż rozmiar ciała dorosłej myszy, co zaowocowało wąską komorą testową, która wystarczająco pozwala na chodzenie w linii prostej i obracanie się. Wąska konstrukcja, w połączeniu ze strategicznym umieszczeniem dziobka i miski na kołku tylko na końcu, utrzymuje głowę i ciało myszy w jednej linii wzdłuż komory podczas picia. Po zaangażowaniu w picie myszy pozostają niezwykle stabilizowane przy dziobku lub misce przez kilka sekund na raz, co skutkuje minimalnym artefaktem ruchu, który zakłóca testy. W ten sposób możliwe jest uzyskanie niezakłóconej, bliskiej obserwacji/zapisu wideo i obrazowania wideofluoroskopowego myszy podczas picia w płaszczyźnie bocznej i grzbietowo-brzusznej.

Myszy (i inne małe gryzonie) są naturalnie skłonne do szukania schronienia w małych przestrzeniach. W rezultacie swobodnie wchodzą do komory testowej (z jednym końcem już zamkniętym zaślepką) po umieszczeniu go w klatce domowej, eliminując w ten sposób stres/niepokój spowodowany obsługą (tj. ręcznym podnoszeniem zwierzęcia w celu umieszczenia go w komorze). Gdy mysz wejdzie do komory, drugi koniec jest zamykany poprzez przymocowanie 2^{. zaślepki} . Taka konstrukcja zapobiega ucieczce, tworząc jednocześnie komorę testową o niskim poziomie lęku, w której myszy mogą swobodnie eksplorować.

Kwadratowy kształt komory zapewnia wbudowaną stabilność ruchu, która pozwala na używanie jej w pozycji wolnostojącej, eliminując w ten sposób potrzebę testowania w standardowej klatce dla gryzoni. Całe urządzenie jest lekkie, przenośne, można je układać w stosy w celu przechowywania, jest wytrzymałe, łatwe do czyszczenia i może być sterylizowane w autoklawie. Chociaż komory zostały początkowo zaprojektowane do użytku z fluoroskopią, są one również kompatybilne z radiografią punktową, neuroobrazowaniem (np. MRI, PET, CT) oraz obserwacją wizualną/nagrywaniem wideo różnych zachowań.

Drugim poważnym wyzwaniem do pokonania było maskowanie awersyjnego smaku/zapachu doustnych środków kontrastowych (tj. siarczanu baru i joheksolu). Biorąc pod uwagę, że wrażliwość smakowa różni się znacznie wśród szczepów myszy w^{wieku 19-21} lat, a być może w wieku^22,23 lat, konieczne było zidentyfikowanie jednego roztworu testowego, który byłby smaczny dla wszystkich myszy, niezależnie od szczepu i wieku. Wynik ten jest niezbędny, aby umożliwić bezpośrednie porównanie funkcji/dysfunkcji jaskółki w różnych szczepach i wieku, przy jednoczesnym wyeliminowaniu mylących wyników wynikających z różnic w właściwościach reologicznych (np . lepkość, gęstość itp.) i chemicznych badanych roztworów. W tym celu opracowaliśmy proste, szybkie podejście do badania przesiewowego smakowitości, aby zidentyfikować preferowany wzmacniacz smaku, aby zamaskować awersyjny smak/zapach doustnych środków kontrastowych podczas mysiego VFSS. Metody zostały wzorowane na teście krótkiej ekspozycji, który wymaga lizometru (tj. czujnika lizania) do rejestrowania szybkości lizania w ciągu pierwszych 2 minut po okresie regulacji wody (tj. wstrzymaniu wody przez noc) w celu wywołania pragnienia^24,25. Lizometr nie był dostępny do tego badania; W związku z tym preferencje oceniono na podstawie obserwacji behawioralnych, a także standardowych metod nagrywania wideo dla szybkości lizania, które zostały wcześniej zwalidowane w naszym laboratorium^13,14. Stosując to podejście do badania smakowitości, czekolada została zidentyfikowana jako preferowany wzmacniacz smaku przez szczepy C57 i C57/SJL. W szczególności 100% myszy w każdej klatce chętnie piło roztwory o smaku czekoladowym w ciągu 30 sekund od ekspozycji, przy czym wiele myszy jednocześnie piło przy wylewce. Jednak dodanie baru powodowało tylko krótkie napady picia u większości myszy, niezależnie od stężenia baru lub czekolady.

