Przygotowanie i charakterystyka nanocząstek siarczanu SDF-1α-chitozan-dekstranu

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest włączenie SDF-1α, czynnika naprowadzającego komórki macierzyste, do nanocząsteczek siarczanu dekstranu i chitozanu. Powstałe cząstki są mierzone pod kątem ich wielkości i potencjału zeta, a także zawartości, aktywności i szybkości uwalniania in vitro SDF-1α z nanocząstek.

Streszczenie

Chitozan (CS) i siarczan dekstranu (DS) są naładowanymi polisacharydami (glikanami), które tworzą nanocząstki na bazie kompleksu polielektrolitu po zmieszaniu w odpowiednich warunkach. Nanocząstki glikanu są użytecznymi nośnikami czynników białkowych, które ułatwiają dostarczanie białek in vivo i utrzymują ich retencję w tkance docelowej. Kompleksy glikanowych polielektrolitów są również idealne do dostarczania białek, ponieważ włączenie odbywa się w roztworze wodnym, co zmniejsza prawdopodobieństwo inaktywacji białek. Białka z miejscem wiązania heparyny łatwo przylegają do siarczanu dekstranu i są z kolei stabilizowane przez wiązanie. Cząsteczki te są również mniej zapalne i toksyczne, gdy są dostarczane in vivo. W opisanym poniżej protokole SDF-1α (czynnik pochodzenia komórek zrębu-1α), czynnik naprowadzający komórki macierzyste, jest najpierw mieszany i inkubowany z siarczanem dekstranu. Do mieszaniny dodaje się chitozan w celu utworzenia kompleksów polielektrolitowych, a następnie siarczan w celu stabilizacji kompleksów za pomocą mostków cynkowych. Powstałe cząstki SDF-1α-DS-CS są mierzone pod kątem wielkości (średnicy) i ładunku powierzchniowego (potencjału zeta). Określa się ilość wbudowanego SDF-1α, a następnie dokonuje się pomiarów jego szybkości uwalniania in vitro i jego aktywności chemotaktycznej w postaci związanej z cząstkami.

Wprowadzenie

Siarczan dekstranu (DS) i chitozan (CS) to polisacharydy z wieloma podstawionymi ujemnie naładowanymi grupami siarczanowymi (w DS) lub dodatnio naładowanymi grupami aminowymi (deacetylowany CS). Po zmieszaniu w roztworze wodnym dwa polisacharydy tworzą kompleksy polielektrolitowe w wyniku oddziaływań elektrostatycznych. Powstałe kompleksy mogą tworzyć duże agregaty, które zostaną oddzielone fazowo od roztworu wodnego (wytrącają się) lub małe cząstki, które dyspergowalnie w wodzie (koloidy). Konkretne warunki, które przyczyniają się do tych wyników, zostały szeroko zbadane i szczegółowo podsumowane i zilustrowane w niedawnym przeglądzie ¹. Wśród tych warunków dwa podstawowe wymagania dotyczące wytwarzania cząstek dyspergowalnych w wodzie to: przeciwnie naładowane polimery muszą: 1) mieć znacznie różną masę molową; oraz 2) mieszać w stosunku niestechiometrycznym. Warunki te pozwolą neutralnym pod względem ładunku skompleksowanym segmentom polimerowym wygenerowanym przez neutralizację ładunku na segregację i utworzenie rdzenia cząstki, a nadmiar polimeru na utworzenie powłoki zewnętrznej ¹. Cząstki glikanu opisane w tym protokole są przeznaczone do dostarczania do płuc i są zaprojektowane tak, aby były naładowane netto i miały wymiary nanometrowe. Ujemny ładunek powierzchniowy zmniejsza prawdopodobieństwo komórkowego wychwytu cząstek ^2,3. Cząstki o wymiarach nanometrowych ułatwiają przejście przez dystalne drogi oddechowe. Aby osiągnąć ten cel, ilość DS użyta w tym preparacie przekracza CS (stosunek wagowy 3:1); oraz DS o wysokiej masie cząsteczkowej (średnia wagowa MW 500 000) i CS o niskiej masie cząsteczkowej (zakres MW 50–190 kDa, 75–85% deacetylowany).

