Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Summary

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Abstract

Mikrodysekcja laserowa (LCM) służy do izolowania skoncentrowanej populacji pojedynczych komórek lub precyzyjnych obszarów anatomicznych tkanki z wycinków tkanek na szkiełku mikroskopowym. W połączeniu z immunohistochemią, LCM może być stosowany do izolowania poszczególnych typów komórek na podstawie określonego markera białkowego. W tym miejscu opisano technikę LCM do zbierania określonej populacji neuronów dopaminowych bezpośrednio znakowanych immunohistochemią hydroksylazy tyrozynowej oraz do izolacji neuronu dopaminowego zawierającego region brzusznego obszaru nakrywki za pomocą pośredniej immunohistochemii hydroksylazy tyrozyny na odcinku przylegającym do tych stosowanych do LCM. Laser przechwytujący w podczerwieni (IR) jest używany zarówno do preparowania pojedynczych neuronów, jak i brzusznego obszaru nakrywki ze szklanych szkiełek i na nasadkę LCM w celu analizy. Całkowite odwodnienie tkanki za pomocą 100% etanolu i ksylenu ma kluczowe znaczenie. Połączenie lasera przechwytującego podczerwień i lasera tnącego ultrafioletowego (UV) służy do izolowania pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki podczas korzystania ze szkiełek membranowych PEN. Szkiełko z membraną PEN ma znaczące zalety w porównaniu ze szkiełkiem szklanym, ponieważ zapewnia lepszą spójność w wychwytywaniu i zbieraniu komórek, szybciej zbiera duże kawałki tkanki, jest mniej zależne od odwodnienia i powoduje całkowite usunięcie tkanki ze szkiełka. Chociaż usunięcie dużych obszarów tkanki ze szkiełka jest wykonalne, jest znacznie bardziej czasochłonne i często pozostawia resztki tkanki. Przedstawione tutaj dane pokazują, że RNA o wystarczającej ilości i jakości można uzyskać przy użyciu tych procedur do ilościowych pomiarów PCR. Chociaż RNA i DNA są najczęściej izolowanymi cząsteczkami z tkanek i komórek pobranych za pomocą LCM, izolacja i pomiar zmian mikroRNA, białek i epigenetycznych w DNA może również skorzystać ze zwiększonej rozdzielczości anatomicznej i komórkowej uzyskanej za pomocą LCM.

Introduction

Wszystkie tkanki składają się z heterozygotycznej populacji komórek. Jest to szczególnie istotne w przypadku tkanki mózgowej, składającej się z różnych morfologicznie i/lub neurochemicznie odrębnych neuronów otoczonych różnymi typami komórek glejowych (oligodendrocytów, mikrogleju i astrocytów). Ponadto odrębne obszary mózgu, takie jak obszary kory lub jądra pnia mózgu, mają określone funkcje. W związku z tym zdolność do izolowania określonych populacji komórek lub bardzo małych anatomicznie odrębnych obszarów, w połączeniu z technikami analitycznymi (tj. Q-PCR, mikromacierzami, sekwencjonowaniem RNA i proteomiką), może znacznie poprawić zrozumienie różnych procesów biologicznych. LCM to technologia, która zapewnia możliwość izolowania bardzo dyskretnych obszarów anatomicznych lub określonych komórek z tkanki na szkiełku mikroskopowym, zapewniając znacznie bardziej jednorodne źródło do dalszej analizy różnych cząsteczek, takich jak RNA, mikroRNA, DNA i białka.

Od czasu wprowadzenia LCM, do mikrodysekcji komórek z tkanki ^1-3 zastosowano kilka różnych podejść. Najwcześniejsze podejścia obejmowały bezpośrednie przymocowanie tkanki do szkiełka za pomocą lasera w podczerwieni (IR) i folii termoplastycznej oraz metodę bezkontaktową z użyciem lasera tnącego ultrafioletowego (UV) w celu oderwania komórki lub tkanki i pobrania do probówki. Następnie LCM został z powodzeniem zastosowany w różnych tkankach i typach komórek i wykazano, że jest kompatybilny z izolacją różnych cząsteczek do dalszej analizy, w tym RNA, mikroRNA, DNA i białek, w tym aktywności enzymatycznej ^1,4-7. Tutaj LCM jest demonstrowany za pomocą systemu LCM, który wykorzystuje tnący laser UV i przechwytujący laser IR do cięcia wokół komórek lub tkanek i mocowania ich odpowiednio do nasadki LCM. Ten system LCM wykorzystuje zarówno laser wychwytujący podczerwień do stopienia folii z tworzywa sztucznego na czapce nad komórką lub tkanką będącą przedmiotem zainteresowania, która łączy komórki z folią z tworzywa sztucznego i usuwa ją z tkanki wraz z usunięciem nasadki (ryc. 1). Dodatkowo, w połączeniu z laserem IR, dostępny jest laser UV do wycinania tkanek lub komórek będących przedmiotem zainteresowania z tkanki zamontowanej na szkiełkach z membraną, a następnie izolowanej poprzez przymocowanie tkanki do czapeczki LCM za pomocą lasera IR (ryc. 2). Krótki przegląd tych technik znajduje się na rysunkach 1 i 2.

Opisano kilka wariantów tej techniki, aby izolować określone komórki za pomocą bezpośredniej immunohistochemii fluorescencyjnej oraz technikę pośrednią kierowaną immunohistochemią, która jest używana do izolacji regionu tkanki na podstawie ekspresji określonego białka. W szczególności pokazano izolację neuronów dopaminowych od istoty czarnej i izolację brzusznego obszaru nakrywki, a następnie izolację RNA ze świeżej, zamrożonej tkanki mózgowej. Ponieważ RNA jest najbardziej labilną z mierzonych cząsteczek (w porównaniu z DNA lub białkiem), uwzględniono kroki mające na celu zachowanie integralności RNA i przedstawiono dane dotyczące ilości i jakości uzyskanego RNA.

Protocol

UWAGA: Tkanka mózgowa myszy została wykorzystana zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, a protokoły badań zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Mississippi.

