Artykuł metodologiczny

Modelowanie 3D komór bocznych i charakterystyka histologiczna tkanki okołokomorowej u ludzi i myszy

DOI:

10.3791/52328

⸱

19 maja 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Neurobiology, University of Connecticut, 2Department of Anatomic Pathology and Laboratory Medicine, University of Connecticut Health Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z rezonansu magnetycznego (człowieka), oprogramowania do obrazowania 3D i analizy immunohistologicznej, dokumentujemy zmiany w bocznych komorach mózgu. Podłużne mapowanie 3D zmian objętości komór bocznych i charakterystyka okołokomorowych zmian komórkowych, które zachodzą w ludzkim mózgu z powodu starzenia się lub choroby, są następnie modelowane u myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ komorowy przenosi i cyrkuluje płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) oraz ułatwia usuwanie substancji rozpuszczonych i toksyn z mózgu. Jednostkami funkcjonalnymi komór są rzęskowe komórki nabłonkowe zwane komórkami wyściółki, które wyściełają komory i poprzez działanie rzęskowe są zdolne do generowania laminarnego przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego na powierzchni komory. Ta monowarstwa komórek wyściółki zapewnia również funkcje barierowe i filtracyjne, które promują wymianę między płynami śródmiąższowymi mózgu (ISF) a krążącym płynem mózgowo-rdzeniowym. Zmiany biochemiczne w mózgu znajdują zatem odzwierciedlenie w składzie płynu mózgowo-rdzeniowego, a zniszczenie wyściółzki może zakłócić delikatną równowagę wymiany płynu mózgowo-rdzeniowego i ISF. U ludzi istnieje silna korelacja między rozszerzaniem się komór bocznych a starzeniem się. Związana z wiekiem powiększenie komór może wystąpić nawet przy braku demencji lub utrudnienia przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego. Dokładna przyczyna i postęp powiększenia komór jest często nieznana; Jednak powiększone komory mogą wykazywać regionalną i często rozległą utratę pokrycia komórek wyściółki z astroglejozą powierzchniową komory i związanym z nią obrzękiem okołokomorowym zastępującym funkcjonalną monowarstwę komórek wyściółki. Korzystając ze skanów MRI wraz z pośmiertną ludzką tkanką mózgową, opisujemy, jak przygotować, zobrazować i skompilować renderingi 3D objętości komór bocznych, obliczyć objętość komór bocznych i scharakteryzować tkankę okołokomorową poprzez analizę immunohistochemiczną preparatów tkankowych ściany bocznej komory en face. Przedstawiono również odpowiednie analizy tkanki mózgowej myszy, co potwierdza wykorzystanie modeli mysich jako środka do oceny zmian w komorach bocznych i tkance okołokomorowej występujących w procesie starzenia się i choroby człowieka. Razem protokoły te umożliwiają badanie przyczyny i skutku powiększenia komór i podkreślają techniki badania zdrowia układu komorowego oraz jego ważnych funkcji barierowych i filtracyjnych w mózgu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monowarstwa komórek wyściółki wyściela układ komorowy mózgu, zapewniając dwukierunkową barierę i funkcje transportowe między płynem mózgowo-rdzeniowym (CSF) a płynem śródmiąższowym (ISF) 1-3. Funkcje te pomagają utrzymać mózg wolny od toksyn i w równowadze fizjologicznej 2,3. U ludzi utrata części tej wyściółki w wyniku urazu lub choroby nie wydaje się powodować wymiany regeneracyjnej, jak ma to miejsce w przypadku innych wyściółki nabłonkowej; Wydaje się raczej, że utrata pokrycia komórek wyściółki powoduje astroglejozę okołokomorową z siatką astrocytów pokrywającą obszary pozbawione komórek wyściółki na powierzchni komory. Przewiduje się, że utrata tej warstwy nabłonkowej 1,2,4-7 będzie miała poważne reperkusje dla ważnych mechanizmów wymiany i oczyszczania płynów CSF/ISF.

Wspólną cechą starzenia się człowieka jest powiększenie komór bocznych (ventriculomegalia) i związany z tym obrzęk okołokomorowy, co zaobserwowano za pomocą MRI i odzyskiwania inwersji osłabionej płynem MRI (MRI/FLAIR) 8-14. Aby zbadać związek między powiększeniem komór a organizacją komórkową wyściółki komory, pośmiertne sekwencje MRI człowieka dopasowano do preparatów histologicznych tkanki okołokomorowej komór bocznych. W przypadku powiększenia komór znaczne obszary glejozy zastąpiły pokrycie komórkami wyściółki wzdłuż ściany komory bocznej. Gdy ekspansja komory nie została wykryta za pomocą analizy objętości opartej na MRI, wyściółka komórek wyściółki była nienaruszona, a glejoza nie została wykryta wzdłuż wyściółki komory 6. To kombinatoryczne podejście stanowi pierwszą kompleksową dokumentację szczegółowo opisującą zmiany w integralności komórkowej wyściółki komory bocznej przy użyciu całościowego przygotowania porcji lub całej ściany komory bocznej oraz modelowania 3D objętości komór 6. Niektóre choroby (choroba Alzheimera, schizofrenia) i urazy (urazowe uszkodzenie mózgu) wykazują powiększenie komór jako wczesną cechę neuropatologiczną. Przewiduje się, że denuzja obszarów wyściółki komórki wyściółki zakłóca normalne funkcjonowanie komórek wyściółki i narusza równowagę homeostatyczną między wymianą płynu CSF / ISF a substancją rozpuszczoną. Tak więc dokładniejsze badanie zmian w układzie komorowym, jego składzie komórkowym i konsekwencjach dla leżących poniżej lub sąsiednich struktur mózgu ostatecznie zacznie ujawniać więcej na temat neuropatologii związanej z powiększeniem komór.

