Pomiar funkcji mięśni gładkich w izolowanej kąpieli tkankowej - zastosowania do badań farmakologicznych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje pomiar izometrycznego skurczu w izolowanym preparacie mięśni gładkich, przy użyciu systemu izolowanej kąpieli tkankowej i komputerowej akwizycji danych.

Streszczenie

Izolowane testy kąpielowe są klasycznym narzędziem farmakologicznym do oceny zależności stężenie-odpowiedź w niezliczonych tkankach kurczliwych. Chociaż technika ta jest stosowana od ponad 100 lat, wszechstronność, prostota i powtarzalność tego testu sprawiają, że pozostaje ona niezbędnym narzędziem zarówno dla farmakologów, jak i fizjologów. Systemy kąpieli tkankowych są dostępne w szerokiej gamie kształtów i rozmiarów, co pozwala naukowcom na ocenę próbek tak małych, jak mysie tętnice krezkowe i tak dużych jak jelito kręte świń – jeśli nie większych. Kluczowe znaczenie dla testu izolowanej kąpieli tkankowej ma możliwość pomiaru zależnych od stężenia zmian skurczu izometrycznego oraz sposób, w jaki można manipulować skutecznością i siłą działania agonistów kurczliwych poprzez zwiększanie stężeń antagonistów lub inhibitorów. Mimo że ogólne zasady pozostają stosunkowo podobne, najnowsze osiągnięcia technologiczne pozwalają na jeszcze większą wszechstronność oznaczania kąpieli tkankowej dzięki zastosowaniu komputerowego oprogramowania do rejestracji i analizy danych. W tym filmie zademonstrujemy funkcję izolowanej kąpieli tkankowej do pomiaru izometrycznego skurczu izolowanego mięśnia gładkiego (w tym przypadku pierścieni aorty piersiowej szczura) oraz podzielimy się rodzajami wiedzy, którą można uzyskać za pomocą tej techniki. Zawiera szczegółowe opisy rozwarstwiania i przygotowania tkanki aorty, umieszczania pierścieni aorty w kąpieli tkankowej i prawidłowej równowagi tkanek przed eksperymentami, testów żywotności tkanek, projektu i wdrożenia eksperymentu oraz oceny ilościowej danych. Aorta zostanie podłączona do izometrycznych przetworników siły, z których dane będą rejestrowane za pomocą dostępnego na rynku przetwornika analogowo-cyfrowego i wzmacniacza mostkowego specjalnie zaprojektowanego do wykorzystania w tych eksperymentach. Oprogramowanie towarzyszące temu systemowi zostanie wykorzystane do wizualizacji eksperymentu i analizy przechwyconych danych.

Wprowadzenie

Dyscyplina farmakologii używa systemu kąpieli tkankowej od ponad 150 lat. Wszechstronność tego systemu pozwoliła naukowcom na całym świecie scharakteryzować receptory i transdukcję sygnału receptorowego, a wiedza ta stanowi podstawę terapii, które leczyły miliony osób z chorobami lub zaburzeniami, takimi jak nadciśnienie, niewydolność serca, cukrzyca, choroby przewodu pokarmowego, dysfunkcja pęcherza moczowego, astma i zaburzenia połykania, by wymienić tylko kilka. Do dnia dzisiejszego kąpiel w izolowanych tkankach pozostaje ważnym aspektem opracowywania leków i badań podstawowych, ponieważ pozwala tkance funkcjonować jako tkanka. W tej lekcji JoVE udostępniono formalny protokół, aby zademonstrować wizualny i wirtualny eksperyment wykorzystujący dane z eksperymentu z izolowaną kąpielą tkankową, który mierzy skurcz izometryczny, co pozwala na charakterystykę receptora.

Główną zaletą tej techniki jest to, że tkanka jest żywa i funkcjonuje jako cała tkanka, z fizjologicznym wynikiem (skurczem lub rozluźnieniem), który jest istotny dla organizmu. Jest to synteza etapów (interakcja lek-receptor, transdukcja sygnału, generacja drugiego przekaźnika, zmiana pobudliwości mięśni gładkich i zmiana funkcji tkanek). Podczas gdy inne techniki pozwalają na badanie każdego z tych etapów (np. wiązanie radioligandu w celu uzyskania powinowactwa do leków, pomiar drugich przekaźników), technika izolowanej kąpieli tkankowej pozwala na integrację wszystkich tych etapów¹. Kolejną zaletą jest to, że zachowanie funkcji tkanki pozwala na obliczenie ważnych zmiennych farmakologicznych, które są bardziej znaczące w tkance niż w otoczeniu komórkowym; Jest to bliższe temu, jak badane leki działałyby w organizmie jako całości.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury opisane w tym artykule są wykonywane zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Michigan.