1. Przygotowanie preparatów i tkanek

1. Używaj szkiełek z preparatem silanowym lub szkiełek ze szkła membranowego z polietylenu i naftalanu etylenu (PEN).
2. W celu izolacji RNA zanurz szkiełka w roztworze do odkażania RNazy, przemyj 3 razy wodą wolną od RNaz, a następnie odwodnij stopniowaną serią etanolu wolnego od RNaz i wysusz próżniowo przez 30 minut.
3. Wyciąć skrawki tkanki o grubości 10 μm za pomocą kriostatu i zamontować na przygotowanych szkiełkach wolnych od RNazy. Skrawki należy przechowywać w stanie zamrożonym podczas cięcia, aby zachować jakość RNA.
   UWAGA: Upewnij się, że tkanka znajduje się w odległości około 4 mm od krawędzi szkiełka, ponieważ LCM nie może usunąć tkanki, która znajduje się zbyt blisko krawędzi szkiełka. Aby usunąć tkankę z szkiełka z membraną PEN, upewnij się, że tkanka znajduje się 4 mm od lewej, górnej i dolnej strony szkiełka oraz 7 mm od prawej strony szkiełka, które są wymiarami membrany, która nie jest przymocowana do szkiełka.
4. W celu wyizolowania poszczególnych populacji komórek za pomocą bezpośredniej immunohistochemii, należy przeciąć tkankę na szkiełka z preparatem silanowym lub szkiełka z membraną PEN. W celu izolacji obszarów tkanki przy użyciu technik immunohistochemicznych pośrednich, należy zamontować jeden zestaw sekcji na szkiełku przygotowawczym do immunohistochemii i naprzemiennie na szkiełku z membraną PEN i / lub szkiełku z preparatem silanu, które mają być stosowane do LCM.

2. Przygotowanie tkanek do laserowego wychwytywania – szybka immunohistochemia hydroksylazy tyrozyny do bezpośredniego laserowego wychwytywania komórek immunoreaktywnych

1. Obrysuj tkankę hydrofobowym pisakiem i pozostaw do wyschnięcia.
2. Utrwalić tkankę w roztworze acetonu i metanolu (1:1) w temperaturze -20 °C przez 10 min.
   UWAGA: Nasze doświadczenie wykazało, że utrwalenie acetonu i metanolu spowodowało znacznie bardziej spójną immunohistochemię niż sam aceton lub metanol.
3. Przepłukać szkiełko w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) z 1% trytonem (bez RNaz).
4. Pokryj skrawki 100-200 μl PBS z 1% Tritonem z przeciwciałem przeciwko hydroksylazie tyrozynowej rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 400 U/ml RNasin. Inkubować przez 5-10 minut.
5. Spłucz krótko dwukrotnie w PBS i PBS-1% Triton.
6. Przykryj tkankę 100-200 μl koziej anty-króliczej IgG znakowanej Alexa Fluor 488 rozcieńczonej w stosunku 1:100 w PBS-1% Triton z 400 U/ml RNasin i 50 ng/ml DAPI. Inkubować przez 5 minut.
7. Spłucz 2 razy w PBS, a następnie odwodnij 30 s w stopniowanej serii etanolu wolnego od RNaz (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
8. Inkubować w dwóch płukaniach ksylenu przez 1 minutę, a następnie 5 minut.
9. Wyjmij szkiełka z ksylenu bezpośrednio przed użyciem do LCM i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

3. Przygotowanie tkanek do wychwytywania laserowego – immunohistochemia hydroksylazy tyrozyny do pośredniego laserowego wychwytywania obszarów immunoreaktywnych

1. Przetwarzać jedno szkiełko z sekcjami przylegającymi do sekcji zamontowanych na preparatach silanowych i/lub szkiełkach membranowych PEN do immunohistochemii.
   UWAGA: Zastosowane tutaj procedury są podobne do wcześniej opisanych ⁵. W przypadku obrazów demonstracyjnych wykorzystano reakcję chromagenu diaminobenzydyny (DAB) do wizualizacji interesujących neuronów hydroksylazy tyrozyny.
2. W przypadku szkiełek używanych do LCM, utrwalić na 5 minut w 100% acetonie w temperaturze 4 °C.
3. Odwodnić tkankę w stopniowanej serii etanolu wolnego od RNaz (75%-75%-95%-95%-100%-100%) przez 1 minutę każda.
4. Inkubować w dwóch płukaniach ksylenu przez 1 minutę, a następnie 5 minut.
5. Wyjmij szkiełka z ksylenu bezpośrednio przed użyciem do LCM i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

4. Korzystanie z systemu mikrodysekcji laserowej

UWAGA: Program aplikacyjny LCM posiada 10 pasków narzędzi i 2 okna do kontrolowania procedury mikropreparacji. Paski narzędziowe: 1. Mikroskop, 2. Laser przechwytujący, 3. Laser tnący, 4. Badanie, 5. Nawigacja, 6. Materiały, 7. Grupy przechwytywania, 8. Mikrodysekcja, 9. Czcionka, 10. Adnotacja. Windows: 1. Wideo na żywo i 2. Mapa drogowa.