Alternatywą dla baru jest joheksol, środek kontrastowy na bazie jodu, który dopiero niedawno został uznany za odpowiednią alternatywę dla siarczanu baru dla ludzkiego VFSS¹⁰; W związku z tym nie został jeszcze ustandaryzowany do tego celu. Myszom zaoferowano kilka różnych stężeń ioheksolu o smaku czekoladowym. Przepisy zawierające do 50% roztworu joheksolu (350 mg jodu na ml) były chętnie spożywane przez większość myszy po całonocnym okresie regulacji wody. Wyższe stężenia skutkowały zachowaniami unikającymi. 50% roztwór joheksolu (350 mg jodu na ml) wytwarzał wystarczającą gęstość promieniowania podczas połykania przez myszy, podczas gdy niższe stężenia były znacznie mniej widoczne i utrudniały ilościowe określenie fizjologii jaskółki. W związku z tym zidentyfikowano optymalne rozwiązanie testowe dla VFSS u myszy, jako 50% roztwór joheksolu z dodatkiem aromatu czekoladowego. Wielokrotne testy smakowitości nie skutkowały zachowaniami unikającymi ani zdarzeniami niepożądanymi.

Trzecim wyzwaniem do pokonania było zapobieganie obracaniu/przechylaniu głowy myszy podczas picia, co zaciemnia wizualizację mechanizmu połykania podczas VFSS. Picie z miski umieszczonej tuż nad podłogą na jednym końcu komory rozwiązało ten problem. Istnieje kilka dodatkowych zalet korzystania z miski na kołki zamiast butelki z rurką do sikania. Na przykład, skalibrowana objętość cieczy może być pipetowana do miski kołkowej przez otwór wentylacyjny w zaślepce rurki obserwacyjnej. Takie podejście pozwala na ilościowe określenie minutowej objętości roztworu testowego zużytego podczas krótkiego czasu trwania badania VFSS. Co więcej, zwiększona powierzchnia badanego roztworu w misce kołka, w porównaniu z małym otworem rurki sipper, może zapewnić zwiększoną stymulację węchową w celu dalszego motywowania do picia. Miski na kołki mogą lepiej nadawać się do badania młodych lub mniejszych szczepów myszy, ponieważ wysokość miski jest ustandaryzowaną odległością od podłogi. W przeciwieństwie do tego, długości rurki sipper muszą być dostosowane, aby pomieścić myszy o różnych rozmiarach, co dodaje kolejną potencjalnie mylącą zmienną do rozważenia. Ponadto mysie modele chorób neurologicznych mogą mieć trudności z dotarciem do butelki z rurką z łykiem z powodu upośledzenia motorycznego kończyn, podczas gdy mogą łatwo dotrzeć do miski z kołkami. Myszy z dysfunkcją języka i/lub szczęki mogą nie być w stanie wystarczająco nacisnąć kulki w dziobku, aby uzyskać dostęp do płynu; Korzystanie z misek na kołki może wyeliminować ten problem. Z tych powodów stosowanie misek na kołki zamiast butelek z rurką sipper jest preferowaną metodą testowania mysich VFSS. Jednak komory obserwacyjne zostały zaprojektowane tak, aby w razie potrzeby pomieścić picie dziobków. Ważnym zastrzeżeniem do rozważenia jest to, że wiadomo, że tempo lizania różni się między wylewką a miską^13,26. W związku z tym wybór wylewki lub miski kołkowej dla VFSS musi być spójny w ramach eksperymentów i między nimi.

