Artykuł metodologiczny

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

25.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52336

⸱

6 lutego 2015

 ,  , 
1Department of Basic Sciences, Mississippi State University College of Veterinary Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Streszczenie

Mikrodysekcja laserowa (LCM) służy do izolowania skoncentrowanej populacji pojedynczych komórek lub precyzyjnych obszarów anatomicznych tkanki z wycinków tkanek na szkiełku mikroskopowym. W połączeniu z immunohistochemią, LCM może być stosowany do izolowania poszczególnych typów komórek na podstawie określonego markera białkowego. W tym miejscu opisano technikę LCM do zbierania określonej populacji neuronów dopaminowych bezpośrednio znakowanych immunohistochemią hydroksylazy tyrozynowej oraz do izolacji neuronu dopaminowego zawierającego region brzusznego obszaru nakrywki za pomocą pośredniej immunohistochemii hydroksylazy tyrozyny na odcinku przylegającym do tych stosowanych do LCM. Laser przechwytujący w podczerwieni (IR) jest używany zarówno do preparowania pojedynczych neuronów, jak i brzusznego obszaru nakrywki ze szklanych szkiełek i na nasadkę LCM w celu analizy. Całkowite odwodnienie tkanki za pomocą 100% etanolu i ksylenu ma kluczowe znaczenie. Połączenie lasera przechwytującego podczerwień i lasera tnącego ultrafioletowego (UV) służy do izolowania pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki podczas korzystania ze szkiełek membranowych PEN. Szkiełko z membraną PEN ma znaczące zalety w porównaniu ze szkiełkiem szklanym, ponieważ zapewnia lepszą spójność w wychwytywaniu i zbieraniu komórek, szybciej zbiera duże kawałki tkanki, jest mniej zależne od odwodnienia i powoduje całkowite usunięcie tkanki ze szkiełka. Chociaż usunięcie dużych obszarów tkanki ze szkiełka jest wykonalne, jest znacznie bardziej czasochłonne i często pozostawia resztki tkanki. Przedstawione tutaj dane pokazują, że RNA o wystarczającej ilości i jakości można uzyskać przy użyciu tych procedur do ilościowych pomiarów PCR. Chociaż RNA i DNA są najczęściej izolowanymi cząsteczkami z tkanek i komórek pobranych za pomocą LCM, izolacja i pomiar zmian mikroRNA, białek i epigenetycznych w DNA może również skorzystać ze zwiększonej rozdzielczości anatomicznej i komórkowej uzyskanej za pomocą LCM.

Wprowadzenie

Wszystkie tkanki składają się z heterozygotycznej populacji komórek. Jest to szczególnie istotne w przypadku tkanki mózgowej, składającej się z różnych morfologicznie i/lub neurochemicznie odrębnych neuronów otoczonych różnymi typami komórek glejowych (oligodendrocytów, mikrogleju i astrocytów). Ponadto odrębne obszary mózgu, takie jak obszary kory lub jądra pnia mózgu, mają określone funkcje. W związku z tym zdolność do izolowania określonych populacji komórek lub bardzo małych anatomicznie odrębnych obszarów, w połączeniu z technikami analitycznymi (tj. Q-PCR, mikromacierzami, sekwencjonowaniem RNA i proteomiką), może znacznie poprawić zrozumienie różnych procesów biologicznych. LCM to technologia, która zapewnia możliwość izolowania bardzo dyskretnych obszarów anatomicznych lub określonych komórek z tkanki na szkiełku mikroskopowym, zapewniając znacznie bardziej jednorodne źródło do dalszej analizy różnych cząsteczek, takich jak RNA, mikroRNA, DNA i białka.

Od czasu wprowadzenia LCM, do mikrodysekcji komórek z tkanki 1-3 zastosowano kilka różnych podejść. Najwcześniejsze podejścia obejmowały bezpośrednie przymocowanie tkanki do szkiełka za pomocą lasera w podczerwieni (IR) i folii termoplastycznej oraz metodę bezkontaktową z użyciem lasera tnącego ultrafioletowego (UV) w celu oderwania komórki lub tkanki i pobrania do probówki. Następnie LCM został z powodzeniem zastosowany w różnych tkankach i typach komórek i wykazano, że jest kompatybilny z izolacją różnych cząsteczek do dalszej analizy, w tym RNA, mikroRNA, DNA i białek, w tym aktywności enzymatycznej 1,4-7. Tutaj LCM jest demonstrowany za pomocą systemu LCM, który wykorzystuje tnący laser UV i przechwytujący laser IR do cięcia wokół komórek lub tkanek i mocowania ich odpowiednio do nasadki LCM. Ten system LCM wykorzystuje zarówno laser wychwytujący podczerwień do stopienia folii z tworzywa sztucznego na czapce nad komórką lub tkanką będącą przedmiotem zainteresowania, która łączy komórki z folią z tworzywa sztucznego i usuwa ją z tkanki wraz z usunięciem nasadki (ryc. 1). Dodatkowo, w połączeniu z laserem IR, dostępny jest laser UV do wycinania tkanek lub komórek będących przedmiotem zainteresowania z tkanki zamontowanej na szkiełkach z membraną, a następnie izolowanej poprzez przymocowanie tkanki do czapeczki LCM za pomocą lasera IR (ryc. 2). Krótki przegląd tych technik znajduje się na rysunkach 1 i 2.