Brak danych do obrazowania multimodalnego, a w szczególności sekwencji danych podłużnych, wraz z ograniczonym dostępem do odpowiednich histologicznych próbek tkanek utrudnia analizę patologii ludzkiego mózgu. Modelowanie fenotypów występujących w starzeniu się lub chorobie człowieka można często osiągnąć za pomocą modeli mysich, a modele zwierzęce stają się jednym z naszych najlepszych sposobów na zbadanie pytań dotyczących inicjacji i progresji choroby u człowieka. Kilka badań na zdrowych młodych myszach opisało cytoarchitekturę ścian komór bocznych i leżącej pod nimi niszy komórek macierzystych 4,7-15. Badania te zostały rozszerzone o modelowanie 3D i analizę komórkową ścian komór poprzez starzenie się 6,15. U starszych myszy nie obserwuje się ani glejozy okołokomorowej, ani powiększenia komór, raczej myszy wykazują stosunkowo solidną niszę komórek macierzystych strefy podkomorowej (SVZ) przylegającą do nienaruszonej wyściółki komórek wyściółki 6,15. Tak więc uderzające różnice specyficzne dla gatunku istnieją zarówno w ogólnym utrzymaniu, jak i integralności wyściółki komory bocznej podczas procesu starzenia się 6,15. Dlatego, aby jak najlepiej wykorzystać myszy do badania warunków występujących u ludzi, różnice między tymi dwoma gatunkami muszą zostać scharakteryzowane i odpowiednio uwzględnione w każdym paradygmacie modelowania. W tym miejscu przedstawiamy procedury oceny zmian podłużnych w komorach bocznych i związanej z nimi tkance okołokomorowej zarówno u ludzi, jak i myszy. Nasze procedury obejmują renderowanie 3D i wolumetrię komór myszy i ludzi, a także wykorzystanie analizy immunohistochemicznej całych preparatów tkanki okołokomorowej w celu scharakteryzowania zarówno organizacji, jak i struktury komórkowej. Razem procedury te zapewniają środki do scharakteryzowania zmian w układzie komorowym i związanej z nim tkance okołokomorowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Connecticut i są zgodne z wytycznymi NIH. Analiza i procedury dotyczące tkanek ludzkich i danych były zgodne z IRB University of Connecticut i zatwierdzone przez nie oraz zgodne z wytycznymi NIH.