1. Przygotowanie i konfiguracja systemu

1. Przygotować 5 l roztworu soli fizjologicznej (PSS), co jest ilością potrzebną do eksperymentu skurczu w kąpieli tkankowej, w którym wykorzystuje się do 50 ml kąpieli tkankowych; patrz Tabela 2 dla przepisu PSS. Obliczyć całkowitą wymaganą objętość, mnożąc liczbę kąpieli tkanek przez objętość kąpieli, a następnie mnożąc przez liczbę wymaganych płukań tkanek.
   1. Użyj Tabeli 2 jako przewodnika do tworzenia PSS. Rozpuść sole w około 4 litrach wody. UWAGA: HPLC – zalecana jest woda typu I
   2. Dodać 8 ml 1 M roztworu CaCl₂ (147 g/l w przypadku stosowania soli dwuwodzianowej) do roztworu, tak aby roztwór końcowy wynosił 1,6 mM wapnia.
   3. Quantum sufficit roztwór PSS do 5 L.
2. Rozgrzej system kąpieli tkankowej do 37 °C, włączając podgrzewaną łaźnię wodną z recyrkulacją. Krok krytyczny: Każdy element systemu jest pokryty płaszczem wodnym, upewnij się, że są one połączone szeregowo ze sobą. Kierunek przepływu ma kluczowe znaczenie – upewnij się, że woda wpływa do każdego elementu na najniższym połączeniu kolczastym i wychodzi na najwyższym połączeniu kolczastym.
3. Włącz system akwizycji danych. Włącz przetworniki siły co najmniej 15 minut przed eksperymentem, aby zrównoważyć temperaturę.
   UWAGA: Większość przetworników siły wykorzystuje tensometry, które są wrażliwe na zmiany temperatury i początkowo wykazują dryft termiczny po włączeniu zasilania.
4. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych i zapewnij połączenie z systemem akwizycji danych. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby włączyć rejestrację danych.
5. Upewnij się, że przetworniki siły są skalibrowane przed umieszczeniem tkanki w kąpieli tkankowej i przed rozpoczęciem zapisu danych; postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi kalibracji.
6. Podłącz system kąpieli tkankowej do butli z gazem medycznym o stężeniu 95%_O2 / 5% CO₂ i sprawdź, czy nie ma wycieków gazu, a następnie zwiększ ciśnienie w systemie.
7. Napełnij zbiorniki kąpieli tkankowej PSS i poczekaj, aż roztwór osiągnie optymalną temperaturę. Zalać system i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z systemu i przewodów.
8. Sprawdź aeratory do kąpieli tkankowej, aby zapewnić stałe napowietrzanie roztworu, które natlenia bufor PSS i zapewnia ruch Browna w celu rozprowadzenia leków, które zostaną wprowadzone do kąpieli tkankowej podczas eksperymentu. Upewnij się, że napowietrzanie/pęcherzyki nie powodują ruchu tkanek, co zakłóci zapisy danych; W razie potrzeby zmniejsz przepływ gazu.
   UWAGA: Kąpiel tkankowa i system akwizycji danych są teraz gotowe do rozpoczęcia eksperymentu.