1. Otwórz drzwi, wybierając zakładkę "Otwórz drzwi" na pasku narzędzi Materiały w oprogramowaniu systemowym LCM.
2. Załaduj suwaki na trzy dostępne gniazda. W tej demonstracji załaduj jeden szkiełko z immunohistochemią hydroksylazy tyrozynowej uwidocznioną za pomocą DAB, jeden szkiełko z preparatem silanowym i jedno szkiełko z membraną PEN, z których każdy jest oznaczony do szybkiej fluorescencyjnej immunohistochemii hydroksylazy tyrozyny. W typowym eksperymencie należy użyć albo nieznakowanych stałych odcinków acetonu ze szkiełkiem referencyjnym oznaczonym dla hydroksylazy tyrozynowej za pomocą DAB, albo szkiełek bezpośrednio znakowanych fluorescencyjną hydroksylazą tyrozynową do wychwytu laserowego.
3. Załaduj nasadki LCM do dostępnego gniazda.
   UWAGA: Dostępne są nasadki makro i HS LCM. Rodzaj nasadki LCM, której należy użyć, zależy od liczby komórek lub ilości tkanki, która ma zostać pobrana. Slajdy makr są wyświetlane tak, aby zebrać do kilku tysięcy komórek, podczas gdy czapki HS mogą zebrać kilkaset. Preparaty makro pozwalają na pobranie większej ilości tkanek, ale wymagają 50 μl buforu do lizy. Czapeczka HS, gdy jest używana z adapterami, wymaga tylko 10 μl buforu do lizy, co pozwala na bardziej proporcjonalny odzysk RNA.
4. Zamknij drzwi.
5. Załaduj slajd, aby aktywować okno Mapa drogowa, które zapewnia widok roboczy całego slajdu, co pozwala na wybór obszaru zainteresowania (Rysunek 3). Wyświetl okno Harmonogram wyświetlania wideo na żywo, aby przejść do obszaru zainteresowania.
6. Na pasku narzędzi Materiały zidentyfikuj prowadnice membranowe PEN, zaznaczając pole wyboru nad miejscem na prowadnicę. Aby podać właściwości nasadki, kliknij prawym przyciskiem myszy na nich na pasku narzędzi Materiały i wybierz "Właściwości zaopatrzenia czapek". Zaznacz pola wskazujące położenie nasadek i wybierz Makro lub Nakładki HS.
7. Wybierz zakładkę "Fluorescencja" na pasku narzędzi mikroskopu, aby włączyć świetlówkę i pozwolić świetlówce lamp się rozgrzać. Użyj filtrów niebieskiego i UV, aby zwizualizować odpowiednio Alex Fluor 488 i DAPI. Użyj zakładki "Dostosuj kamerę", aby zwiększyć czułość obrazu, aby zobaczyć fluorescencyjnie oznaczone komórki.
8. Na pasku narzędzi Materiały kliknij prawym przyciskiem myszy czapkę i przenieś ją do interesującego Cię slajdu. Kliknij dwukrotnie lokalizację na mapie drogowej, aby wybrać region, który pojawi się w oknie Wideo na żywo. Przesuń inicjał na slajdzie, zaznaczając obszar na mapie drogowej (dwukrotne kliknięcie lewym przyciskiem myszy), a następnie klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję "Umieść zakończenie w środkowym regionie".
9. Przed użyciem lasera przechwytującego podczerwień wyceluj i dostosuj go pod kątem siły. Umieść nasadkę w obszarze szkiełka z dala od tkanki. Na pasku narzędzi Capture Laser wybierz "Włącz". Dostosuj moc (3-100 mW), impuls (100-1000000 μs) i # Trafienia lasera. Wystrzel laser na podczerwień, gdy nasadka znajdzie się nad częścią szkiełka bez tkanki i sprawdź, czy laser wystarczająco topi membranę nasadki LCM.
   UWAGA: Nazywa się to zwilżaniem, które polega na stopieniu membrany polimerowej na nasadce tak, aby stykała się ze szklanym szkiełkiem. Wystarczające zwilżenie jest widoczne jako ciemny pierścień zrośnięty ze szkiełkiem, przy czym środek pierścienia jest przezroczysty (patrz rysunek 4 dla przykładów wystarczającego i niewystarczającego stopienia). Jeśli zwilżenie nie jest wystarczające, wyreguluj moc i puls, a następnie ponownie przetestuj ogień, aż zostanie to osiągnięte. Dodatkowo można również zastosować wielokrotne zapłony lasera.
10. Po dostosowaniu intensywności lasera IR kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Laser przechwytujący jest tutaj", aby wycelować laser.
    UWAGA: Ten krok informuje komputer, gdzie laser przechwytujący podczerwień jest skierowany na tkankę. Ten etap celowania laserem ma kluczowe znaczenie i musi być powtarzany za każdym razem, gdy przesuwana jest nasadka lub zmieniany jest cel.

5. Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji poszczególnych neuronów dopaminowych z preparatów silanowych

1. Przejdź do obszaru zainteresowania, aby przechwycić cells.
   UWAGA: Przykład izolacji neuronów dopaminowych jest pokazany tutaj.
2. Aby przechwycić pojedyncze komórki ze szkiełka przygotowawczego silanu, wybierz zakładkę "LCM", a następnie ikonę "pojedynczego punktu" na pasku narzędzi Mikrodysekcja.
3. Na pasku narzędzi mikroskopu użyj zakładki "Migawka", aby przełączać się między zakładkami fluorescencji i jasnego pola z zakładkami filtrów fluorescencyjnych, aby wybrać odpowiednie filtry i użyj zakładek obiektywów, aby zmienić powiększenie. Gdy interesujące komórki staną się widoczne w oknie Wideo na żywo, dostosuj rozmiar plamki używanej do oznaczania interesujących komórek do przybliżonego rozmiaru komórek. W tym celu kliknij kartę Punktowy na pasku narzędzi Przechwyć laser, a następnie kliknij jedną stronę zaplamionej komórki, a następnie kliknij drugą stronę.
   UWAGA: Spowoduje to obliczenie średnicy plamki i wyświetlenie wartości.
4. Zaznacz interesujące Cię komórki, klikając je, gdy wybrana jest ikona "Pojedynczy punkt". Zrób to, aby umieścić znacznik punktowy w każdej komórce. W tym przypadku filtr niebieski i obiektyw 10X służą do wizualizacji neuronów dopaminowych. Ponownie przetestuj i skieruj laser IR na nasadkę, gdzie nie ma pod nią tkanki, jak opisano w krokach 4.9 i 4.10.
5. Po zaznaczeniu komórek wybierz zakładkę "Idź - wytnij i przechwyć" na pasku narzędzi Mikrodysekcja, a laser IR automatycznie wystrzeli we wszystkie zaznaczone komórki. Dodatkowo, w razie potrzeby, wystrzel laser IR ręcznie w dowolny punkt zainteresowania (Rysunek 5D).
6. Odsuń nasadkę od sekcji i na otwarty obszar szkiełka, aby sprawdzić, czy komórki zostały przechwycone na nasadce LCM. Upewnij się, że interesujące komórki zostały usunięte ze szkiełka (Rysunek 5B, E) i przymocowane do nasadki LCM (Rysunek 5C, F). Udokumentuj ten proces, klikając zakładkę "Przechwyć obraz" na pasku narzędzi mikroskopu.
7. Po zakończeniu zbierania tkanki zdejmij nasadkę, klikając ją prawym przyciskiem myszy i wybierz "Przenieś do", a następnie "Rozładuj".