SDF-1α to czynnik naprowadzający komórki macierzyste, który pełni funkcję naprowadzania poprzez swoją aktywność chemotaktyczną. SDF-1α odgrywa ważną rolę w naprowadzaniu i utrzymaniu hematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym oraz w rekrutacji komórek progenitorowych do tkanki obwodowej w celu naprawy uszkodzeń ^4,5. SDF-1α ma w swojej sekwencji białkowej miejsce wiążące heparynę, co pozwala białku wiązać się z heparyną / siarczanem heparanu, tworzyć dimery, być chronionym przed inaktywacją proteazy (CD26 / DPPIV) i wchodzić w interakcje z komórkami docelowymi za pośrednictwem receptorów na powierzchni komórki ^6-8. DS ma podobne właściwości strukturalne jak heparyna/siarczan heparanu; w związku z tym wiązanie SDF-1α z DS byłoby podobne do wiązania jego naturalnych ligandów polimerowych.

W poniższym protokole opisujemy przygotowanie nanocząstek SDF-1α-DS-CS. Procedury te stanowią jedną z preparatów, które były wcześniej badane ⁹. Protokół został pierwotnie zaadaptowany z badania nanocząstek VEGF-DS-CS ¹⁰. Opisano preparat na małą skalę, który można łatwo zwiększyć przy użyciu tych samych roztworów podstawowych i warunków przygotowania. Po przygotowaniu cząstki są charakteryzowane poprzez zbadanie ich wielkości, potencjału zeta, zakresu inkorporacji SDF-1α, czasu uwalniania in vitro i aktywności włączonego SDF-1α.

Protokół

1. Przygotowanie nanocząstek glikanu SDF-1α

Ze względu na cel dostarczania in vivo, wysterylizuj wszystkie pojemniki, pipety i końcówki użyte do przygotowania.

1. Przygotować następujące roztwory podstawowe w wodzie ultraczystej: 1% siarczan dekstranu; 1 M NaOH (sterylny przefiltrowany membraną PES); 0,1% chitozan w 0,2% lodowatym kwasie octowym (przefiltrować kolejno przez filtry 0,8 i 0,22 μm, a następnie dostosować pH do 5,5 za pomocą NaOH); 0,1 M_ZnSO4; 15% mannitolu; i 0,92 mg/ml SDF-1α (przechowywany w podwielokrotnościach w temperaturze 80 °C, i przechowywać w temperaturze 4 °C po rozmrożeniu).
2. Sterylizuj roztwory podstawowe przez membrany filtracyjne 0,22 μm. Ocenić poziom endotoksyn w przygotowanym roztworze za pomocą testu zakrzepów w żelu lizatu amebocytów limulusa (LAL). Upewnij się, że poziomy wynoszą <0,06 EU/ml.
3. Dodać 0,18 ml wody UltraPure do szklanej fiolki o pojemności 1,5 ml zawierającej mieszadło magnetyczne. Ustaw prędkość mieszania na 800 obr./min. Dodać 0,1 ml 1% siarczanu dekstranu i mieszać przez 2 min. Dodać 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml 0,92 mg/ml roztworu SDF-1α) i mieszać przez 20 min.
4. Dodać kroplami 0,33 ml 0,1% chitozanu i mieszać przez 5 minut. Zmienić prędkość mieszania na maksymalną i powoli dodawać 0,1 ml 0,1 M ZnSO₄ za pomocą strzykawki o pojemności 0,1 ml (przez 1 min).
5. Zwiększ prędkość mieszania do 800 obr./min i mieszaj przez 30 min. Dodać 0,4 ml 15% mannitolu i mieszać przez 5 minut. Przenieść mieszaninę reakcyjną do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
   Uwaga: Obecność mannitolu ułatwia ponowne zawieszenie cząstek po odwirowaniu. W zależności od zwartości granulatu stężenie mannitolu można zmieniać od 0% do 5%. Całkowite ponowne zawieszenie cząstek po każdym odwirowaniu ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zagregowań w końcowej zawiesinie.
6. Odessać supernatant i za pomocą pipety powoli usunąć ostatnią kroplę płynu. Dodać 0,2 ml 5% mannitolu. Zawiesić osad za pomocą strzykawki igłowej o pojemności 0,5 ml i 29 G. Dodać 1 ml 5% mannitolu. Wirować przy 16 000 x g przez 15 min.
7. Powtórz krok 1.6.
8. Odessać supernatant. Zawiesić osad w 0,2 ml 5% mannitolu. Zawiesinę cząstek należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Zawiesina cząstek może być również przechowywana w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C lub liofilizowana. Włączenie 5% mannitolu do zawiesiny jest niezbędne, aby zapobiec agregacji cząstek po zamrożeniu i rozmrożeniu lub po liofilizacji i ponownym uwodnieniu. Mannitol można usunąć przez odwirowanie zawiesiny po przechowywaniu.