2. Przygotowanie tkanek

1. Najlepiej wypreparować tkanki zwierzęcia bezpośrednio przed użyciem i umieścić je bezpośrednio w PSS.
   UWAGA: Niektóre tkanki można przechowywać w PSS przez noc w temperaturze 4 °C, ale należy przeprowadzić odpowiednie kontrole w celu potwierdzenia funkcji tkanek po dłuższym przechowywaniu; patrz punkt 6.
2. Użyj aorty piersiowej jako tkanki w tym ćwiczeniu.
3. Znieczulij szczura zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i połóż szczura grzbietem do dołu. Potwierdź znieczulenie poprzez uszczypnięcie palca u nogi i utratę odruchowej reakcji na ten bolesny bodziec.
   UWAGA: W tym protokole wykorzystuje się 70 mg/kg pentobarbitalu podawanego we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Wytyczne instytucjonalne dotyczące znieczulenia gryzoni mogą się różnić.
4. Utwórz odmę opłucnową, wykonując nacięcie nożyczkami wzdłuż przepony na dnie klatki piersiowej. Następnie kontynuuj nacięcie od dołu klatki piersiowej do mostka i przetnij na pół.
5. Wypreparuj lub odłóż na bok te narządy, które znajdują się na szczycie kręgosłupa i zlokalizuj aortę, która leży bezpośrednio wzdłuż kręgosłupa.
   UWAGA: Ten krok zapewnia wolną przestrzeń roboczą do wypreparowania aorty.
6. Odetnij wszystkie połączenia z aortą, od przełyku, płuca itp. i przetnij aortę prostopadle do kręgosłupa na poziomie przepony.
7. Delikatnie przytrzymaj aortę kleszczami i użyj nożyczek, aby wypreparować aortę od kręgosłupa. Rozpocznij sekcję w dolnej części przepony przylegającej do kręgosłupa i pracuj w kierunku serca. Upewnij się, że podejmujesz dodatkowe środki ostrożności, aby nie ciągnąć ani nie ciągnąć za tkankę aorty, co może spowodować jej uszkodzenie.
8. Natychmiast umieścić aortę w przygotowanym naczyniu separacyjnym zawierającym PSS.
   UWAGA: Sekcję aorty na pierścienie najlepiej wykonać w naczyniu preparacyjnym, które ma czarną podstawę silastyczną . Pozwala to na użycie drutów, które mogą być używane do kaniulacji aorty i mogą być przymocowane do naczynia, zapewniając stabilność podczas przebywania w naczyniu preparacyjnym. Czarne tło zapewnia kontrast, który ułatwia rozwarstwianie. Należy zachować ostrożność przy stosowaniu drutów kaniulujących, ponieważ warstwę komórek śródbłonka można usunąć przy nadmiernym tarciu drutu o światło naczynia.
9. Weź drut i zrób mały kąt 90° na jednym końcu i wepchnij kątowy koniec w fundament silastyczny, aby zakotwiczyć drut doprowadzający. Umieść całą aortę w naczyniu preparacyjnym.
10. Przytrzymaj koniec drutu doprowadzającego kleszczami, a następnie delikatnie wkręć drut w światło aorty.
11. Użyj kleszczyków i wsuń aortę na drut. Gdy wolny koniec drutu prowadzącego jest widoczny, delikatnie wyginij drut i umieść wolny koniec w silastycznym fundamencie naczynia, aby ustabilizować tkankę.
12. Za pomocą małych nożyczek i kleszczy vannas usuń okołonaczyniową tkankę tłuszczową i wszystkie inne obce tkanki, skrzepy krwi itp., aż aorta piersiowa stanie się biała i nieco włóknista.
13. Usuń oczyszczoną aortę z drutu i nożyczkami przetnij aortę w pierścienie o szerokości około 3-5 mm.
14. Umieść pierścień aortalny na jednym z haczyków na tkanki, przytrzymując haczyk i delikatnie wsuwając pierścień na haczyk za pomocą kleszczy. Powtórz ten proces z drugim hakiem. Uważaj, aby haczyki się nie plątały; patrz rysunek 3.
15. Sprawdź, czy każdy haczyk ma przymocowany inny jedwabny szew. Sprawdź, czy jeden haczyk ma małą zawiązaną pętlę z jedwabiu, która umożliwia przymocowanie do pręta szklanego lub ze stali nierdzewnej, podczas gdy drugi to szew o długości 10-4 cm, który zostanie ręcznie przywiązany do przetwornika siły; patrz rysunek 3.
    UWAGA: Po przymocowaniu aorty do haczyków, tkanka jest gotowa do zamontowania w kąpieli tkankowej; patrz rysunek 3.
16. Powtórz kroki 2.14-2.15, aby zamontować drugi pierścień aortalny w drugiej komorze kąpieli tkankowej.

3. Umieszczanie tkanek w kąpieli

1. Należy pamiętać, że w tym systemie same kąpiele tkankowe są nieruchome. W tym czasie napełnij kąpiele tkankowe podgrzanym, napowietrzonym PSS i pozwól, aby roztwór osiągnął temperaturę.
2. Za pomocą jedwabnego szwu przywiąż jeden z haczyków na preparacie tkankowym do kołka na pręcie ze stali nierdzewnej. Umieść ten koniec w komorze kąpieli tkankowej. Podłącz pręt do stojaka pierścieniowego i umieść drugi koniec w naczyniu do barwienia wypełnionym PSS, aby utrzymać tkankę zanurzoną w buforze; patrz rysunek 3.
   1. Umieść pręt i tkankę w komorze do kąpieli tkanek i upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w PSS, a pręt jest zabezpieczony; patrz rysunek 3.
   2. Przywiąż drugi szew do przetwornika siły i upewnij się, że pozostał luz w szwie między tkanką a przetwornikiem siły.
      UWAGA: Ten luz zostanie usunięty poprzez regulację mikrometru; patrz rysunek 3.
3. Powtórz te czynności dla drugiego pierścienia aortalnego i komory kąpieli tkankowej.

4. Ustawianie napięcia pasywnego

UWAGA: Każda tkanka ma długość (Lo), na którą komórki mięśni gładkich reagują optymalnie. Wstępne eksperymenty w celu określenia optymalnego napięcia rozciągającego, które pozwala osiągnąć tę długość, muszą być przeprowadzone dla każdego indywidualnego typu tkanki, która ma być zbadana. Aorta piersiowa szczura ma optymalne bierne napięcie rozciągające wynoszące 4 g.

1. Użyj mikrometru/zębatki, aby zwiększyć napięcie do 2 g i poczekaj, aż tkanka osiągnie plateau. Po osiągnięciu plateau zwiększ napięcie o kolejne 2 g i poczekaj, aż tkanka się ustabilizuje.
   UWAGA: W pierścieniach aortalnych, po ustabilizowaniu początkowego napięcia 2 g i osiągnięciu plateau, tkanka powinna następnie rozluźnić się do ~1,6 g. Drugie zastosowanie 2 g spowoduje, że tkanka osiągnie ~3,6 g, z czego tkanka ponownie się rozluźni, a napięcie zmniejszy się. Tak więc, po dodaniu 4 g całkowitego napięcia, oprogramowanie powinno wskazać około 3,2 g naprężenia.
2. Powtórz te czynności dla drugiego pierścienia aortalnego i komory kąpieli tkankowej.