Czwartym wyzwaniem było zidentyfikowanie wymiernych parametrów połykania u myszy, które są porównywalne z parametrami VFSS powszechnie stosowanymi w badaniach naukowych na ludziach i praktyce klinicznej. Nasze wstępne wyniki wykazały, że rodzaj systemu fluoroskopowego określa, jakie parametry połykania można badać u myszy. Większość ośrodków badawczych i placówek medycznych posiada fluoroskopy o wysokiej energii (75-95 kV, 1-5 mA) przeznaczone do użytku z ludźmi i większymi zwierzętami, co skutkuje wyjątkowo niską jakością obrazu podczas testowania myszy i innych małych zwierząt. Na przykład niedawne badanie z użyciem fluoroskopu o wysokiej energii na szczurach było w stanie zidentyfikować tylko 4 wymierne parametry połykania¹², a my byliśmy w stanie zidentyfikować tylko 7 parametrów połykania dla myszy w tym badaniu. Aby przezwyciężyć to poważne ograniczenie, niedawno uzyskaliśmy system fluoroskopii o niskiej energii o nazwie The LabScope (Glenbrook Technologies). System jest miniaturowym fluoroskopem, który generuje ciągłą wiązkę stożkową promieniowania rentgenowskiego o energiach fotonów od 15 do 40 kV i szczytowym prądzie lampy 0,2 mA (maksymalna moc 8 W). Niższe poziomy energii tego systemu są lepiej tłumione przez cienką kość i tkankę miękką myszy, a tym samym zapewniają wyższą rozdzielczość kontrastu niż konwencjonalne (tj. wysokoenergetyczne) fluoroskopy. Wiązka promieniowania rentgenowskiego LabScope jest kierowana na wzmacniacz obrazu o średnicy 5 cm, który jest znacznie mniejszy niż wzmacniacz obrazu o średnicy 15-57 cm w konwencjonalnych fluoroskopach. Minimalna odległość między źródłem a wzmacniaczem (SID) LabScope wynosi ~6 cm (w przeciwieństwie do ~30 cm w przypadku konwencjonalnych fluoroskopów), co zapewnia zwiększone możliwości powiększenia. Ponadto LabScope wykorzystuje opatentowaną technologię, która cyfrowo powiększa obraz do 40 razy w czasie rzeczywistym, bez zmiany SID. Rezultatem jest w istocie mikroskop rentgenowski, który może powiększać i pomniejszać w czasie rzeczywistym, aby zobaczyć małe obszary zainteresowania, takie jak mechanizm połykania myszy.

Główną zaletą tego niskoenergetycznego systemu fluoroskopii jest poprawa bezpieczeństwa radiacyjnego. Oprócz tego, że zwierzęta otrzymują niższe dawki promieniowania za pomocą LabScope, naukowcy korzystający z systemu są narażeni na znacznie mniejsze rozproszenie promieniowania. Narażenie na promieniowanie bezpośrednio przed urządzeniem na panelu sterowania wynosi 10,3 mR/h. W odległości 1 m przed urządzeniem ekspozycja spada do 580 μR/h. Większość innych miejsc w pomieszczeniu ma bardzo niską ekspozycję poniżej 10 μR/h. Pomimo tej poprawy podjęliśmy dodatkowe środki w celu poprawy bezpieczeństwa radiologicznego. Na przykład wokół LabScope dodano osłonę z akrylu ołowiowego, aby blokować rozproszone fotony promieniowania rentgenowskiego, co umożliwia naukowcom przeprowadzanie mysich testów VFSS bez noszenia osobistych osłon (np. fartuchów ołowianych, osłon tarczycy i okularów). Dodatkowo przezroczysty akryl pozwala na wizualizację myszy z daleka. Dodatkowe bezpieczeństwo radiacyjne zapewnia zmotoryzowany podnośnik nożycowy, który jest sterowany zdalnie przez badacza. Z odległości do 3 m od fluoroskopu naukowcy mogą za pomocą zdalnie sterowanego urządzenia regulować pionowe i poziome położenie komory obserwacyjnej w obrębie wiązki promieniowania rentgenowskiego. W rezultacie, anatomiczne obszary zainteresowania mogą być utrzymywane w polu widzenia fluoroskopii, podczas gdy mysz swobodnie porusza się w komorze obserwacyjnej. Chociaż podnośnik nożycowy został zaprojektowany do użytku z The LabScope, jest również kompatybilny z konwencjonalnymi fluoroskopami w celu poprawy bezpieczeństwa radiacyjnego dla badaczy. Ostatnim krokiem w celu poprawy bezpieczeństwa radiacyjnego podczas mysiego VFSS jest zastosowanie strzykawkowego systemu dostarczania płynów. System ten zawiera rurkę PE o długości 3-4 stóp (lub dłuższą, jeśli to konieczne), która umożliwia szybkie i wydajne dostarczanie płynów do miski kołkowej z dużej odległości. Ten strzykawkowy system podawania płynów, w połączeniu z komorami obserwacyjnymi, może być również używany z konwencjonalnymi fluoroskopami.