6. Laserowe wychwytywanie pojedynczych neuronów dopaminowych z preparatów błonowych PEN

1. Aby uchwycić pojedyncze komórki ze szkiełek membranowych PEN za pomocą laserów IR i UV, wybierz zakładkę "Wytnij i przechwyć" na pasku narzędzi Mikrodysekcja. Wybierz zakładkę "pojedynczy punkt", aby zaznaczyć interesujące Cię komórki. Użyj zakładki "Linia cięcia", aby obrysować każdą komórkę. Pamiętaj, aby przetestować laser IR zgodnie z opisem w krokach 4.9 i 4.10 i przetestować laser UV, aby określić minimalną intensywność niezbędną do przecięcia membrany i tkanki PEN (Rysunek 4 i 5)
2. Wybierz zakładkę "Przechwyć i wytnij" na pasku narzędzi Mikrodysekcja. Zbierając pojedyncze komórki za pomocą tej techniki, należy najpierw wystrzelić laser IR, a następnie laser UV, ponieważ te małe kawałki mogą zostać utracone, jeśli zostaną wycięte przed przymocowaniem do nasadki LCM.
   UWAGA: Proces ten można również wykonać ręcznie, wystrzeliwując laser IR w interesujący punkt, a ogniwa są indywidualnie zarysowane laserem UV.
3. Po zebraniu interesujących komórek przesuń nasadkę LCM zgodnie z opisem powyżej w kroku 5.7, aby ustalić, czy komórki zostały usunięte i przymocowane do nasadki (Rysunek 6).
4. Po zakończeniu zbierania tkanki zdejmij nasadkę, klikając ją prawym przyciskiem myszy i wybierając "Przenieś do", a następnie "Rozładuj".

7. Przechwytywanie brzusznego obszaru nakrywki z preparatów silanowych

1. Aby zidentyfikować obszar zainteresowania, użyj szkiełka przetworzonego dla immunohistochemii.
   UWAGA: W tej demonstracji brzuszny obszar nakrywki jest izolowany (ryc. 7A).
2. Załaduj nasadkę LCM i przetestuj lasery jak w krokach 4.9 i 4.10.
   UWAGA: Zazwyczaj stosuje się nasadkę Macro LCM, ale można również użyć nasadki HS (patrz Rysunek 8).
3. Aby wyizolować obszar tkanki (tj. brzuszny obszar nakrywki) od szkiełka przygotowawczego silanu, wybierz zakładkę "LCM" na pasku narzędzi Mikrodysekcja, a następnie wybierz zakładkę "wielokąt zewnętrzny". Nakreśl obszar zainteresowania w oknie Wideo na żywo. W zależności od wielkości obszaru do zebrania, obrysuj obszar zainteresowania przy małym powiększeniu (obiektyw 2X). Jednak do zbierania instrument wykorzystuje obiektyw 10X, więc przed uchwyceniem wyreguluj i skieruj laser IR pod obiektyw 10X.
4. Wybierz zakładkę "Idź - przechwytywanie i wycinanie" na pasku narzędzi Mikrodysekcja.
   UWAGA: Komputer automatycznie uruchomi laser IR na całym wybranym obszarze (Rysunek 7F,I). Jeśli membrana LCM nie została wystarczająco stopiona na całym obszarze, laser można wystrzelić ręcznie lub cały proces można powtórzyć.
5. Odsuń nasadkę LCM od tkanki, aby określić, jak dobrze tkanka została zebrana.
   UWAGA: Jedno przejście przy użyciu tej metody zazwyczaj pozostawia pewną ilość tkanki na szkiełku (patrz rysunek 7G). W takim przypadku powtórz powyższy krok wyboru i przechwytywania. Powtórzenie tego kroku może zwiększyć ilość pobranej tkanki (ryc. 7J).
6. Po zakończeniu zbierania tkanki rozładuj nasadkę, klikając ją prawym przyciskiem myszy i wybierając "Przenieś do", a następnie "Rozładuj".

8. Przechwytywanie brzusznego obszaru nakrywki z szkiełek membranowych PEN

1. Użyj szkiełka przetworzonego do celów immunohistochemicznych jako przewodnika, aby wybrać interesujący Cię obszar z tkanki na szkiełku membranowym PEN, jak powyżej.
2. Wybierz zakładkę "Wytnij i uchwyć" na pasku narzędzi Mikrodysekcja. Wybierz zakładkę "Linia cięcia" i nakreśl obszar zainteresowania, korzystając ze slajdu oznaczonego immunohistochemią jako przewodnika.
   UWAGA: Program automatycznie doda miejsca dla lasera IR w celu przymocowania tkanki do nasadki. Użyj zakładki "pojedynczy punkt", aby dodać dodatkowe miejsca, aby lepiej przymocować tkankę do nasadki.
3. Pod obiektywem 10X wykonać próbę ognia i wycelować laser IR i UV zgodnie z opisem w 4.9 i 4.10. Sprawdź, czy laser UV może przeniknąć przez membranę na szkiełku i czy to cięcie odpowiada lokalizacji na ekranie komputera. Użyj lasera UV o sile wystarczającej tylko do przecięcia błony i tkanki, ale nie uszkadza tkanki (ryc. 5).
4. Wybierz zakładkę "Idź - przechwytywanie i wycinanie" na pasku narzędzi Mikrodysekcja.
   UWAGA: Komputer automatycznie wystrzeli laser IR we wszystkie oznaczone miejsca w tkance, aby przymocować go do nasadki, a następnie uruchomi laser UV, aby przeciąć membranę i tkankę szkiełka PEN (Rysunek 7C). Dodatkowe stopione miejsca w podczerwieni mogą być konieczne, aby odpowiednio przymocować tkankę do nasadki LCM, którą można również dodać ręcznie.
5. Zdejmij nasadkę LCM z tkanki, aby ustalić, czy tkanka została usunięta z sekcji (Figura 7C) i przymocowana do nasadki (Figura 7C).
6. Po zakończeniu zbierania tkanki, aby zdjąć nasadkę, kliknij nasadkę prawym przyciskiem myszy i wybierz "Przenieś do", a następnie "Rozładuj".