5. Równowaga i produkcja narkotyków

1. Równoważ tkankę przez 60 minut po przyłożeniu biernego napięcia do tkanki.
2. W fazie równowagi należy myć tkankę co 15-20 minut. Odcedzić kąpiel tkankową i zastąpić PSS PSS z podgrzanego zbiornika.
   UWAGA: W tym czasie tkanka rozluźni się, na co wskazuje utrata napięcia biernego.
3. W tym czasie przygotuj leki do eksperymentu, które muszą być co najmniej 1,000 razy bardziej skoncentrowane niż rzeczywiste stężenie w kąpieli, więc do osiągnięcia pożądanego stężenia potrzebna jest tylko niewielka objętość zapasu leku.

6. Początkowe wyzwanie

1. Pod koniec okresu równowagi umyj tkankę po raz ostatni, zapisz dane i ponownie wyzeruj wszystkie dane wejściowe.
2. Wybierz agonistę (związek, który spowoduje aktywny skurcz), na który tkanka reaguje.
   UWAGA: W aorcie piersiowej szczura mięśnie gładkie tętnic będą aktywnie kurczyć się do agonisty receptora alfa adrenergicznego z powodu unerwienia tkanki przez współczulny układ nerwowy. Agonista receptorów adrenergicznych nie byłby przydatny w tkankach jelitowych, biorąc pod uwagę, że agoniści receptorów adrenergicznych powodują rozluźnienie. W takim przypadku można zastosować agonistę receptora, takiego jak acetylocholina (receptor cholinergiczny). Alternatywą zarówno dla fenylefryny, jak i acetylocholiny jest zastosowanie agonisty niebędącego receptorem, takiego jak wysoki poziom potasu (K) jako pierwszego wyzwania. W mięśniach gładkich wysoki poziom potasu działa pośrednio na otwarcie kanałów wapniowych i dlatego jest postrzegany jako ogólny wskaźnik integralności mięśni gładkich.
   1. Wykonaj pierwsze wyzwanie lub wyzwanie budzenia, dodając ^10-5 M fenylefryny do kąpieli tkankowej. Aby osiągnąć to stężenie w 50 ml kąpieli tkankowej, dodać 50 μl ^10-2 M roztworu fenylefryny.
      UWAGA: 50 μl w 50 ml PSS to rozcieńczenie 1/1000, więc końcowe stężenie jest 1000 razy mniejsze niż w przypadku produktu podstawowego, czyli ^10-5 M. Wiedza na temat objętości i konsekwentne utrzymywanie objętości w komorze kąpieli tkankowej ma kluczowe znaczenie dla określenia końcowego stężenia leku.
3. Dodaj ^10-5 M fenylefryny do kąpieli tkankowej i pozwól, aby skurcz osiągnął szczyt, a następnie ustabilizował się, gdy nachylenie danych spadnie do zera. Upewnij się, że rejestrujesz każde zdarzenie eksperymentalne, aby ułatwić analizę poeksperymentalną.
4. Po ustabilizowaniu należy dokładnie wypłukać agonistę, opróżniając i ponownie napełniając komorę kąpieli tkankowej nowym PSS. Upewnij się, że te zdarzenia również zostały zarejestrowane.
   UWAGA: Ogólna zasada jest taka, że stężenie agonisty w kąpieli zmniejsza się 10-krotnie przy każdym myciu. Chociaż może być konieczne więcej niż 3-4 prania, aby przywrócić tkankę do równowagi wyjściowego tonu (napięcia).
5. Pozwól tkance odpocząć w tonie wyjściowym przez ~10 minut przed kontynuowaniem.

7. Eksperyment

UWAGA: Prazosyna, antagonista receptora alfa adrenergicznego, zostanie wprowadzony do komory kąpieli tkankowej, aby przesunąć krzywą odpowiedzi na stężenie do fenylefryny (PE); jest to wyraźny antagonizm.