1. Mysz: Analiza integralności komórkowej okołokomorowej i modelowanie 3D komory bocznej

1.1) Przygotowanie całych mocowań ścian komór bocznych myszy

  1. Przygotować całe mocowania komór bocznych myszy do immunohistochemii (IHC), jak opisano wcześniej 16,17.

1.2) Immunohistochemia do analizy komór bocznych

  1. Napraw i wytnij tkankę mózgową myszy zgodnie z wcześniejszym opisem 18,19.
    1. Krótko mówiąc, przepłukać myszy przezsercowo normalną solą fizjologiczną o temperaturze pokojowej, aż narządy zostaną oczyszczone (na co wskazuje blade zabarwienie), a następnie w temperaturze pokojowej 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS), aż tkanka stwardnieje.
    2. Usuń mózg z czaszki. Użyj nożyczek do preparowania tęczówki, aby przeciąć od podstawy czaszki wzdłuż szwu strzałkowego.
    3. Odsłoń czaszkę i usuń mózg kleszczami. Zanurz mózg w utrwalaczu 4% PFA na noc w temperaturze 4 °C. Następnie umyj 3 razy przez 20 minut za pomocą PBS.
  2. Przygotuj skrawki seryjne do immunohistochemii i analizy objętościowej.
    1. Za pomocą skalpela mikrochirurgicznego wykonaj małe nacięcie wzdłużnie wzdłuż kory lewej półkuli, aby umożliwić identyfikację lewej półkuli od prawej półkuli, gdy pływające odcinki są wybarwione immunologicznie.
    2. Pokryj utrwalone mózgi 3% agarozą, aby uzyskać dodatkowe wsparcie strukturalne podczas sekcji wibratomowej. Podgrzej 3% agarozy w wodzie destylowanej (w/v) aż do całkowitego rozpuszczenia za pomocą kuchenki mikrofalowej lub płyty grzejnej.
    3. Za pomocą żyletki usuń ogonową część mózgu przy móżdżku za pomocą cięcia koronalnego, pozostawiając płaską i równą powierzchnię. Nałóż super klej na etap tkankowy i umieść mózg na nowo wyciętej powierzchni z opuszkami węchowymi skierowanymi do góry.
    4. Gdy płynny roztwór agarozy ostygnie do temperatury tylko ciepłej w dotyku, nałóż równomiernie na mózg, aby całkowicie objąć cały mózg. Pozwól agarozie stężyć.
    5. Sekcja agarozy otoczyła mózgi koronalnie na wibratomie na sekcje 50 μm, z sekcjami umieszczonymi szeregowo na 24-dołkowej płytce zawierającej PBS w celu zachowania kolejności sekwencyjnej.
      UWAGA: Generalnie na jeden mózg używa się 12 dołków, przy czym pobieranie tkanki rozpoczyna się 5 sekcji przed pojawieniem się komór bocznych, zaczynając od dołka A1, przechodząc numerycznie do B6 i cyklicznie z powrotem do A1. Pozwala to na przetwarzanie wielu rozróżnialnych sekcji z tego samego mózgu w tej samej studzience. W przypadku analizy objętości komory bocznej pobieranie tkanek ustało, gdy komory boczne i trzecia komora łączą się, co daje około 3 odcinki na studzienkę lub łącznie 36 sekcji.
    6. Zassać PBS za pomocą pipety transferowej z końcówką mikropipety o pojemności 20-200 μl, aby upewnić się, że sekcje pływające nie zostaną przypadkowo zassane. Blokuj i przepuszczalność sekcji pływających w 10% surowicy, 0,1% Triton X-100 (TX) w PBS (PBS-TX) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Użyć 300 μl roztworu na studzienkę, aby pokryć swobodnie pływające skrawki tkanek na 24-dołkowej płytce i wykonać wszystkie inkubacje skrawków na kołyszącej się płytce.
    7. Odessać roztwór blokujący i inkubować skrawki z pierwszorzędowymi przeciwciałami w PBS-TX przez noc (co najmniej 12 godzin) w temperaturze 4 °C. W przypadku śladów objętości komór za pomocą odcinków koronalnych należy użyć przeciwciała anty-S100β do znakowania komórek wyściółki.
    8. Odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć sekcje 3 razy po 10 minut każdą PBS-TX.
    9. Inkubować skrawki w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi, w stężeniach 1:1,000 w 10% surowicy, PBS-TX. Utrzymuj sekcje w ciemności dla wszystkich pozostałych etapów inkubacji.
    10. Odessać roztwór przeciwciała drugorzędowego i inkubować skrawki z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem w PBS (DAPI, 10 μg/ml) przez 5 minut, aby przeciwdziałać barwieniu jąder komórkowych. Zassać roztwór DAPI i płukać sekcje 3 razy po 10 minut każda za pomocą PBS.
    11. Montuj sekcje szeregowo na szkiełkach za pomocą znacznika korowego, aby zachować orientację lewej i prawej półkuli. Wysusz sekcje na powietrzu w ciemności, a następnie nakryj szkiełko, nakładając cienką warstwę materiału montażowego na szkiełko i delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Pozostaw szkiełka nakryte do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.

1.3) Segmentacja komór bocznych w rekonstrukcjach 3D

UWAGA: Wykonaj śledzenie komór bocznych za pomocą oprogramowania do mapowania na pionowym mikroskopie epifluorescencyjnym z automatycznym stolikiem i cyfrową kamerą CCD do wykrywania fluorescencji.