9. Izolacja RNA

1. Aby pobrać RNA z wychwyconych komórek lub tkanki, należy inkubować błonę czapeczki LCM w buforze do lizy RNA przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: W przypadku nakrętek HS dostępny jest adapter, który pozwala na użycie tylko 10 μl buforu do lizy na nasadce i podłącza się go do probówki mikrowirówki o pojemności 0,5 ml. Kapsułki Macro wymagają 50 μl buforu do lizy i podłącza się je bezpośrednio do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
2. Po inkubacji odwirować bufor do lizy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
3. Aby zapewnić całkowitą lizę wszystkich komórek lub tkanki, należy zdjąć membranę czapeczki LCM z czapeczki i umieścić w buforze do lizy.
4. Aby przetestować integralność RNA, użyj RNA wyizolowanego z tkanki pozostałej na szkiełku po LCM, aby zmierzyć integralność RNA.
   UWAGA: Ze względu na ograniczoną próbkę RNA uzyskaną za pomocą LCM, zazwyczaj nie jest praktyczne testowanie integralności RNA na izolowanym RNA LCM, jednak RNA z pozostałej tkanki stanowi dobry wskaźnik degradacji RNA spowodowanej utrwalaniem, immunohistochemią i czasem podczas procedury LCM.

Results

Mikrofotografia na rysunkach 6 i 7 pokazuje możliwości izolacji poszczególnych neuronów dopaminowych. Obecna rozdzielczość anatomiczna wynosi około 5-10 μm jako najmniejszy rozmiar plamki, który można konsekwentnie wytwarzać na czapeczkach LCM w celu wyizolowania komórki. Jedynym ograniczeniem w izolacji określonych typów komórek jest możliwość wizualizacji komórek. Chociaż LCM jest zdolny do izolowania pojedynczych neuronów dopaminowych, najprawdopodobniej dochodzi do zanieczyszczenia części sąsiednich nieznakowanych komórek. Dlatego końcowa próbka jest skoncentrowanym zbiorem neuronów dopaminowych, a nie czystą populacją neuronów dopaminowych. Technologia ta jest również w stanie izolować małe obszary tkanki, takie jak dyskretne jądra lub obszary w mózgu, jak pokazano w przypadku izolacji brzusznego obszaru nakrywki. Poprzednie publikacje wykazały to zastosowanie w tkance mózgowej, jak również do izolowania tkanki patologicznej od normalnej tkanki^5,11.

Ponieważ najczęstszym zastosowaniem komórek i tkanek izolowanych za pomocą LCM jest analiza RNA, przedstawione procedury zostały zoptymalizowane pod kątem zachowania integralności RNA. W celu określenia jakości RNA, które pozostało po LCM, RNA wyizolowano, za pomocą kolumn wirowych na bazie krzemionki, z tkanki na szkiełkach po LCM, albo po szybkiej procedurze immunohistochemicznej fluorescencyjnej hydroksylazy tyrozyny, albo po utrwaleniu w acetonie. Jakość RNA mierzono i porównywano z wartościami RNA z komercyjnie dostępnego RNA całego mózgu (ryc. 9). Jakość RNA była obniżona w próbkach RNA z tkanki używanej do LCM z niższą integralnością po immunohistochemii (RIN niedostępny), a następnie utrwaleniu acetonem (RIN 2,6) w porównaniu z RNA całego mózgu (RIN 8,2), co można zaobserwować przez względne zmniejszenie wysokości piku rRNA S28 w porównaniu z pikiem S18. Jednak RNA utrzymywało prążki 18S i 28S, a ekspresję genów można było zmierzyć za pomocą Q-PCR.

Aby zmierzyć ilość RNA uzyskanego z neuronów nabytych za pomocą LCM, neurony dopaminowe (50, 100 i 200 neuronów dopaminowych) zostały wyizolowane z brzusznego obszaru nakrywki z preparatu silanowego. RNA wyizolowano za pomocą kolumn wirowych na bazie krzemionki i zmierzono ilość RNA. Na podstawie wygenerowanej krzywej wzorcowej wyizolowano łącznie 17,3, 24,8 pg i 50,9 pg/μl odpowiednio z 50, 100 i 200 neuronów dopaminowych (ryc. 10A). Aby zmierzyć ilość RNA za pomocą Q-PCR, zakres stężeń RNA całego mózgu i RNA z neuronów dopaminowych został poddany odwrotnej transkrypcji, a gen β-aktyny został zmierzony za pomocą Q-PCR, jak opisano wcześniej ⁵. Na podstawie tych pomiarów obliczono stężenie 3,55, 6,82 i 20,58 pg/μl odpowiednio z 50, 100 i 200 neuronów dopaminowych (ryc. 10B).

Aby pokazać, jak izolacja neuronów dopaminowych wypada w porównaniu z izolacją całego brzusznego obszaru nakrywki za pomocą LCM, geny specyficzne dla neuronów dopaminowych (Nurr1, hydroksylaza tyrozyny i transporter dopaminy) zostały zmierzone za pomocą Q-PCR w tych dwóch różnych typach próbek i porównane z ekspresją β-aktyny (Rysunek 11). Ponieważ niższe wartości C_t są generowane przy wyższym stężeniu genu będącego przedmiotem zainteresowania, spadek ΔC_t wskazuje na zwiększoną ekspresję genów neuronów dopaminowych w stosunku do β-aktyny. Pokazuje to, w jaki sposób izolacja poszczególnych neuronów dopaminowych koncentruje ekspresję genów specyficznych dla neuronów dopaminowych. W próbkach brzusznego obszaru nakrywki geny specyficzne dla neuronów dopaminowych są rozcieńczane, ponieważ inne komórki (neurony niedopaminergiczne i komórki glejowe) również zostaną pobrane, które wyrażają β-aktynę, ale nie wyrażają genów neuronów dopaminowych.