1. Do jednej kąpieli dodać nośnik (_H2O), w którym rozpuszczono prazosynę. Do innego dodaj odpowiednie stężenie prazosyny. W takim przypadku dodać 25 μl nośnika do jednej kąpieli i 25 μl ^10-5 M stężenia prazosyny do drugiej, aby uzyskać stężenie 5 x ^10-9 M lub 5 nM w kąpieli.
   UWAGA: Chociaż dodanie nośnika wydaje się niepotrzebne w tym przykładzie, konieczne jest to w przypadku korzystania z innych pojazdów, które mogą być wazoaktywne (np. DMSO, etanol, octan). Należy dodać odpowiedni nośnik, nawet jeśli istnieje niewiele dowodów na to, że jest on wazoaktywny.
2. Pozostawić nośnik/prazosynę w kąpieli i nie myć chusteczki przez 1 godzinę.
   1. Podczas gdy tkanki się równoważą, przygotuj wiele stężeń agonisty (PE). Obejmują szeroki zakres stężeń, od stężeń wywołujących brak odpowiedzi (np. ^10-9 M PE) do stężeń przekraczających maksymalną odpowiedź (np. ^10-4 M PE). Ponieważ krzywe stężenie-odpowiedź mają charakter logarytmiczny, należy przygotować sześć oddzielnych roztworów podstawowych PE (10-6-10-1 M) przez seryjne rozcieńczenia z ^10-1 M roztworu podstawowego. Upewnij się, że objętość potrzebna dla każdego stężenia jest nieco większa niż trzykrotność całkowitej objętości potrzebnej dla wszystkich kąpieli (tj. >300 μl).
3. Przystąpić do dodawania agonisty, jak opisano w Tabeli 1.
   UWAGA: Ten eksperyment wygeneruje krzywą skumulowanego stężenia-odpowiedzi na PE; Każda iteracja uwzględnia ilość substancji już dodanej do kąpieli. Dodawanie następuje do momentu, gdy przestaną zwiększać skurcz lub cała krzywa ustabilizuje się.
   1. Dodawać każde stężenie leku indywidualnie, aż do osiągnięcia progu tkankowego.
   2. Jeżeli nie nastąpi żadna zmiana, dodać następne stężenie w szeregu; patrz tabela 2.
      UWAGA: Czas tych dodatków zależy od zastosowanego agonisty. Na przykład skurcz noradrenaliny i fenylefryny rozwija się szybko i powinien ustabilizować się w ciągu kilku minut. Natomiast skurcz endoteliny-1 rozwija się powoli i może nie ustabilizować się przez blisko 45 minut. Inne eksperymenty można przeprowadzić na tkance po skonstruowaniu krzywej takiej jak ta, o ile (1) substancja zostanie wypłukana; oraz (2) można wykazać, że tkanka powraca do normalnego zachowania skurczowego i nie ma na nią wpływu poprzednie stymulacje.

8. Analiza danych

1. Pamiętaj, aby zapisać dane bezpośrednio przed i po interwencji (np. wybudzeniu lub pełnej krzywej).
2. Znajdź i ustaw linię bazową tkanek dla każdej komory kąpieli tkankowej/kanału wejściowego, co pomoże w analizie danych.
3. Po ustaleniu linii podstawowej znajdź maksymalną odpowiedź dla każdego stężenia i zapisz zmianę w stosunku do wartości wyjściowej. Sekwencyjnie przechodź przez każde ze stężeń i zapisuj przesunięcie linii podstawowej.
4. Wykres danych wynikowych. Zrób to w dowolnym programie graficznym.
   UWAGA: Graph Pad Prism jest przeznaczony dla farmakologów i jest idealny do rodzaju prezentowanego tutaj eksperymentu.

Wyniki

Jeśli chodzi o agonizm, względna skuteczność (E_MAX) i siła działania (EC₅₀) agonisty w danej tkance może być obliczona i porównana z odpowiedziami innych agonistów w tej samej tkance¹. W naszym eksperymencie aortę piersiową szczura inkubowano z nośnikiem lub antagonistą receptora adrenergicznego α₁ prazosyną (5 nM) przez godzinę przed dodaniem agonisty adrenergicznego α₁ fenylefryny do kąpieli tkankowej i wywołaniem skurczu (ryc. 1).

Rysunek 2 przedstawia zmodyfikowane wyniki Rysunku 1. Zielone odpowiedzi oznaczały maksymalny skurcz osiągnięty przez PE oznaczony jako maksimum, maksymalny skurcz 1/2 oznaczony jako taki, a następnie powiązany ze stężeniem PE, które spowodowało tę reakcję. Identyfikacja tych wartości polega na określeniu skutecznego stężenia agonisty, który osiąga połowę maksymalnej (50%) odpowiedzi lub wartość EC₅₀. Zostało to zrobione graficznie w tym przykładzie. Oprogramowanie komputerowe, które wykorzystuje funkcje logistyczne dla krzywych sigmoidalnych, może być używane do dopasowywania krzywych i obliczania wartości EC₅₀.

Przy generowaniu i interpretacji tych wyników, ważne jest, aby używać zarówno niskich, jak i wysokich stężeń agonisty do tworzenia krzywej stężenie-odpowiedź. Bez wystarczającej liczby punktów, aby pokazać stabilną linię bazową i maksymalne plateau, EC₅₀ i E_MAX można tylko oszacować. Zostało to zrobione graficznie w tym przykładzie. Oprogramowanie komputerowe, które wykorzystuje funkcje logistyczne dla krzywych sigmoidalnych, może być używane do dopasowywania krzywych i obliczania wartości EC₅₀.

Rysunek 1: Schemat kąpieli tkankowej. Rysunek przedstawiający pierścień tkanki umieszczony w dwuściennej kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym. Dopływ i odpływ bufora regulowany jest za pomocą 3-drogowego szklanego kranu zintegrowanego z dnem studzienki. O₂ / CO₂ jest wprowadzany przez aerator, który jest uszczelniony uszczelką, aby zapobiec wyciekowi PSS lub gazu. Wejście recyrkulacji znajduje się poniżej wyjścia, aby utrzymać prawidłową recyrkulację i zapobiec tworzeniu się kieszeni powietrznych, które mogłyby spowodować rozregulowanie temperatury.