Wstępne prace z wykorzystaniem LabScope, w połączeniu z nowym mysim protokołem VFSS, pokazują główną przewagę nad konwencjonalnymi systemami: liczba parametrów połykania, które można wiarygodnie określić ilościowo, jest prawie podwojona. Jednak struktury tkanek miękkich mechanizmu połykania (np. język, velum, tylna ściana gardła i nagłośnia) myszy nie są łatwo widoczne podczas korzystania z systemów fluoroskopii o niskiej lub wysokiej energii. Dlatego skupiliśmy się na ilościowym określeniu miar przepływu w bolusie, a nie na biomechanice połykania. Interesowały nas przede wszystkim parametry, które można określić ilościowo na podstawie jednostek czasu, powierzchni, odległości, objętości itp., a nie przy użyciu miar w skali Likerta. W literaturze dotyczącej VFSS u ludzi opisano liczne parametry przepływu bolusa spełniające to wymaganie, takie jak czas pasażu doustnego^27-29, czas pasażu gardłowego^27-33 i czas pasażu przełykowego^34-36, by wymienić tylko kilka. Transport bolusa przez jamę ustną nie był łatwo widoczny u myszy, prawdopodobnie ze względu na mały rozmiar bolusa podczas spontanicznego picia. Udało nam się jednak wiarygodnie określić ilościowo czas pasażu przez gardło i przełyk, a także kilka innych pomiarów związanych z przepływem i klirensem bolusa. Oczekuje się, że identyfikacja dodatkowych parametrów połykania translacyjnego będzie oczekiwana w miarę optymalizacji możliwości The LabScope.

Wyniki tego badania wykazały, że myszy wykonują kilka rytmicznych liźnięć na łyk podczas spontanicznego picia, przy czym każdy mały płynny bolus sekwencyjnie wypełnia przestrzeń zastawkową przed uruchomieniem połknięcia gardłowego. To zachowanie, które jest typowe dla ssaków, które używają lizania jako podstawowego sposobu spożywania płynu^37-40, przypomina rytmiczny wzorzec ssania i połykania ludzkiego niemowlęcia i wszystkich młodych ssaków w ogóle. Fizjologia połykania niemowląt charakteryzuje się kilkoma rytmicznymi ssaniami, po których następuje odruchowe połykanie gardłowe, powszechnie opisywane jako cykl ssania-połykania^37,41-43. Tak więc rytmiczne ruchy języka i żuchwy związane z lizaniem po spożyciu myszy mogą być bardziej porównywalne z zachowaniami ssania po spożyciu ludzkich niemowląt, a nie z piciem kubka przez dzieci i dorosłych. W związku z tym określaliśmy ilościowo częstość lizania i stosunek lizania do połykania myszy w celu przyszłych porównań z częstością ssania i stosunkiem ssania do połykania ludzkich niemowląt. Być może badania nad mysimi VFSS dostarczą wglądu w rozwojowe zaburzenia połykania.

Jak w przypadku każdej nowej metody badawczej, zidentyfikowano obszary wymagające poprawy. Na przykład mysi protokół VFSS został opracowany przy użyciu tylko szczepów myszy C57 i C57/SJL; Nie został jeszcze przetestowany na szczurach. Komory obserwacyjne będą musiały zostać powiększone pod względem rozmiaru (średnicy i długości), aby pomieścić większe rozmiary ciała szczurów. Nie wiadomo również, czy joheksol o smaku czekoladowym jest odpowiedni jako uniwersalny roztwór testowy VFSS u myszy. Dlatego w tym celu uzasadnione jest przeprowadzenie testów na większą skalę z wieloma szczepami myszy i szczurów. Nie należy również wykluczać stosowania baru jako środka kontrastowego w mysich VFSS. Myszy wyraźnie preferowały receptury joheksolu od baru; Jednak bardziej rygorystyczne i systematyczne próby maskowania awersyjnego smaku/zapachu baru mogą stanowić smaczną alternatywę dla johexolu. Przyszłe badania porównujące wpływ joheksolu i siarczanu baru (a także innych potencjalnych doustnych środków kontrastowych) na preferencje smakowe i fizjologię połykania u myszy i szczurów bez wątpienia dostarczą ważnych informacji, które są bezpośrednio istotne i translacyjne dla ludzkich VFSS.