Rysunek 1. Przechwytywanie laserowe za pomocą lasera przechwytującego w podczerwieni (IR). Mała plastikowa nasadka LCM ma na spodzie membranę, która jest umieszczona na chusteczce zamontowanej na szklanym szkiełku podstawowym (krok 1). Po zidentyfikowaniu tkanki lub komórki będącej przedmiotem zainteresowania, laser wychwytujący podczerwień jest wystrzeliwany przez nasadkę LCM, aby stopić mały wgłębień w błonie na leżącą pod spodem tkankę/komórkę (krok 2). Po zdjęciu nasadki LCM tkanka jest usuwana ze szkiełka mikroskopowego i pozostaje przymocowana do nasadki LCM.

Rysunek 2. Przechwytywanie laserowe za pomocą lasera przechwytującego w podczerwieni (IR) i lasera tnącego w ultrafiolecie (UV). W celu pozyskania większych obszarów tkanki lub ułatwienia odbudowy komórek za pomocą lasera UV, tkanka jest montowana na szkiełku z membraną połączoną ze szkiełkiem wzdłuż zewnętrznego narożnika (szkiełka membranowe PEN). Czapeczkę LCM umieszcza się na tkance, a laser wychwytujący podczerwień służy do stopienia membrany czapeczki i przymocowania tkanki do nasadki LCM (kroki 1 i 2). Laser tnący UV jest następnie używany do przecinania membrany szkiełka i tkanki (krok 3 i 4), tak aby po zdjęciu nasadki tkanka była usuwana ze szkiełka i pozostawała na nasadce LCM (krok 5).

Rysunek 3. Mapa drogowa systemu mikrodysekcji laserowej. Ten system mikrodysekcji laserowej ma miejsce na 3 szkiełka jednocześnie. Po załadowaniu preparatów do mikroskopu dla każdego slajdu generowane są obrazy mapy drogowej w małym powiększeniu. Zaznaczenie obszaru na obrazie mapy drogowej powoduje przeniesienie okna Live Image do tego regionu. W celach demonstracyjnych śródmózgowie myszy podzielono na sekcje 10 μm na 3 szkiełka. Pierwszy szkiełko oznaczono pod kątem immunoreaktywności hydroksylazy tyrozynowej przy użyciu diaminobenzydyny jako chromagenu (A). Sekcje zostały zamontowane na prowadnicach z silanem (B) lub na prowadnicach membranowych PEN (C). Oba te preparaty zostały oznaczone za pomocą szybkiej immunohistochemii fluorescencyjnej hydroksylazy tyrozyny. Strzałki w (C) wskazują mocowanie membrany PEN do szkiełka podstawowego. Żadna tkanka poza tą granicą nie może być pobrana za pomocą LCM.

Rysunek 4. Korzystanie z lasera przechwytującego podczerwień. Laser wychwytujący podczerwień służy do topienia membrany czapeczki LCM w celu przymocowania tkanki do nasadki LCM i usunięcia jej z reszty tkanki. Laser wychwytujący podczerwień musi mieć wystarczającą siłę, aby stopić membranę nasadki LCM na tyle, aby zetknąć się z leżącą pod spodem tkanką i szkiełkiem. Powyższy obraz pokazuje, kiedy laser był niewystarczający do stopienia membrany do szkiełka (lewe dwa miejsca). Gdy stopiona membrana dotknie szkiełka, można zaobserwować gruby kontur (prawy punkt). Intensywność lasera można regulować, zmieniając moc (3-100 mW), impuls (100-1 000 000 μs) i # uderzenia lasera. Dodatkowo, wielokrotne wystrzeliwanie lasera IR w to samo miejsce może również spowodować dalsze stopienie membrany. Cel lasera IR należy regulować za każdym razem, gdy nasadka LCM jest przesuwana lub gdy obiektyw jest zmieniany. Podziałka = 100 μm.

Rysunek 5. Korzystanie z lasera do cięcia UV. Laser tnący UV służy do przecinania membrany i tkanki PEN. Przed użyciem należy określić minimalną intensywność potrzebną do przecięcia błony i tkanki, ponieważ laser UV może uszkodzić tkankę. Powyżej pokazano trzy plamki (strzałki) o różnej intensywności lasera UV z rozmiarem lewej plamki wystarczającym dla sekcji 10 μm, środkową plamką dla grubszych sekcji i prawą plamką pokazującą zbyt wysoką intensywność lasera UV. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Bezpośrednia izolacja neuronów immunoreaktywnych hydroksylazy tyrozynowej za pomocą lasera IR. Neurony dopaminowe są pokazane po szybkim znakowaniu fluorescencyjnym dla hydroksylazy tyrozyny (A). Kiedy laser IR jest wystrzeliwany, topiąc błonę czapeczki LCM nad tymi neuronami (D), usunięcie czapeczki zbiera te komórki ze szkiełka (B, E). Neurony te można następnie zwizualizować jako przyczepione do czapeczki LCM (C, F). Podziałka = 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Bezpośrednia izolacja neuronów immunoreaktywnych hydroksylazy tyrozynowej ze szkiełek błonowych PEN za pomocą laserów IR i UV. Neurony znakowane hydroksylazą tyrozyny pokazano powyżej (A). Neurony te można przymocować do czapeczki LCM za pomocą lasera IR i wyciąć ze szkiełka membranowego PEN za pomocą lasera UV (B). Podziałka = 250 μm.Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Pośrednia izolacja brzusznego obszaru nakrywki za pomocą immunoreaktywności hydroksylazy tyrozyny. Lokalizację neuronów dopaminowych w brzusznej okolicy nakrywki uwidoczniono w przekroju przy użyciu standardowych technik immunohistochemicznych (A i E). Ten przekrój oznaczony immunohistochemią został użyty jako szablon do zlokalizowania brzusznego obszaru nakrywki w niebarwionych sąsiednich sekcjach (B i F). Za pomocą lasera UV brzuszny obszar nakrywki został przymocowany do nasadki LCM za pomocą lasera IR i wycięty ze szkiełka za pomocą lasera UV (C i D) i pokazany jako przymocowany do nasadki HS LCM (D). Brzuszny obszar nakrywki wyizolowany ze szkiełek przygotowawczych silanu przy użyciu tylko lasera IR jest również pokazany przymocowany do nasadki makro (F-K). Należy zauważyć, że potrzeba było więcej niż jednej próby, aby pobrać większość tkanki z tego regionu (porównaj G i J). Podziałka = 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9. Jakość RNA. Reprezentatywne elektroferogramy i związane z nimi obrazy żelowe komercyjnie dostępnego RNA całego mózgu (A) i RNA wyizolowanego z odcinków po utrwaleniu acetonu i LCM (B) lub szybkiej fluorescencyjnej immunohistochemii hydroksylazy tyrozynowej i LCM (C). Chociaż jakość RNA była obniżona w odcinkach przetworzonych do celów immunohistochemicznych, w porównaniu z RNA całego mózgu, elektroferogramy wykazują w większości nienaruszone RNA w oparciu o obecność pików rRNA S18 i S28. Stężenie RNA w całym mózgu wynosiło 6,487 pg/μl przy RIN 8,2. Stężenie RNA w tkance utrwalonej acetonem wynosiło 5,036 pg/μl przy RIN 2,6. RNA uzyskane po badaniach immunohistochemicznych miało stężenie 4,474 pg/μl, a RIN nie był dostępny.