Rycina 2: Aorta piersiowa szczura + śródbłonek. Powyższy rysunek przedstawia cztery oddzielne eksperymenty (różne zwierzęta i przeprowadzone przez różnych badaczy na różnych ustawieniach, reprezentowanych przez różne kolory) w celu przetestowania zdolności prazosyny do zmiany skurczu wywołanego przez PE. Prazosyna (5 nM) wyraźnie przesunęła krzywą skurczu wywołaną przez PE w prawo w sposób równoległy.

Rycina 3: Aorta piersiowa szczura + śródbłonek. Graficzne oszacowanie wartości EC₅₀ dla PE przy braku (nośniku) i obecności (prazosyna) antagonisty. Zaznaczona jest tylko zielona linia (grupa C).

pkt. szt. pkt. powiedział: pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. szt. pkt.

sól	MW (g/mol)	5 litrów	FINAŁ mM
			(gramy)
Zawartość NaCl	Klasa 58,45	Kwota 37,99	130
Kcl	74,56	Pytanie 1,75	Rozdział 4.7
KH2PO4	136,1	0,8	Pytanie 1,18
MgSO4•7H20	246,5	Godzina 1,45	Pytanie 1,17
NaHCO3	84,21	Godzina 6,25	Norma 14,9
Dekstroza	180,16	5	Rozdział 5.5
Edta	380	0,05	0,03

Tabela 1: Przepis na normalny fizjologiczny roztwór soli (PSS). Zawartość buforowanego wodorowęglanem PSS użytego w tym doświadczeniu. Uwzględniono masy cząsteczkowe wszystkich soli oraz ilość dodaną do 5 l dH₂O w celu uzyskania pożądanego stężenia.

szt.

Koncentracja w kąpieli	Dodanie agonisty do kąpieli
1 x 10-9 m	50 ml 1 x 10-6 M
3 x 10-9 m	100 ml 1 x 10-6 M
1 x 10-8 m	35 ml 1 x 10-5 M
3 x 10-8 m	100 ml 1 x 10-5
1 x 10-7 m	35 ml 1 x 10-4 M
3 x 10-7 m	100 ml 1 x 10-4 M
1 x 10-6 m	35 ml 1 x 10-3 M
3 x 10-6 m	100 ml 1 x 10-3 M
1 x 10-5 m	35 ml 1 x 10-2 M
3 x 10-5 m	100 ml 1 x 10-2 M
1 x 10-4 m	35 ml 1 x 10-1 M

Tabela 2: Stężenia agonistów dodatków do kąpieli tkankowych. Ilość agonisty, którą należy dodać do każdej kąpieli, aby prawidłowo skonstruować skumulowane krzywe stężenie-odpowiedź. Pożądane stężenie w kąpieli uzyskuje się poprzez dodawanie kolejnych ilości rosnących stężeń agonisty. Każdy dodatek uwzględnia stężenie agonisty już obecnego w kąpieli. Ma to na celu zminimalizowanie wzrostu objętości w kąpieli tkankowej, który wynikałby ze stosowania zwiększających się objętości pojedynczego stężenia agonisty.

Dyskusja

Pomiar siły izometrycznej jako narzędzie badawcze ma ponad 150 lat, ale nadal jest prototypową techniką charakterystyki receptorów w tkankach kurczliwych². Siła tej techniki tkwi w jej prostocie i wszechstronności: rejestrując reakcje wywołane rosnącym stężeniem agonisty w obecności lub bez antagonisty, można uzyskać niezliczone informacje na temat charakterystyki farmakologicznej każdego leku i receptora, z którym się wiąże^3-5. Eksperymenty tego typu zbierają również informacje na temat konkurencyjnego i niekonkurencyjnego charakteru zastosowanych antagonistów, a także heterogeniczności receptorów i nieswoistego działania leków^6-8. W ten sposób, dzięki prostym permutacjom tego izolowanego eksperymentu z kąpielą tkankową, można wygenerować stosunkowo kompletny profil farmakologiczny receptorów, które pośredniczą w skurczu mięśni wywołanym przez agonistę.

Jeśli chodzi o agonizm, można obliczyć względną skuteczność (E_MAX) i siłę działania (EC₅₀) agonisty w danej tkance i porównać je z odpowiedziami innych agonistów w tej samej tkance¹. W naszym eksperymencie aortę piersiową szczura inkubowano z nośnikiem lub antagonistą receptora adrenergicznego α₁ prazosyną (5 nM) przez jedną godzinę przed dodaniem agonisty adrenergicznego α₁ fenylefryny do kąpieli tkankowej i wywołaniem skurczu. Rysunek 2 przedstawia zmodyfikowane wyniki rysunku 1. Zielone reakcje zostały oznaczone maksymalnym skurczem osiągniętym przez PE oznaczonym jako maksimum, maksymalnym skurczem 1/2 oznaczonym jako taki, a następnie powiązanym ze stężeniem PE, które spowodowało tę reakcję. Identyfikacja tych wartości polega na określeniu skutecznego stężenia agonisty, który osiąga połowę maksymalnej (50%) odpowiedzi lub wartość EC₅₀ .