  1. Włącz sprzęt mikroskopu fluorescencyjnego i uruchom oprogramowanie do mapowania w trybie fluorescencji. Otwórz "Opcje wyświetlania", aby załadować odpowiednie paski narzędzi i panele narzędzi dokowania potrzebne do śledzenia. Opcje>Opcje wyświetlania>Akcesoria i wybierz paski narzędzi 'Główny' i 'Znacznik'. W tym samym menu wybierz "Histogram aparatu", "Sterowanie wielokanałowe", "Ustawienia kamery" i "Akwizycja obrazu" w sekcji "Panele narzędzi dokowania".
  2. Obserwuj początki komór w oparciu o silną fluorescencję S-100β, która znakuje komórki wyściółki wyściełające komorę boczną. Zidentyfikuj pierwszy fragment tkanki zawierający komory boczne.
  3. Utwórz nowy plik danych i wyznacz punkt odniesienia dla ruchu sceny, klikając w oknie obrazu nad lewą komorą boczną. Poszukaj małego nacięcia, aby zorientować się w lewej od prawej półkuli. Utrzymuj punkt odniesienia w spójnym położeniu względem komór bocznych w plikach śledzenia, aby pomóc podczas importowania konturów do rekonstrukcji seryjnej.
  4. Wybierz odpowiedni wstępnie ustawiony typ konturu z menu rozwijanego konturu, np. "Lewa komora boczna". Użyj unikalnego koloru dla każdego z tras lewej i prawej komory bocznej. Jeśli wymagane są zmiany w nazwie i kolorze konturu, przejdź do Opcje>Preferencje wyświetlania>Kontury, a następnie zmień nazwy kolorów konturu lub wybierz opcję "Dodaj typ konturu".
  5. Po wybraniu konturu "Lewa komora boczna" kliknij wzdłuż wierzchołkowej powierzchni wyściółki wyściółki, aby rozpocząć kontur śladu. Prześledź komorę, kontynuując klikanie kolejno wzdłuż powierzchni wierzchołkowej.
    1. W przypadku nieregularnych obszarów wymagających większej finezji kliknij i przytrzymaj lewy przycisk myszy, aby obrysować wolną rękę. Naciśnij Ctrl+Z lub przejdź do pozycji Opcje>Cofnij, aby cofnąć poprzedni punkt konturu. Przesuń okno śledzenia za pomocą strzałek lub ustawiając punkt konturu poza ekranem i pozwalając na automatyczne wyśrodkowanie okna. Aby zakończyć śledzenie komory, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Zamknij kontur".
  6. Wybierz nowy kolor konturu (typ konturu) dla prawej komory bocznej za pomocą menu rozwijanego. Prześledź prawą komorę, jak w kroku 1.3.4 dla lewej.
  7. Jeśli wymagana jest zmiana nazwy i koloru konturu, kliknij kontur prawym przyciskiem myszy i wybierz Zmień typ konturu, aby wybrać odpowiedni kolor.
  8. Dodaj znaczniki wzdłuż linii środkowej, aby pomóc w wyrównaniu konturów szeregowych w celu rekonstrukcji 3D. Aby dodać znaczniki, wybierz odpowiedni znacznik (użyj "X") z paska narzędzi Znaczniki po lewej stronie i kliknij, aby upuścić je na ekranie śledzenia. Zaimportuj znaczniki wraz z konturami dla każdego śladu przekroju tkanki.
  9. Aby zapisać ślady tkanek, wybierz Plik>Zapisz dane Plik jako i utwórz nowy folder oraz nazwę pliku. Ponumeruj ślady [slajd #]-[tkanka #] w celu łatwej identyfikacji śladów z odcinków seryjnych. Na przykład trzecia sekcja tkanki na drugim slajdzie ma nazwę pliku "2-3" w katalogu dla każdego mózgu.
  10. Powtórzyć kroki od 1.3.4 do 1.3.9 dla każdego szeregowego odcinka tkanki mózgowej, aby prześledzić komory przez cały mózg, z wyłączeniem obszarów zrostu ściany komory.
  11. Jeśli komora ma obszar zrostu, podziel się na segmenty przedniego obszaru od tych grzbietowych i brzusznych do miejsca zrostu. Utwórz dwa nowe typy konturów dla każdej komory (np. "Lewa komora grzbietowa" i "Lewa komora brzuszna"). Na pierwszym wycinku tkanki z adhezją prześledź komorę boczną zarówno pierwotnym konturem komory bocznej, jak i nowymi konturami grzbietowymi i brzusznymi, aby zapewnić pełną rekonstrukcję komory.
  12. W sekcjach tylnych do przylegania ściany komory utwórz zestaw nowych kolorów konturu dla tylnej części każdej komory (np. "Tylna lewa komora"). Dwukrotnie prześledź ten pierwszy, ponownie połączony odcinek, zarówno z aktualnymi typami konturu, jak i nowymi typami konturu tylnego.