2. Pomiar wielkości cząstek i potencjału Zeta

Wielkość cząstek i potencjał zeta są analizowane odpowiednio przez dynamiczne rozpraszanie światła i elektroforetyczne rozpraszanie światła za pomocą analizatora cząstek wskazanego na Liście Materiałów.

1. Ustaw następujące parametry pomiaru wielkości cząstek: Czasy akumulacji: 70; Czasy powtórzeń: 4; Temperatura: 25 °C; Rozcieńczalnik: woda; Regulacja intensywności: automatyczna.
2. Rozcieńczyć próbkę SDF-1α-DS-CS wodą (10-krotne rozcieńczenie). Załaduj 100 μl próbki do jednorazowej kuwety UV, takiej jak kuweta Eppendorf. Włóż kuwetę do uchwytu kuwety. Poczekaj, aż regulacja intensywności osiągnie "Optymalny" (~10 000 cps). Rozpocznij pobieranie danych.
3. Po zakończeniu pomiaru należy zapisać wyniki kumulantów średnicy (nm) i wskaźnika polidyspersyjności. Uśrednić wyniki uzyskane z każdego z 4 powtórzonych odczytów i obliczyć odchylenie standardowe.
4. Załadować 500 μl 10-krotnie rozcieńczonej próbki cząstek do celi przepływowej w celu pomiaru potencjału zeta. Ustaw następujące parametry pomiaru: Czasy akumulacji: 10; Czasy powtórzeń: 5; Temperatura: 25 °C; Rozcieńczalnik: woda; Regulacja intensywności: automatyczna. Zapisz wyniki potencjału zeta (mV). Uśrednij wynik uzyskany z każdego z 5 powtórzonych odczytów i oblicz odchylenie standardowe.

3. Kwantyfikacja SDF-1α w cząstkach

1. Rozcieńczyć wolną formę SDF-1α do stężeń 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 i 0,05 mg/ml w 1,3x buforze do próbek Laemmli. Rozcieńczyć 6 μl próbek SDF-1α-DS-CS w 40 μl 1,3x bufor do próbek Laemmli. (Przygotować 4x bufor podstawowy Laemmli zawierający 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% glicerolu, 0,05 mg/ml błękitu bromofenolowego i 8% 2-merkaptoetanolu. Podzielić roztwór podstawowy na małe porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C do jednorazowego użytku)
2. Podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 10 minut. Dwukrotnie wirować próbki (każdy przez 10 sekund z maksymalną prędkością) podczas 10-minutowego czasu nagrzewania w celu całkowitej dysocjacji cząstek. Schłodzić próbki do temperatury suchej temperatury przez 2 minuty. Wirować przy 10 000 x g przez 0,5–1 minutę, aby obniżyć kondensat wodny. Ponownie zwirować, aby dobrze wymieszać.
   Uwaga: W tym momencie roztwór próbki powinien być klarowny i nie ma widocznego osadu.
3. Załadować 10 μl próbki/studzienki do 4–20% żelu SDS. Uruchomić elektroforezę przy napięciu 200 V przez 20 minut. Zabarwić żel niebieską plamą białkową Coomassie.
4. Zbadaj gęstość pasm białkowych SDF-1α za pomocą obrazowania molekularnego i oprogramowania do analizy densytometrycznej. Oblicz ilość SDF-1α w cząstkach w stosunku do krzywej standardowej zbudowanej z wolnych wzorców SDF-1α.

4. Test uwalniania in vitro

1. Zmieszać cząstki glikanu SDF-1α z solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco bez wapnia i magnezu (D-PBS) w stosunku 1:1 (v/v).
2. Podzielić zawiesinę cząstek na podwielokrotności o objętości 0,05 ml w probówkach o pojemności 1,5 ml. Załaduj próbki na dno probówek. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza lub naruszania powierzchni płynu. Uszczelnij górną część tub za pomocą Parafilm.
   UWAGA: W ten sposób płyn pozostanie na dnie podczas późniejszego obrotu od góry do dołu na mikserze rurowym.
3. Obrócić probówki w temperaturze 37 °C na obracającym się mieszadle mikroprobówkowym. Usunąć podwielokrotności z probówek w wyznaczonych momentach i natychmiast odwirować próbki o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
4. Oddzielić sklaranty i osady, a następnie rozpuścić osad w 0,05 ml D-PBS. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C. Po pobraniu wszystkich próbek należy zbadać supernatanty i granulki na żelu SDS, jak opisano powyżej.