Niestety, stosowanie samych parametrów zależnych od agonisty do określenia charakterystyki wiązania receptora może być skomplikowane⁹. Idealnie byłoby, gdyby dodatkowe eksperymenty z wykorzystaniem antagonistów receptorów pozwoliły na obliczenie dwóch ważnych parametrów, które są kluczowe dla zdefiniowania interakcji między lekiem a receptorem: -log₁₀ stałej dysocjacji antagonisty (pK_B) i -log₁₀ stężenia molowego antagonisty niezbędnego do wywołania dwukrotnego przesunięcia w prawo w krzywej stężenie-odpowiedź (pA₂)¹⁰. Zarówno K_{, B}, jak i pA2 zyskują swoją użyteczność dzięki temu, że są wartościami niezależnymi od agonistów i pozostają stałe nawet między różnymi tkankami¹¹. Na podstawie danych przedstawionych na rysunku 2 pK_B można obliczyć za pomocą następującego równania i na podstawie wartości EC₅₀ obliczonych w innym miejscu:

EC₅₀ przy braku prazosyny = 2 x ^10-8 M
EC₅₀ w obecności prazosyny = 7 x ^10-6 M

Rozwiąż dla K_B w następującym równaniu:
log (dr-1) = log [B] - log KB
Gdzie:
[B] = stężenie antagonisty, czyli 5 x ^10-9 M. log (5 x ^10-9 M) = -8,3
dr = stosunek dawki o wartości EC₅₀ w obecności antagonisty/EC₅₀ w przypadku nieobecności. Jeśli występuje przesunięcie w prawo, wartość ta będzie większa niż jeden. Więc:
dr = 7 x ^10-6 M/2 x ^10-8 M lub 700 x ^10-8 M/2 x ^10-8 M = 700/2 = 350
Podstawiając za [B] i dr:
log (350-1) = -8 - log K_B
2,54 = -8 - log KB
pK_B = 10,54

Ta wartość dla prazosyny jest zgodna z wartościami uzyskanymi, gdy prazosyna oddziałuje z receptorem adrenergicznym α₁^12,13, co sugeruje, że receptor adrenergiczny pośredniczący w skurczu fenylefryny jest receptorem adrenergicznym α₁.

Dla powodzenia tych eksperymentów kluczowe znaczenie ma kilka etapów. Tkanki muszą pozostać w PSS po rozbiorze, aby zapobiec utracie żywotności tkanek. Każdy izometryczny preparat mięśniowy ma optymalną zależność długość-napięcie, która generuje maksymalną siłę przeciwko napięciu biernemu^14,15. W eksperymencie opisanym w tym protokole optymalne napięcie bierne zostało wcześniej określone przez krótkie dodanie przyrostów 0,5 g napięcia biernego do tkanki. Tkanka powinna rozpocząć się bez tonu, a następnie po 30 minutach równowagi tkanka została poddana prowokacji maksymalnym stężeniem KCl (80 mM), co wygenerowało aktywny ton. Następnie tkankę przemyto i pozostawiono do powrotu do tonu wyjściowego. Po 15 minutach na linii bazowej umieszczono kolejne 0,5 g napięcia pasywnego i proces ten powtarzano aż do osiągnięcia plateau napięcia aktywnego z dodatkowym napięciem pasywnym. We wstępnych eksperymentach określono całkowite napięcie bierne 4 g w celu osiągnięcia maksymalnego generowania napięcia czynnego w pierścieniach aortalnych, a zatem ta całkowita ilość napięcia jest wywierana na pierścienie przed zrównoważeniem. Proceduralnie najlepiej jest wyzerować wcześniejsze pasywne zastosowanie napięcia, ale można to zrobić w dowolnym momencie przed eksperymentem. Nadmierne rozciąganie tkanek, w dowolnym momencie eksperymentu lub sekcji, negatywnie wpłynie na żywotność tkanek i wyniki eksperymentu. Jest to najbardziej konieczne przy umieszczaniu tkanek w wannie, ponieważ ten krok wiąże się z największym prawdopodobieństwem nadmiernego rozciągnięcia. Aby uzyskać powtarzalne efekty, wymagane jest odpowiednie mycie, pod względem liczby i czasu trwania. Drugie prowokację zbyt wcześnie po początkowym prowokacji lub zanim tkanki powrócą do napięcia wyjściowego, spowoduje nieprawidłowe reakcje. W przypadku badań nad odwracalnymi antagonistami/inhibitorami, nie należy myć tkanek przed dodaniem agonisty, ponieważ stężenie inhibitora zostanie zmniejszone.

Istnieją znaczące zalety i wady izolowanych testów w kąpieli tkankowej.