1.4) Rekonstrukcja 3D komory bocznej

  1. Wyrównaj i skompiluj szeregowe obrysy konturów bocznych komór myszy, aby wygenerować rekonstrukcje 3D i dane wolumetryczne.
  2. Otwórz program do rekonstrukcji 3D. Kliknij Plik>Otwórz i wybierz plik konturu pierwszej śledzonej sekcji szeregowej. Zaimportuj kontury lewej i prawej komory, a także wszelkie dodane znaczniki.
  3. Aby wybrać kontury, kliknij przycisk "Wybierz obiekty" (ikona kursora) i wybierz dwie komory i znaczniki, przytrzymując "Ctrl". Aby ustalić pozycję Z konturów, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Modyfikuj pozycję Z". Ustaw pierwszy plasterek tkanki na 0 μm.
  4. Aby zapisać rekonstrukcję, wybierz Plik>Zapisz plik danych jako. Zapisz po każdym zaimportowaniu pliku, więc jeśli popełnisz błąd, odzyskanie jest tak proste, jak ponowne załadowanie poprzedniego pliku.
  5. Aby dodać następny wycinek tkanki do rekonstrukcji, kliknij Plik>Dołącz do wyświetlania. Wybierz ikonę . DAT do dołączenia i zaznacz pole "Scal".
  6. Wykonaj kroki 1.4.3, aby ponownie dostosować pozycję Z nowo zaimportowanego pliku trasowania. Zaznacz tylko nowo dodane lewe i prawe kontury w oknie głównym, aby uniknąć przesuwania innych ścieżek. Ustaw każdy kolejny plik śledzenia na 50 μm od pozycji Z poprzedniego konturu dla odcinków 50 μm. (Pierwszy kontur: z = 0, drugi kontur: z = 50, trzeci kontur: z = 100 itd.)
  7. Aby dostosować położenie X, Y wybranych konturów i znaczników, kliknij przycisk "Włącz translację za pomocą myszy" i przeciągnij kontury, aby wyrównać je z poprzednimi konturami tkanki. Pozostaw zaznaczony zarówno lewy, jak i prawy kontur bieżącej ścieżki, aby umożliwić ruch synchroniczny.
  8. Aby obrócić ścieżki zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara w celu wyrównania znaczników linii środkowej, wybierz przycisk "Obrót osi Z". Aby odwrócić kontury w poprzek osi Y (jeśli lewy kontur znajduje się po prawej), wybierz zarówno zaimportowane kontury, jak i znaczniki, kliknij prawym przyciskiem myszy, wybierz "Ustaw kąt obrotu" i wprowadź "180" w polu "Obrót Y".
  9. Upewnij się, że znaczniki komór i linii środkowej są najlepiej wyrównane przed zapisaniem pliku rekonstrukcji, jak w kroku 1.4.4.
  10. Powtarzaj kroki od 1.4.5 do 1.4.9 dla każdego kolejnego wycinka tkanki, aż wszystkie zostaną zaimportowane i prawidłowo wyrównane.
  11. Aby wyświetlić dane objętościowe rekonstrukcji seryjnej, kliknij Analiza>'Analiza znaczników i regionów' i wybierz 'Podsumowanie konturów 3D'. Zaznacz wszystkie kontury w panelu po lewej stronie, a następnie kliknij przycisk "Wizualizacja 3D", aby wyświetlić ostateczną rekonstrukcję 3D.

2. Człowiek: analiza integralności komórkowej okołokomorowej i modelowanie 3D komory bocznej

2.1) Analiza danych z rezonansu magnetycznego człowieka

UWAGA: Wymienione są protokoły do tworzenia rekonstrukcji obrazów 3D i wolumetrycznej kwantyfikacji komór bocznych oraz oceny zmian objętościowych w czasie za pomocą analizy podłużnej nakładki. Należy zauważyć, że niezwykle ważnymi kryteriami włączenia zbiorów danych do zbioru danych są spójność w gromadzeniu danych MR (np. siła maszyny i magnesu, grubość, orientacja i rozdzielczość przekroju) oraz przetwarzanie po akwizycji 20.