Opisano kilka wariantów tej techniki, aby izolować określone komórki za pomocą bezpośredniej immunohistochemii fluorescencyjnej oraz technikę pośrednią kierowaną immunohistochemią, która jest używana do izolacji regionu tkanki na podstawie ekspresji określonego białka. W szczególności pokazano izolację neuronów dopaminowych od istoty czarnej i izolację brzusznego obszaru nakrywki, a następnie izolację RNA ze świeżej, zamrożonej tkanki mózgowej. Ponieważ RNA jest najbardziej labilną z mierzonych cząsteczek (w porównaniu z DNA lub białkiem), uwzględniono kroki mające na celu zachowanie integralności RNA i przedstawiono dane dotyczące ilości i jakości uzyskanego RNA.

Protokół

UWAGA: Tkanka mózgowa myszy została wykorzystana zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, a protokoły badań zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Mississippi.

1. Przygotowanie preparatów i tkanek

  1. Używaj szkiełek z preparatem silanowym lub szkiełek ze szkła membranowego z polietylenu i naftalanu etylenu (PEN).
  2. W celu izolacji RNA zanurz szkiełka w roztworze do odkażania RNazy, przemyj 3 razy wodą wolną od RNaz, a następnie odwodnij stopniowaną serią etanolu wolnego od RNaz i wysusz próżniowo przez 30 minut.
  3. Wyciąć skrawki tkanki o grubości 10 μm za pomocą kriostatu i zamontować na przygotowanych szkiełkach wolnych od RNazy. Skrawki należy przechowywać w stanie zamrożonym podczas cięcia, aby zachować jakość RNA.
    UWAGA: Upewnij się, że tkanka znajduje się w odległości około 4 mm od krawędzi szkiełka, ponieważ LCM nie może usunąć tkanki, która znajduje się zbyt blisko krawędzi szkiełka. Aby usunąć tkankę z szkiełka z membraną PEN, upewnij się, że tkanka znajduje się 4 mm od lewej, górnej i dolnej strony szkiełka oraz 7 mm od prawej strony szkiełka, które są wymiarami membrany, która nie jest przymocowana do szkiełka.
  4. W celu wyizolowania poszczególnych populacji komórek za pomocą bezpośredniej immunohistochemii, należy przeciąć tkankę na szkiełka z preparatem silanowym lub szkiełka z membraną PEN. W celu izolacji obszarów tkanki przy użyciu technik immunohistochemicznych pośrednich, należy zamontować jeden zestaw sekcji na szkiełku przygotowawczym do immunohistochemii i naprzemiennie na szkiełku z membraną PEN i / lub szkiełku z preparatem silanu, które mają być stosowane do LCM.

2. Przygotowanie tkanek do laserowego wychwytywania – szybka immunohistochemia hydroksylazy tyrozyny do bezpośredniego laserowego wychwytywania komórek immunoreaktywnych

  1. Obrysuj tkankę hydrofobowym pisakiem i pozostaw do wyschnięcia.
  2. Utrwalić tkankę w roztworze acetonu i metanolu (1:1) w temperaturze -20 °C przez 10 min.
    UWAGA: Nasze doświadczenie wykazało, że utrwalenie acetonu i metanolu spowodowało znacznie bardziej spójną immunohistochemię niż sam aceton lub metanol.
  3. Przepłukać szkiełko w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) z 1% trytonem (bez RNaz).
  4. Pokryj skrawki 100-200 μl PBS z 1% Tritonem z przeciwciałem przeciwko hydroksylazie tyrozynowej rozcieńczonym w stosunku 1:100 z 400 U/ml RNasin. Inkubować przez 5-10 minut.
  5. Spłucz krótko dwukrotnie w PBS i PBS-1% Triton.
  6. Przykryj tkankę 100-200 μl koziej anty-króliczej IgG znakowanej Alexa Fluor 488 rozcieńczonej w stosunku 1:100 w PBS-1% Triton z 400 U/ml RNasin i 50 ng/ml DAPI. Inkubować przez 5 minut.
  7. Spłucz 2 razy w PBS, a następnie odwodnij 30 s w stopniowanej serii etanolu wolnego od RNaz (75%-75%-95%-95%-100%-100%).
  8. Inkubować w dwóch płukaniach ksylenu przez 1 minutę, a następnie 5 minut.
  9. Wyjmij szkiełka z ksylenu bezpośrednio przed użyciem do LCM i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