Rysunek 10. Ilość RNA. Aby określić ilość RNA w neuronach uzyskanych za pomocą LCM, wyprodukowano standardową krzywą stężeń RNA za pomocą fluorospektrometru i Q-PCR. W przypadku pomiarów fluorospektrometrem (A) duży wykres pokazuje większy zakres ilości RNA, a mały wykres pokazuje czułość tego testu do 10 pg/μl. Stężenia RNA uzyskane z 50, 100 i 200 neuronów dopaminowych wynosiły odpowiednio 17,3, 24,8 i 50,9 pg/μl. Używając Q-PCR do pomiaru ilości RNA (B), stężenia RNA uzyskane z 50, 100 i 200 neuronów dopaminowych wynosiły odpowiednio 3,55, 6,82 i 20,58 pg/μl.

Rysunek 11. Koncentracja genów specyficznych dla neuronów dopaminowych z izolacją poszczególnych neuronów dopaminowych. Pokazano różnicę w C_t (ΔC_t) między genami specyficznymi dla neuronów dopaminowych (Nurr1, hydroksylaza tyrozynowa i transporter dopaminy) a β-aktyną w próbkach neuronów dopaminowych w brzusznym obszarze nakrywki izolowanym za pomocą LCM w porównaniu z ekspresją w rozwarstwieniu całego brzusznego obszaru nakrywki. Ponieważ niższe wartości C_t są generowane przy wyższym stężeniu genu będącego przedmiotem zainteresowania, spadek ΔC_t wskazuje na zwiększoną ekspresję genów neuronów dopaminowych w stosunku do β-aktyny, ponieważ inne komórki (neurony niedopaminergiczne i komórki glejowe) zostaną zebrane w próbkach brzusznego obszaru nakrywki, które wyrażają β-aktynę, ale nie wyrażają genów neuronów dopaminowych.

Discussion

LCM to potężna technika preparowania dyskretnych populacji komórek lub regionów tkanki z wycinków tkanek na szkiełku mikroskopowym, a następnie izolacji RNA, mikroRNA, DNA i białek. Stosowanie LCM w połączeniu z analizą przy użyciu technologii wysokoprzepustowych, takich jak mikromacierz, sekwencjonowanie RNA nowej generacji, analiza epigenetyczna DNA i proteomika, staje się coraz bardziej powszechne, ponieważ poprawia się czułość tych technik i zmniejsza się ilość potrzebnego materiału wyjściowego ^8-12. Dzięki LCM uzyskuje się lepszą rozdzielczość anatomiczną próbki, a zrozumienie tych próbek na podstawie dalszych pomiarów jest znacznie lepsze. Jednym z zastrzeżeń związanych z LCM jest to, że zapewnia on skoncentrowaną próbkę interesujących komórek, ale niekoniecznie czystą populację komórek. Granice precyzji oznaczają, że wystąpi pewne zanieczyszczenie z sąsiednich tkanek. Jednak ta technika koncentruje interesujące komórki, aby zminimalizować efekty związane z otaczającymi tkankami i komórkami oraz zmaksymalizować efekty eksperymentalne na komórkach będących przedmiotem zainteresowania.

Immunohistochemia bezpośrednia i pośrednia

Ponieważ LCM jest obecnie wykorzystywany głównie do izolacji i pomiaru RNA, utrzymanie RNA w stanie nienaruszonym jest bardzo ważnym kryterium. Utrzymanie integralności RNA jest głównym uzasadnieniem stosowania immunohistochemii pośredniej do kierowania sekcją tkanek, która eliminuje konieczność bezpośredniego barwienia tkanki, co może degradować RNA (ryc. 10). Gdy jednak pytanie eksperymentalne wymaga izolacji określonej populacji komórek, takich jak neurony dopaminowe, wymagana jest bezpośrednia immunohistochemia fluorescencyjna. Zastosowanie protokołu szybkiego znakowania immunohistochemicznego może zminimalizować degradację RNA podczas zabiegu. Krótki czas inkubacji wynika z zastosowania wysokich stężeń przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, stężeń około 10-20 razy wyższych niż te, które są konieczne dla konwencjonalnej immunohistochemii z 2-godzinną inkubacją. Jeśli jednak wymagany jest dłuższy czas inkubacji, Brown i Smith zastosowali o wysokiej zawartości soli, aby zahamować degradację RNA i uzyskać dobrej jakości RNA o długim czasie inkubacji (do 20 godzin) ¹³. Podejście to może być również stosowane, jeśli między oznakowaniem tkanki a uzyskaniem dostępu do systemu LCM wymagany jest znaczny czas.