  1. Segmentacja komór
    UWAGA: ITK/Snap służy do segmentacji komór na podstawie obrazów MR o wysokiej rozdzielczości T1-zależnych. Alternatywnie można użyć innego darmowego oprogramowania, takiego jak Freesurfer.
    1. Otwórz plik ITK/snap > otwórz obraz w skali szarości. Wybierz żądany plik i otwórz jako plik .nii (plik NITFI).
    2. Przewiń każdą płaszczyznę anatomiczną, zwracając uwagę na nieprawidłowości komorowe (zwężone obszary, duże lub małe rogi skroniowe itp.). W głównym przyborniku kliknij "Snake ROI Tool". Kliknij "Segment 3D". Wybierz opcję "Region intensywności".
    3. Kliknij "Wstępnie przetwarzaj obraz". Wybierz opcję "Powyżej", aby uwzględnić obszary poniżej określonego progu intensywności w celu podświetlenia ROI na biało. Rejestruj maksymalną intensywność za pomocą suwaka. Ustaw próg na 15% maksymalnej intensywności (zapisz tę wartość). Ustaw parametr gładkości na wartość 10. Kliknij "OK", a następnie "Dalej".
    4. Dodać 10-12 małych (rozmiar 2) "pęcherzyków" do każdej komory: po dwie w rogu czołowym przednim, siedem równomiernie rozmieszczonych wzdłuż górnej powierzchni korpusu komory bocznej, jeden w rogu potylicznym i jeden w rogu skroniowym komory bocznej. "Wybierz parametry" i ustaw siłę krzywizny na 0,4. Kliknij symbol odtwarzania, aby rozpocząć aktywną ewolucję konturu.
    5. Kliknij "Aktualizuj siatkę", aby zobrazować powierzchnię; zaznacz "Automatyczna aktualizacja". Zatrzymaj segmentację, gdy wszystkie obszary komory bocznej zostaną uwzględnione w obszarze zainteresowania (ROI). Unikaj włączenia trzeciej komory. Kliknij "Zakończ".
    6. W razie potrzeby ręcznie edytuj obraz, aby usunąć niepożądane obszary za pomocą następujących metod (zwykle trzeba usunąć wyciek z trzeciej komory). Ręcznie użyj narzędzia "Skalpel 3D", aby usunąć nadmiar obszarów lub ręcznie użyj narzędzia "Pędzel" z "Wyczyść etykietę" jako aktywną etykietą rysunku, aby usunąć wszelkie wtrącenia poza ROI.
    7. Zapisz wyniki segmentacji jako obraz .nii (format pliku 'NIFTI').
    8. Aby uzyskać całkowitą objętość komory, wybierz "Segmentacja>Objętość" i Statystyki; uzyskaj całkowitą objętość komory za pomocą ustawionej kolorowej etykiety.
  2. Podłużne przedstawienie komór bocznych z MRIScans
    UWAGA: Korzystając z oprogramowania Mango, nakłada się na siebie podłużne ROI, aby jakościowo i ilościowo wykazać zmiany objętości komór u badanych w czasie.
    1. Otwórz Mango. Kliknij pozycję Plik>Załaduj zwrot z inwestycji pierwszego punktu czasowego zwrotu z inwestycji (linii bazowej) na ZIELONY. Plik>Załaduj ROI drugiego punktu czasowego ROI jako CZERWONY. Zapisz nakładkę podłużną, wybierając Plik>Zapisz jako; Przypisz każdy obraz jako "plik name_[Wiek pierwszego punktu czasowego]-[Wiek drugiego punktu czasowego].nii".
    2. Otwórz ITK-SNAP. Otwórz ponownie połączony zwrot z inwestycji jako "obraz w skali szarości", wybierając opcję Segmentacja>Wczytaj z obrazu>połączony plik ROI. Aby uzyskać dane dotyczące objętości podłużnej, uruchom następujące czynności: Segmentacja>Objętość i statystyki>Etykieta 1 (czerwona) = objętość ekspansji; Etykieta 2 (zielona) = objętość zwężenia; Etykieta 3 (niebieska) = wolumin podstawowy.