3. Przygotowanie tkanek do wychwytywania laserowego – immunohistochemia hydroksylazy tyrozyny do pośredniego laserowego wychwytywania obszarów immunoreaktywnych

  1. Przetwarzać jedno szkiełko z sekcjami przylegającymi do sekcji zamontowanych na preparatach silanowych i/lub szkiełkach membranowych PEN do immunohistochemii.
    UWAGA: Zastosowane tutaj procedury są podobne do wcześniej opisanych 5. W przypadku obrazów demonstracyjnych wykorzystano reakcję chromagenu diaminobenzydyny (DAB) do wizualizacji interesujących neuronów hydroksylazy tyrozyny.
  2. W przypadku szkiełek używanych do LCM, utrwalić na 5 minut w 100% acetonie w temperaturze 4 °C.
  3. Odwodnić tkankę w stopniowanej serii etanolu wolnego od RNaz (75%-75%-95%-95%-100%-100%) przez 1 minutę każda.
  4. Inkubować w dwóch płukaniach ksylenu przez 1 minutę, a następnie 5 minut.
  5. Wyjmij szkiełka z ksylenu bezpośrednio przed użyciem do LCM i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

4. Korzystanie z systemu mikrodysekcji laserowej

UWAGA: Program aplikacyjny LCM posiada 10 pasków narzędzi i 2 okna do kontrolowania procedury mikropreparacji. Paski narzędziowe: 1. Mikroskop, 2. Laser przechwytujący, 3. Laser tnący, 4. Badanie, 5. Nawigacja, 6. Materiały, 7. Grupy przechwytywania, 8. Mikrodysekcja, 9. Czcionka, 10. Adnotacja. Windows: 1. Wideo na żywo i 2. Mapa drogowa.