VFSS u ludzi obejmuje kilka konsystencji pokarmów i płynów, a dysfagia jest najbardziej widoczna podczas połykania rzadkich płynów i suchych, stałych pokarmów^44,45. Mysi protokół VFSS jest zatem rozszerzany o dodatkowe konsystencje, które mogą ułatwić wykrywanie i kwantyfikację dysfagii w modelach choroby. Konieczne będzie również przeprowadzenie badań lepkości płynnych receptur mysich VFSS w celu dostosowania lepkości do tych stosowanych podczas VFSS u ludzi. Zajęcie się tymi ograniczeniami ułatwi identyfikację translacyjnych biomarkerów dysfagii VFSS, które można bezpośrednio porównać między myszami, szczurami i ludźmi.

Użyteczność mysiego VFSS może zostać znacznie zwiększona poprzez wszczepienie markerów nieprzepuszczających promieni rentgenowskich do struktur tkanek miękkich mechanizmu połykania, które w inny sposób nie są widoczne, umożliwiając w ten sposób badania biomechaniki połykania. Podejście to jest z powodzeniem stosowane od wielu lat do badania biomechaniki połykania u młodych świń, przy użyciu asortymentu metalowych klipsów i drutów^37,42. Spodziewamy się, że zastosowanie podobnych, ale mniejszych markerów u myszy pozwoli na ilościowe określenie kilku dodatkowych parametrów jaskółki w celu porównania z większymi ssakami, w tym ludźmi. Obecnie opracowujemy metodologię wszczepiania markerów nieprzepuszczających promieni rentgenowskich do języka, podniebienia miękkiego, gardła, krtani i bliższego przełyku myszy, aby przetestować tę hipotezę.

Liczba klatek na sekundę podczas nagrywania wideo w LabScope i konwencjonalnych fluoroskopach jest ograniczona do 30 klatek na sekundę (fps). Jednak nasze wstępne wyniki wykazały, że cały gardłowy etap połykania u zdrowych myszy następuje w czasie krótszym niż 66 ms (tj. 2 ramki), czyli około 10 razy szybciej niż u ludzi. Tak więc gardłowa faza połykania u myszy zachodzi tak szybko, że szczegóły nie są odczuwalne przy użyciu kamery 30 kl./s. Wyższa liczba klatek na sekundę (prawdopodobnie >100 kl./s) będzie konieczna, aby wystarczająco zobrazować i określić ilościowo niezwykle szybkie i złożone ruchy gardła podczas połykania u myszy i innych gryzoni. W połączeniu z wyższą liczbą klatek na sekundę, włączenie technologii dwupłaszczyznowej do obrazowania fluoroskopowego 3D z pewnością rozszerzyłoby użyteczność mysich VFSS. W związku z tym przyszłe rozważania projektowe powinny obejmować kamerę o większej liczbie klatek na sekundę i możliwości obrazowania dwupłaszczyznowego.