Wybór prowadnic - szkiełka z membraną PEN, preparatem silikonowym i szkła niepowlekanego

Stosowanie szkiełek podstawowych z niepowlekanego szkła do LCM odnotowano ¹⁴ przypadków. W naszym laboratorium stwierdzono, że preparaty silanowe są optymalnym wyborem, ponieważ powłoka ta wystarczająco mocuje tkankę do szkiełka w celu przeprowadzenia immunohistochemii bez utraty tkanki, ale nadal pozwala na przymocowanie tkanki do czapek LCM i usunięcie z szkiełka. Niepowlekane szkiełka wykazały pewną utratę tkanki podczas procedury immunohistochemicznej. Jeśli jednak stosuje się immunohistochemię pośrednią, retencja tkanek staje się mniejszym problemem. Przy odpowiednim odwodnieniu wychwytywanie komórek lub tkanek ze szkiełek przygotowanych do silanu nie stanowiło problemu. Każde z różnych podejść do izolowania neuronów lub regionów mózgu opisanych w tym artykule ma zalety i wady. Do izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych zastosowanie preparatów silanowych ma tę zaletę, że ma lepszą optykę i jest tańsze niż szkiełka z membraną PEN. Wadą jest to, że czasami wychwytywanie komórek może być trudne, jeśli nie ma wystarczającego odwodnienia (patrz poniżej) i na szkiełku może pozostać trochę tkanki. Zaletą szkiełek z membranami PEN jest to, że zastosowanie połączenia lasera IR i lasera UV zapewnia zebranie neuronów dopaminowych. Niepowodzenie w pobieraniu komórek ze szkiełek membranowych PEN prawie nigdy nie występuje, ponieważ są one mniej zależne od odwodnienia niż szkiełka szklane. Dodatkową zaletą jest to, że laser UV może być używany do dokładniejszego przybliżenia kształtu interesujących neuronów, w porównaniu z okręgiem do wychwytywania neuronów ze szklanych szkiełek za pomocą lasera IR. W przypadku izolacji obszarów tkanki, szkiełka membranowe PEN są znacznie lepsze i uzasadniają dodatkowe koszty. Takie podejście powoduje całkowite usunięcie całej tkanki wyciętej na błonie, jest znacznie szybsze niż uchwycenie dużego obszaru tkanki za pomocą samego lasera IR i można pobrać grubsze skrawki tkanki. Używanie wyłącznie lasera na podczerwień wymaga, aby membrana nasadki LCM była całkowicie stopiona na całej powierzchni tkanki. Dodatkowo typowe jest niepełne pobranie tkanki, które zwykle wymaga wielu prób. Chociaż trwa to dłużej niż izolowanie tkanki od szkiełka membranowego PEN, jeśli dostępna tkanka znajduje się już na szkiełku podstawowym lub laser UV nie jest dostępny, jest to realna opcja, ponieważ większość tkanki można pobrać (ryc. 8J).

Kroki krytyczne

Inkubacja 100% etanolu jest jednym z najważniejszych kroków. W celu pobrania komórek ze szkiełek preparatycznych silanu wymagane jest całkowite odwodnienie tkanki. Dlatego każda woda, która nie zostanie usunięta, co jest związane głównie z inkubacją 100% etanolu, wpłynie na zdolność pobierania komórek ze szkiełek. Aby rozwiązać ten problem, należy często zmieniać roztwory 100% etanolu, ponieważ wchłanianie wody z powietrza lub przenoszenie z poprzednich etapów prania może wpływać na odwodnienie. Dodatkowo sita molekularne służą do pochłaniania wszelkich zanieczyszczeń wody. System LCM powinien być idealnie umieszczony w małym pomieszczeniu z osuszaczem, aby utrzymać warunki niskiej wilgotności.

Dobre sekcje kriostatu mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego LCM. Skrawki muszą być płaskie, a fałdy w tkance zminimalizowane. Fałdy w tkance zwiększą odległość między czapeczką LCM i zapobiegną jej kontaktowi z tkanką. Wtedy trudno jest wystarczająco stopić osłonę membrany na tkance. W przypadku szkiełek podstawowych zazwyczaj grubość przekroju wynosi od 6 do 12 μm. Grubsze sekcje można uchwycić za pomocą prowadnic membranowych PEN.

LCM oferuje techniczną możliwość wykonywania bardzo precyzyjnych sekcji tkanek i komórek z preparatów mikroskopowych. To znacznie zwiększa rozdzielczość dalszej analizy w porównaniu z grubym rozwarstwieniem fragmentów tkanki. Chociaż LCM może być czasochłonny i pracochłonny, nie wymaga rozległego szkolenia ani wiedzy specjalistycznej, a w połączeniu z innymi technologiami o wysokiej przepustowości może znacznie poprawić zrozumienie procesu biologicznego, gdy używane są dyskretne komórki lub regiony anatomiczne.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
System mikrodysekcji Veritas Laser Capture	Life Technologies, Grand Island, NY	Nowszy model jest już w sprzedaży
CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, Nowy	LCM0211
CapSure HS LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, Nowy Jork	LCM0213
Prowadnice membranowe PEN	Life Technologies, Grand Island, Nowy Jork	s4651
Preparaty silanowe	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% Etanol-RNazy	wolne Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% Etanol-RNazy	bez Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Bez rnazy Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
Sito molekularne	EDM Millipore, Billerica, MA	MX1583D
Przeciwciało przeciwko hydroksyazie tyrozyny	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 koza anty-królicza IgG	Life Technologies, Grand Island, Nowy Jork	A-11008
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia	G2939AA
Stratagene MX 3005P	Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia	401513
Fluorospektrometr Nanodrop 3300	Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen	Life Technologies, Grand Island, Nowy Jork	R11490
RNaseZap	Life Technologies, Grand Island, Nowy Jork	AM9780