  1. Otwórz drzwi, wybierając zakładkę "Otwórz drzwi" na pasku narzędzi Materiały w oprogramowaniu systemowym LCM.
  2. Załaduj suwaki na trzy dostępne gniazda. W tej demonstracji załaduj jeden szkiełko z immunohistochemią hydroksylazy tyrozynowej uwidocznioną za pomocą DAB, jeden szkiełko z preparatem silanowym i jedno szkiełko z membraną PEN, z których każdy jest oznaczony do szybkiej fluorescencyjnej immunohistochemii hydroksylazy tyrozyny. W typowym eksperymencie należy użyć albo nieznakowanych stałych odcinków acetonu ze szkiełkiem referencyjnym oznaczonym dla hydroksylazy tyrozynowej za pomocą DAB, albo szkiełek bezpośrednio znakowanych fluorescencyjną hydroksylazą tyrozynową do wychwytu laserowego.
  3. Załaduj nasadki LCM do dostępnego gniazda.
    UWAGA: Dostępne są nasadki makro i HS LCM. Rodzaj nasadki LCM, której należy użyć, zależy od liczby komórek lub ilości tkanki, która ma zostać pobrana. Slajdy makr są wyświetlane tak, aby zebrać do kilku tysięcy komórek, podczas gdy czapki HS mogą zebrać kilkaset. Preparaty makro pozwalają na pobranie większej ilości tkanek, ale wymagają 50 μl buforu do lizy. Czapeczka HS, gdy jest używana z adapterami, wymaga tylko 10 μl buforu do lizy, co pozwala na bardziej proporcjonalny odzysk RNA.
  4. Zamknij drzwi.
  5. Załaduj slajd, aby aktywować okno Mapa drogowa, które zapewnia widok roboczy całego slajdu, co pozwala na wybór obszaru zainteresowania (Rysunek 3). Wyświetl okno Harmonogram wyświetlania wideo na żywo, aby przejść do obszaru zainteresowania.
  6. Na pasku narzędzi Materiały zidentyfikuj prowadnice membranowe PEN, zaznaczając pole wyboru nad miejscem na prowadnicę. Aby podać właściwości nasadki, kliknij prawym przyciskiem myszy na nich na pasku narzędzi Materiały i wybierz "Właściwości zaopatrzenia czapek". Zaznacz pola wskazujące położenie nasadek i wybierz Makro lub Nakładki HS.
  7. Wybierz zakładkę "Fluorescencja" na pasku narzędzi mikroskopu, aby włączyć świetlówkę i pozwolić świetlówce lamp się rozgrzać. Użyj filtrów niebieskiego i UV, aby zwizualizować odpowiednio Alex Fluor 488 i DAPI. Użyj zakładki "Dostosuj kamerę", aby zwiększyć czułość obrazu, aby zobaczyć fluorescencyjnie oznaczone komórki.
  8. Na pasku narzędzi Materiały kliknij prawym przyciskiem myszy czapkę i przenieś ją do interesującego Cię slajdu. Kliknij dwukrotnie lokalizację na mapie drogowej, aby wybrać region, który pojawi się w oknie Wideo na żywo. Przesuń inicjał na slajdzie, zaznaczając obszar na mapie drogowej (dwukrotne kliknięcie lewym przyciskiem myszy), a następnie klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję "Umieść zakończenie w środkowym regionie".
  9. Przed użyciem lasera przechwytującego podczerwień wyceluj i dostosuj go pod kątem siły. Umieść nasadkę w obszarze szkiełka z dala od tkanki. Na pasku narzędzi Capture Laser wybierz "Włącz". Dostosuj moc (3-100 mW), impuls (100-1000000 μs) i # Trafienia lasera. Wystrzel laser na podczerwień, gdy nasadka znajdzie się nad częścią szkiełka bez tkanki i sprawdź, czy laser wystarczająco topi membranę nasadki LCM.
    UWAGA: Nazywa się to zwilżaniem, które polega na stopieniu membrany polimerowej na nasadce tak, aby stykała się ze szklanym szkiełkiem. Wystarczające zwilżenie jest widoczne jako ciemny pierścień zrośnięty ze szkiełkiem, przy czym środek pierścienia jest przezroczysty (patrz rysunek 4 dla przykładów wystarczającego i niewystarczającego stopienia). Jeśli zwilżenie nie jest wystarczające, wyreguluj moc i puls, a następnie ponownie przetestuj ogień, aż zostanie to osiągnięte. Dodatkowo można również zastosować wielokrotne zapłony lasera.
  10. Po dostosowaniu intensywności lasera IR kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Laser przechwytujący jest tutaj", aby wycelować laser.
    UWAGA: Ten krok informuje komputer, gdzie laser przechwytujący podczerwień jest skierowany na tkankę. Ten etap celowania laserem ma kluczowe znaczenie i musi być powtarzany za każdym razem, gdy przesuwana jest nasadka lub zmieniany jest cel.

5. Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji poszczególnych neuronów dopaminowych z preparatów silanowych

  1. Przejdź do obszaru zainteresowania, aby przechwycić cells.
    UWAGA: Przykład izolacji neuronów dopaminowych jest pokazany tutaj.
  2. Aby przechwycić pojedyncze komórki ze szkiełka przygotowawczego silanu, wybierz zakładkę "LCM", a następnie ikonę "pojedynczego punktu" na pasku narzędzi Mikrodysekcja.
  3. Na pasku narzędzi mikroskopu użyj zakładki "Migawka", aby przełączać się między zakładkami fluorescencji i jasnego pola z zakładkami filtrów fluorescencyjnych, aby wybrać odpowiednie filtry i użyj zakładek obiektywów, aby zmienić powiększenie. Gdy interesujące komórki staną się widoczne w oknie Wideo na żywo, dostosuj rozmiar plamki używanej do oznaczania interesujących komórek do przybliżonego rozmiaru komórek. W tym celu kliknij kartę Punktowy na pasku narzędzi Przechwyć laser, a następnie kliknij jedną stronę zaplamionej komórki, a następnie kliknij drugą stronę.
    UWAGA: Spowoduje to obliczenie średnicy plamki i wyświetlenie wartości.
  4. Zaznacz interesujące Cię komórki, klikając je, gdy wybrana jest ikona "Pojedynczy punkt". Zrób to, aby umieścić znacznik punktowy w każdej komórce. W tym przypadku filtr niebieski i obiektyw 10X służą do wizualizacji neuronów dopaminowych. Ponownie przetestuj i skieruj laser IR na nasadkę, gdzie nie ma pod nią tkanki, jak opisano w krokach 4.9 i 4.10.
  5. Po zaznaczeniu komórek wybierz zakładkę "Idź - wytnij i przechwyć" na pasku narzędzi Mikrodysekcja, a laser IR automatycznie wystrzeli we wszystkie zaznaczone komórki. Dodatkowo, w razie potrzeby, wystrzel laser IR ręcznie w dowolny punkt zainteresowania (Rysunek 5D).
  6. Odsuń nasadkę od sekcji i na otwarty obszar szkiełka, aby sprawdzić, czy komórki zostały przechwycone na nasadce LCM. Upewnij się, że interesujące komórki zostały usunięte ze szkiełka (Rysunek 5B, E) i przymocowane do nasadki LCM (Rysunek 5C, F). Udokumentuj ten proces, klikając zakładkę "Przechwyć obraz" na pasku narzędzi mikroskopu.
  7. Po zakończeniu zbierania tkanki zdejmij nasadkę, klikając ją prawym przyciskiem myszy i wybierz "Przenieś do", a następnie "Rozładuj".