5. Test migracji

Ten test mierzy aktywność chemotaktyczną SDF-1α. Interakcja SDF-1α z jego receptorem (CXCR4) na powierzchni komórki powoduje migrację komórki w kierunku gradientu SDF-1α. W tym teście komórki są ładowane do górnej studzienki (oddzielonej półprzepuszczalną membraną od dolnej studzienki), a roztwór SDF-1α do dolnej studzienki.

1. Rozcieńczyć SDF-1α (forma wolna lub związana z cząstkami) buforem migracyjnym (pożywka RPMI-1640 zawierająca 0,5% albuminy surowicy bydlęcej) w 3-krotnym seryjnym rozcieńczeniu do końcowych stężeń 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14 i 0,05 ng/ml.
2. Dodać 0,6 ml rozcieńczonego roztworu SDF-1α lub samego buforu migracyjnego (kontrola ujemna) do studzienki na płytce 24-dołkowej. Dodać 0,57 ml buforu migracyjnego do studzienki (kontrola komórki wejściowej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Umieść przepuszczalną wkładkę do hodowli komórkowej, taką jak Transwell (wielkość porów 5 μm, średnica 6,5 mm) na górze dolnej studzienki. Załaduj 0,1 ml komórek Jurkat (5 × 10⁵) do wkładki Transwell. Załaduj komórki o pojemności 0,03 ml bezpośrednio do studzienki kontrolnej komórki wejściowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w inkubatorze z 5% stężeniem CO_{2 .}
3. Wyjmij wkładki Transwell. Przenieś komórki, które migrowały do dolnych studzienek, do probówki polistyrenowej o pojemności 4 ml. Policz migrowane komórki za pomocą cytometru przepływowego.
4. Oblicz migrację jako procent liczby komórek wejściowych (numer komórki w studzience kontrolnej komórki wejściowej x 100/30) po odjęciu liczb w kontrolach ujemnych (komórki migrowane do studzienek zawierających tylko bufor migracyjny).

Wyniki

Rozmiar i potencjał zeta przygotowanych cząsteczek SDF-1α-DS-CS wyznaczono za pomocą analizatora cząstek. Rysunek 1 przedstawia analizę pomiaru rozmiaru. Na podstawie wyników kumanatów uzyskanych z czterech powtórnych pomiarów, średnica hydrodynamiczna cząsteczek SDF-1α-DS-CS wynosi 661 ± 8.2 (nm), a polidyspersyjność 0.23 ± 0.02. Wynik pomiaru potencjału zeta przedstawiono na Rysunku 2. Z pięciu powtórnych pomiarów wynika, że potencjał zeta cząsteczek SDF-1α-DS-CS wynosi -24.8 ± 0.5 mV....

Dyskusja

Jak wspomniano powyżej, nanocząstki DS-CS powstają w wyniku neutralizacji ładunku między cząsteczkami polianionu (DS) i polikacji (CS). Ponieważ oddziaływanie ładunku zachodzi łatwo podczas zderzenia molekularnego, stężenie roztworów polimerowych i prędkość mieszania podczas mieszania mają kluczowe znaczenie dla wielkości powstałych cząstek. Ogólna tendencja jest taka, że bardziej rozcieńczone roztwory DS i CS ¹⁵ i wyższa prędkość mieszania skutkują mniejszymi cząstkami.

Formuła nan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siarczan dekstranu	Fisher	BP1585-100
Chitozan, niskocząsteczkowy	Sigma	448869
Siarczan siedmiowodny	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure woda	Invitrogen	10977-023
SDF-1&alfa;	Przygotowano zgodnie z odniesieniem 8.
Filtr strzykawkowy, membrana PES 0,22  μ m	Millipore	SLGP033RS
Magnetyczne mikromieszadła (2  x  7  mm)	Rybak	14-513-63
Zestaw szklanych fiolek; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Analizator cząstek Delsa Nano C	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Niebieski bezpieczny barwnik białkowy	Fisher	PI-24592
Obrazownik molekularny VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Przepuszczalne podpory Corning Transwell	Cytometr przepływowy Corning	3421
Accuri C6 BD	Biosciences
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma	D8537
Pyrogent plus zestaw	Fisher	NC9753738