Wreszcie, wykazano, że niskie dawki promieniowania powodują bezpłodność u samic myszy C57, co skutkuje zmienionym poziomem hormonów stymulowanych przez jajniki, co może zakłócić badania długości życia⁴⁶. Wyniki odnoszące się konkretnie do skutków powtarzającego się narażenia na niskie dawki promieniowania związanego z testami VFSS nie zostały jeszcze zbadane na myszach, innych zwierzętach lub ludziach. Jednak dysfunkcja jajników (niezwiązana z ekspozycją na promieniowanie) u kobiet została powiązana z zaburzeniami motoryki przewodu pokarmowego, a w szczególności z dysfagią w niektórych przypadkach⁴⁷, co stanowi kolejne zastrzeżenie do rozważenia przy projektowaniu przyszłych badań VFSS, które obejmują kobiety (zwierzęta i ludzi). Należy unikać wykluczania samic, ponieważ znaczące różnice między płciami w funkcji połykania zostały zgłoszone u ludzi^48,49 i byłyby ważne do wykrycia i scharakteryzowania również w modelach chorób zwierzęcych. Dlatego wyniki podłużnych badań VFSS na myszach i szczurach obu płci mają ogromny potencjał translacyjny dla ludzi w odniesieniu do dysfagii, a także do ryzyka narażenia na niskie dawki promieniowania związanego z powtórnymi testami VFSS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurki poliwęglanowe do komór obserwacyjnych	McMaster-Carr	3161T41	Korpus tub obserwacyjnych, średnica 2"X2", grubość ścianki 0,080"
Arkusz poliwęglanowy  do komór obserwacyjnych	McMaster-Carr	9115K71	Zaślepki do tub obserwacyjnych, 2"x12"x3/4"
Arkusz poliwęglanowy  do komór obserwacyjnych	McMaster-Carr	8574K281	Miski kołkowe do tub obserwacyjnych
O-ringi silikonowe  do zaślepek komór obserwacyjnych	McMaster-Carr	9396K108	S1138 AS568-029, opakowanie 25 http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r
Korki silikonowe do komór obserwacyjnych	McMaster-Carr	2903K22	Zestaw 10 korków do zatykania owalnego otworu w górnej części komory obserwacyjnej przy użyciu miski kołkowej http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at
Probówki wirówkowe do butelek z rurką sipper	Evergreen Scientific	222-3530-G80	Probówki wirówkowe wolnostojące o pojemności 30 ml, z nakrętkami, sterylne https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/
Korki silikonowe do butelek z rurką do łykania	Saint-Gobain Performance Plastics	DX263031-10	Numer 31D, rozmiar: 26 mm na dole, 32 mm na górze, 30 mm na wysokości; 10 sztuk;   http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS
Wiertła korkowe do butelek z rurką do łykania Thomas	Scientific	3276G40	Zestaw świdrów korkowych o rozmiarach od 3/16-15/16 cala  http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt
Rurki do picia do butelek z rurką	Ancare	TD-100	Rurki do picia o długości 2 1/2" z otworem 5/16", prosta wylewka kulowa http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point
Iohexol do sporządzania doustnego roztworu środka kontrastowego	GE Healthcare		350 mg jodu na ml http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque
Syrop czekoladowy do aromatyzowania doustnego środka kontrastowego	Herseys
10 ml strzykawka do systemu podawania strzykawki	Becton, Dickinson and Company	309604	Strzykawka z końcówką Luer lock bez igły, 100 sztuk w opakowaniu http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp
Rurka cewnika do systemu podawania strzykawki	Becton, Dickinson and Company	427451	Rurka polietylenowa (niesterylna) (PE 240) 100' http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp
Igła do systemu dostarczania strzykawki	Becton, Dickinson and Company	427560	Igła o rozmiarze 15, pasuje do rurki cewnika PE 240 http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp
Pręt z żywicy acetalowej Delrin do systemu dostarczania strzykawki	McMaster-Carr	8576K15	o średnicy 1/2 cala, http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf
Folia akrylowa do podnośnika nożycowego	Ponoko		Laser cut http://www.ponoko.com
Drukowana w 3D rama ABS	Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri
Pręty mosiężne do podnośnika nożycowego	Amazon	TTRB-03-12-03	wykonane w osiach http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M
Prowadnica do szuflady do podnośnika nożycowego	Richelieu	10292G116	Mocowany do podstawy podnośnika nożycowego http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754
28BYJ-48 silnik krokowy do podnośnika			po 2
ULN2003 Układ tranzystorów Darlington do podnośnika nożycowego	Toshiba	ULN2003APG	Używany jako sterowniki krokowe (po 2 szt
ATTINY85 mikrokontroler do podnośnika nożycowego	Atmel	ATTINY85-20PU	2 każda http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html
Nylonowa przekładnia czołowa	McMaster-Carr	57655K34	2 każda http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz
Nylonowa zębatka czołowa	McMaster-Carr	57655K62	2 każda http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9
4-40 nylonowe maszynowe	McMaster-Carr	95133A315	Zespół podnoszenia http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q
4-40 nylonowe nakrętki sześciokątne	McMaster-Carr	94812A200	Zespół podnośnika http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29
O-ring Buna-N AS568A Deska rozdzielcza nr 104	McMaster-Carr	9452K318	Zespół podnośnika http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7