2.2) Przygotowanie i analiza tkanek okołokomorowych człowieka

  1. Instrukcje bezpieczeństwa dotyczące pracy z tkanką ludzką
    1. Odbyć odpowiednie szkolenie w zakresie bezpieczeństwa (np. kurs dotyczący patogenów przenoszonych przez krew).
    2. Przestrzegać standardowych (uniwersalnych) środków ostrożności. Nosić rękawice. Zmień rękawice przed dotknięciem jakiegokolwiek wspólnego sprzętu lub powierzchni, które nie są jednorazowe. Oznacz wszystkie przedmioty rutynowo używane podczas pracy z tkankami ludzkimi oznaczeniami "wykorzystanie tkanek ludzkich".
    3. Postępuj zgodnie z praktykami odkażania dla wszystkich przedmiotów mających kontakt z tkankami ludzkimi. Wybielaj wszystkie zanieczyszczone płyny przez co najmniej 24 godziny przed usunięciem, zanieczyszczone powierzchnie potraktuj ręcznikiem nasączonym wybielaczem (np. blat stołu) lub umieszczając przedmioty bezpośrednio w wybielaczu (np. kleszcze).
    4. Przygotuj plan awaryjny na wypadek kontaktu z tkanką ludzką bezpośrednio na skórze, który może obejmować namoczenie ręcznika papierowego w wybielaczu i przytrzymanie dotkniętego obszaru (5-10 min).
    5. Używaj odpowiedniej utylizacji odpadów dla wszystkich przedmiotów mających kontakt z tkankami ludzkimi.
  2. Przygotowanie całego mocowania komory bocznej
    1. Zaczynając od nienaruszonej półkuli (utrwalonej w 10% formalinie i dokładnie spłukanej 0,1 M PBS), przekrój odcinki koronalne o grubości 1,5 cm przez całą półkulę za pomocą dużego noża.
      UWAGA: Wszystkie protokoły utrwalenia wymagają wcześniejszej weryfikacji przeciwciał.
    2. Oznacz sekcje od przodu do tyłu, zaczynając od pierwszej sekcji zawierającej komorę boczną. Użyj alfanumerycznego systemu etykietowania, oznaczając plasterki literami (od przodu do tyłu) i podsekcją cyframi (od góry do dołu). Unikaj naruszania powierzchni wyściółki.
    3. Za pomocą skalpela mikrochirurgicznego wypreparuj ścianę komory na głębokość 1 cm, zachowując jeden ciągły odcinek na całej ścianie bocznej. W razie potrzeby podziel ścianę, aby utworzyć sekcje o odpowiedniej wielkości do dobrego barwienia. Przekrój nacięcia po przeciwnej stronie ściany komory w celu określenia orientacji górnej/gorszej.
    4. Przeprowadzić pobieranie antygenu przez inkubację skrawków tkanki w 10 mM buforze cytrynianu sodu (pH 6,0) w temperaturze 100 °C przez 10-20 minut przy użyciu podwójnego kotła (optymalny czas inkubacji określa się empirycznie). Wypłukać 3 razy w PBS/0,1%Triton X-100 (PBS-TX).
    5. Zablokuj 10% końskiej surowicy za pomocą PBS/ PBS-TX przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. Aby uwidocznić wyściółkę ściany komory, immunostaina w całości montuje się za pomocą następujących kombinacji przeciwciał: mysia anty-β-katenina (1:250); kozy anty-GFAP (1:250); królik anty-AQP4 (1:400).
    7. Wszystkie kolejne kroki wykonuj w ciemności. Przepłukać tkankę 3 razy w PBS, inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi (1:500) przez 24 godziny w temperaturze 4 °C lub 2 godziny w temperaturze pokojowej i przepłukać kolejne 3 razy w PBS. Inkubować tkankę w DAPI przez 7 minut w temperaturze pokojowej, a następnie kolejne 3 płukania w PBS.
    8. Przygotuj tkankę do końcowego wycięcia, pokrywając dno woskowego naczynia parafilmem. Napełnij naczynie PBS, umieść tkankę w naczyniu za pomocą cienkich kleszczyków, unikając kontaktu ze ścianą wyściółki.
    9. Pod mikroskopem preparacyjnym mocno zabezpiecz tkankę na boku za pomocą szpilek. Za pomocą noża mikrochirurgicznego pod kątem 22,5° utwórz jednolite cienkie odcinki (o grubości około 300 μm) ściany bocznej komory. W przypadku dużych sekcji lub sekcji o trudnej krzywiźnie, pokrój w mniejszą kostkę przed pocięciem na końcowe sekcje do montażu i zwróć uwagę na lokalizację.
    10. Ostrożnie umieść wycięty odcinek wyściółka stroną do góry na szkiełku za pomocą drobnych kleszczy, zwracając uwagę na regionalne położenie i orientację na szkiełku. Przykryj chusteczkę cienką warstwą aquapolymount, uważając, aby nie powstały pęcherzyki. Umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce, w razie potrzeby dodaj dodatkowy aquapolymount, aby wypełnić wszelkie luki pod szkiełkiem nakrywkowym.
    11. Umieść zamontowane sekcje w ciemności i suche przez 2-3 dni w temperaturze pokojowej. Przechowywać w szkiełku w temperaturze 4 °C.
  3. Immunohistochemia i analiza histologiczna
    1. Używając mikroskopii konfokalnej do wyświetlenia immunohistochemii fluorescencyjnej, ustaw płaszczyznę ogniskową obrazowania na powierzchni komory, zgodnie z zastosowaniem β-kateniny (marker białek połączenia wierzchołkowych adherenów komórek wyściółki). Nakreśl obszary pokrycia komórek wyściółki i astrogleju powierzchniowego (barwienie GFAP na powierzchni komory).
    2. Aby udokumentować i zmontować całą powierzchnię komory, użyj nakładających się obrazów, aby pokryć całą powierzchnię. Aby utworzyć montaż obrazów seryjnych, otwórz program Adobe Photoshop. Użyj układu File>Automate>Photomerge>Interactive, aby wybrać obrazy do nałożenia, w razie potrzeby dokonując ręcznych korekt.
    3. Utwórz nową warstwę do śledzenia montażu, aby wygenerować kreskówkową reprezentację nienaruszonego pokrycia komórek wyściółki lub glejozy na powierzchni komory. Powtórz te czynności dla każdego slajdu lub ROI. Skompiluj wszystkie sekcje, aby zrekonstruować mapę ściany komory i połączyć się z odpowiednim regionem podczas rekonstrukcji MRI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śledzenie konturów bocznych komór myszy na podstawie immunologicznie wybarwionych przekrojów koronalnych 50 μm i rekonstrukcji 3D (Rysunek 3) pozwala na zbieranie danych objętościowych w różnych paradygmatach eksperymentalnych przy użyciu myszy jako systemu modelowego dla choroby lub urazu. Kluczowe znaczenie dla tej procedury ma wykluczenie obszarów, w których ściany komór bocznych przylegają do siebie. Dzieląc regiony komór na podsegmenty i wyznaczając inny kolor dla każdego regionu (ryc. 3C