Niedogodności: Tkanki mogą ulec różnym uszkodzeniom podczas chirurgicznego usuwania lub zakładania pierścieni na haczyki. Ponieważ komórka śródbłonka jest wewnętrzną wyściółką pierścienia aortalnego, należy zachować ostrożność przy umieszczaniu pierścienia na haczykach, aby nie uszkodzić tej warstwy komórek. Tkanki mogą również mieć wyraźnie różną długość czasu, w którym są żywotne w kąpieli tkankowej, i należy to ustalić; Nie wszystkie tkanki są takie same. W związku z tym tkanki mogą zmieniać swoją reakcję w ciągu dnia, tak że kontrola czasu staje się niezbędną kontrolą dla każdego eksperymentu. Dobrym tego przykładem jest tchawica świnki morskiej, która poprawia kurczliwość maksymalnie o 100% podczas typowego 8-godzinnego eksperymentu. Leki, które są słabo rozpuszczalne w wodzie, mogą wytrącać się w PSS. Wreszcie, kumulatywne i niekumulatywne dodawanie leku, który jest agonistą, może skutkować różnymi wynikami, jeśli nastąpi odczulenie receptora na agonistę; angiotensyna II jest jednym z takich leków, który wykazuje szybką tachyfilaksję.

Zalety: Jedną z głównych zalet eksperymentów z kąpielą tkankową jest to, że odbywa się ona w czasie rzeczywistym; Można obserwować przebieg eksperymentu w miarę jego rozwoju i szybko wyciągać wnioski i planować kolejne kroki, a także rozwiązywać problemy podczas eksperymentu. Eksperyment trwa jeden dzień. Z jednego zwierzęcia można zazwyczaj przygotować wiele tkanek, tak że zwierzę może służyć jako samodzielna kontrola, a to dodaje siły eksperymentowi. Można również odizolować tkankę od innych czynników, aby przetestować względnie czystą reakcję tkanki na lek. Eksperymenty in vitro , takie jak system kąpieli tkankowej, pozwalają również na użycie niewielkiej ilości leku w porównaniu z eksperymentem in vivo .

Opisany tu podstawowy schemat eksperymentu może być w znacznym stopniu modyfikowany, aby umożliwić rejestrację dodatkowych parametrów lub wprowadzenie innych bodźców zewnętrznych. Na przykład dodanie elektrod pozwala na stymulację nerwów unerwionych^{polem elektrycznym 16,17}. Po dodaniu sond termicznych lub pH można również zmierzyć wpływ temperatury i pH na reakcje skurczowe^18,19. Podobnie, tlen można częściowo lub całkowicie zastąpić_N2 w celu oceny efektów wywołanych hipoksją. Co więcej, te same podstawowe zasady izometrycznego pomiaru kurczliwości, które są używane w tym filmie, mogą być wykorzystane do opracowania systemów, które umożliwiają jednoczesny pomiar rozwoju napięcia izometrycznego i zmian wewnątrzkomórkowego wapnia²⁰. Transdukcja sygnału jest również łatwo badana, ponieważ istnieją systemy, które mogą szybko zamrozić próbkę tkanki podczas odpowiedzi, tak że aktywność systemu szlaku transdukcji sygnału można zweryfikować biochemicznie.

Różnorodność sprzętu, który można do tego wykorzystać, jest ogromna. Cały ten system, zarówno ręcznie zbudowany, jak i zautomatyzowany, można kupić w wielu różnych firmach. Kąpiele tkankowe i uchwyty na tkanki używane w tym protokole były ręcznie dmuchane (kąpiele tkankowe) i ręcznie konstruowane (uchwyty) przez wewnętrzne warsztaty mechaniczne Uniwersytetu Stanowego Michigan.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oprogramowanie LabChart	ADInstruments		7.2
PowerLab (4 kanały)	ADInstruments	ML760
QuadBridge (4 kanały)	ADInstruments	ML112	ML112
adaptera trawy	ADInstruments	MLAC11	MLAC11
Przetwornik siły przemieszczenia trawy	Grass Instrument Co	FT03	FT03
przetwornika trawy	Grass Instrument Co	TAC-7 REV-1
	BNC do BNCADInstruments	MLAC01
IsoTemp 2100	Fisher Scientific		IC-2100
Kąpiel tkankowa	Wiele źródeł
Fizjologiczny roztwór			PSS
Pleciony jedwabny szew	Aparat Harvard	51-7615	SP104
Stojak na pierścionki	Humboldt MFG Co	H-2122 7
Naczynia preparacyjne	Ręcznie robione z silikonową
rurką Tygon	Zaciski do węży VWR Scientific	63010-100	R-3603
	Cole-Parmer Instrument Co	06832-08	SNP-8
50 ml Kąpiel mięśniowa	Eberhartglass	Niestandardowe
komory grzewcze 250 ml	Eberhartglass Blowing	Niestandardowa
rurka dyspersyjna	Ace Glass	7202-06	7202-02
Niestandardowe stojaki
Zaciski trójbolcowe	Złącze S VWR International		Talon
	VWR International		Talon
	Ręcznie robione w domu	Niestandardowe
rozwarstwianie
Mikroskop stereoskopowy Leica MZ6	Mikroskop Leica		10447254
Stereomaster Światłowodowe źródło światła	Fisher Scientific	12562-36	12562-36
Kultura Petriego	Pyrex		7740 Szklany
elastomer silikonowy	Sylgard Dow Corning		Sylgard 170 Zestaw
Vannas Nożyczki	George Tiemann & Co	160-150	160-150
Drzazga & Kleszcze mocujące	George Tiemann & Co	160-55	160-55