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy narzędzia i protokoły, które można wykorzystać do oceny integralności układu komorowego mózgu u myszy i ludzi. Narzędzia te można jednak również zastosować do innych struktur mózgu lub układów narządów, które ulegają zmianom w wyniku urazu, choroby lub w procesie starzenia się 14,21,22. Przedstawione strategie wykorzystują oprogramowanie, które umożliwia wyrównanie przekrojowych i podłużnych sekwencji MRI w celu wygenerowania reprezentacji 3D objętości określonych regionów lub struktur będących p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

An NINDS Grant NS05033 (JCC) wsparł tę pracę. Programy University of Connecticut RAC, SURF i OUR zapewniły dodatkowe wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Life Technologies21600-069
Paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Nauki19210Stosować przy 4% w PBS, 4 ° C
Normal Horse SerumLife Technologies1605010% w PBS-TX (v/v)
Normal Goat SerumLife Technologies1621010% w PBS-TX (v/v)
Triton X-100 (TX)Sigma-AldrichT87870,1% w PBS (v/v)
VibratomeLeicaVT1000S
Mikroskop fluorescencyjnyZeissImager.M2
KameraHamamatsuORCA R2
Mikroskop Kontroler stopniaLudl Electronic ProductsMAC 6000
Oprogramowanie do stereologiiMBF BioscienceStereo Investigator 11
Oprogramowanie StereologyImageJ/NIHNIH freeware
Oprogramowanie do rekonstrukcji 3DMBF BioscienceNeurolucida Explorer
Mikroskop konfokalnyLeicaTCS SP2
Oprogramowanie
MRI Freesurferhttps://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstallSegmentacja i objętość
ITK-Snaphttp://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.phpSegmentacja i analiza objętości
wielu obrazów GUI (Mango)http://ric.uthscsa.edu/mango/ Nakładka wzdłużna
Całe wyposażenie montażowe
22,5° mikrochirurgiczny nóż prostyFisher ScientificNC9854830
parafilm
wosk dno naczynie preparacyjne 
szpilki cienkie
kleszcze
aquapolymount
Mikroskop preparacyjnyLeicaMZ95
Whole Mount Przeciwciała
mysz anty-b-kateninaBD Bioschiences, San Jose, CA, USA1:250
koza anty-GFAPSanta Cruz Biotechnology1:250
królik anty-AQP4 (akwaporyna-4)  Sigma-Aldrich1:400
Przeciwciała
Przeciwciała anty-S100 i betaSigma-Aldrich1:500
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Life TechnologiesD-130610 &mikro; g/ml w PBS
koronalne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
  2. Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid, ependyma and brain: toxicologic/pathologic phenomena, periventricular destabilization, and lesion spread. Toxicol Pathol. 39, 186-212 (2011).
  3. Roales-Bujan, R., et al. Astrocytes acquire morphological and functional characteristics of ependymal cells following disruption of ependyma in hydrocephalus. Acta Neuropathologica. 124, 531-546 (2012).
  4. Cserr, H. F. Physiology of the choroid plexus. Physiol Rev. 51, 273-311 (1971).
  5. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, 147ra111(2012).
  6. Shook, B. A., et al. Ventriculomegaly associated with ependymal gliosis and declines in barrier integrity in the aging human and mouse brain. Aging Cell. , (2013).
  7. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342, 373-377 (2013).
  8. Fazekas, F., et al. Pathologic correlates of incidental MRI white matter signal hyperintensities. Neurology. 43, 1683-1689 (1993).
  9. Meier-Ruge, W., Ulrich, J., Bruhlmann, M., Meier, E. Age-related white matter atrophy in the human brain. Ann N Y Acad Sci. 673, 260-269 (1992).
  10. Resnick, S. M., Pham, D. L., Kraut, M. A., Zonderman, A. B., Davatzikos, C. Longitudinal magnetic resonance imaging studies of older adults: a shrinking brain. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 23, 3295-3301 (2003).
  11. Sener, R. N. Callosal changes in obstructive hydrocephalus: observations with FLAIR imaging, and diffusion MRI. Comput Med Imaging Graph. 26, 333-337 (2002).
  12. Sze, G., et al. Foci of MRI signal (pseudo lesions) anterior to the frontal horns: histologic correlations of a normal finding. AJR Am J Roentgenol. 147, 331-337 (1986).
  13. Tisell, M., et al. Shunt surgery in patients with hydrocephalus and white matter changes. Journal of Neurosurgery. 114, 1432-1438 (2011).
  14. Valdes Hernandez Mdel, C., et al. Automatic segmentation of brain white matter and white matter lesions in normal aging: comparison of five multispectral techniques. Magn Reson Imaging. 30, 222-229 (2012).
  15. Shook, B. A., Manz, D. H., Peters, J. J., Kang, S., Conover, J. C. Spatiotemporal changes to the subventricular zone stem cell pool through aging. The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 32, 6947-6956 (2012).
  16. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
  17. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
  18. Luo, J., Daniels, S. B., Lennington, J. B., Notti, R. Q., Conover, J. C. The aging neurogenic subventricular zone. Aging Cell. 5, 139-152 (2006).
  19. Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. J Neurosci. 28, 3804-3813 (2008).
  20. Marcus, D. S., Fotenos, A. F., Csernansky, J. G., Morris, J. C., Buckner, R. L. Open access series of imaging studies: longitudinal MRI data in nondemented and demented older adults. J Cogn Neurosci. 22, 2677-2684 (2010).
  21. Giorgio, A., De Stefano, N. Clinical use of brain volumetry. J Magn Reson Imaging. 37, 1-14 (2013).
  22. Caspers, S., et al. Studying variability in human brain aging in a population-based German cohort-rationale and design of 1000BRAINS. Front Aging Neurosci. 6, 149(2014).
  23. Keuken, M. C., et al. Ultra-high 7T MRI of structural age-related changes of the subthalamic nucleus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 4896-4900 (2013).
  24. Marti-Bonmati, L., Sopena, R., Bartumeus, P., Sopena, P. Multimodality imaging techniques. Contrast Media Mol Imaging. 5, 180-189 (2010).
  25. Bergmann, O., et al. The age of olfactory bulb neurons in humans. Neuron. 74, 634-639 (2012).
  26. Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
  27. Wang, C., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21, 1534-1550 (2011).
  28. Carmen Gomez-Roldan, D. el, M,, et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507, 1571-1587 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obj to kom rrekonstrukcja 3Danaliza immunohistochemicznakom rki ependymalneskany MRItkanka m zgu myszymikroskopia konfokalnakomoromegalia

Powiązane artykuły