6. Laserowe wychwytywanie pojedynczych neuronów dopaminowych z preparatów błonowych PEN

  1. Aby uchwycić pojedyncze komórki ze szkiełek membranowych PEN za pomocą laserów IR i UV, wybierz zakładkę "Wytnij i przechwyć" na pasku narzędzi Mikrodysekcja. Wybierz zakładkę "pojedynczy punkt", aby zaznaczyć interesujące Cię komórki. Użyj zakładki "Linia cięcia", aby obrysować każdą komórkę. Pamiętaj, aby przetestować laser IR zgodnie z opisem w krokach 4.9 i 4.10 i przetestować laser UV, aby określić minimalną intensywność niezbędną do przecięcia membrany i tkanki PEN (Rysunek 4 i 5)
  2. Wybierz zakładkę "Przechwyć i wytnij" na pasku narzędzi Mikrodysekcja. Zbierając pojedyncze komórki za pomocą tej techniki, należy najpierw wystrzelić laser IR, a następnie laser UV, ponieważ te małe kawałki mogą zostać utracone, jeśli zostaną wycięte przed przymocowaniem do nasadki LCM.
    UWAGA: Proces ten można również wykonać ręcznie, wystrzeliwując laser IR w interesujący punkt, a ogniwa są indywidualnie zarysowane laserem UV.
  3. Po zebraniu interesujących komórek przesuń nasadkę LCM zgodnie z opisem powyżej w kroku 5.7, aby ustalić, czy komórki zostały usunięte i przymocowane do nasadki (Rysunek 6).
  4. Po zakończeniu zbierania tkanki zdejmij nasadkę, klikając ją prawym przyciskiem myszy i wybierając "Przenieś do", a następnie "Rozładuj".

7. Przechwytywanie brzusznego obszaru nakrywki z preparatów silanowych

  1. Aby zidentyfikować obszar zainteresowania, użyj szkiełka przetworzonego dla immunohistochemii.
    UWAGA: W tej demonstracji brzuszny obszar nakrywki jest izolowany (ryc. 7A).
  2. Załaduj nasadkę LCM i przetestuj lasery jak w krokach 4.9 i 4.10.
    UWAGA: Zazwyczaj stosuje się nasadkę Macro LCM, ale można również użyć nasadki HS (patrz Rysunek 8).
  3. Aby wyizolować obszar tkanki (tj. brzuszny obszar nakrywki) od szkiełka przygotowawczego silanu, wybierz zakładkę "LCM" na pasku narzędzi Mikrodysekcja, a następnie wybierz zakładkę "wielokąt zewnętrzny". Nakreśl obszar zainteresowania w oknie Wideo na żywo. W zależności od wielkości obszaru do zebrania, obrysuj obszar zainteresowania przy małym powiększeniu (obiektyw 2X). Jednak do zbierania instrument wykorzystuje obiektyw 10X, więc przed uchwyceniem wyreguluj i skieruj laser IR pod obiektyw 10X.
  4. Wybierz zakładkę "Idź - przechwytywanie i wycinanie" na pasku narzędzi Mikrodysekcja.
    UWAGA: Komputer automatycznie uruchomi laser IR na całym wybranym obszarze (Rysunek 7F,I). Jeśli membrana LCM nie została wystarczająco stopiona na całym obszarze, laser można wystrzelić ręcznie lub cały proces można powtórzyć.
  5. Odsuń nasadkę LCM od tkanki, aby określić, jak dobrze tkanka została zebrana.
    UWAGA: Jedno przejście przy użyciu tej metody zazwyczaj pozostawia pewną ilość tkanki na szkiełku (patrz rysunek 7G). W takim przypadku powtórz powyższy krok wyboru i przechwytywania. Powtórzenie tego kroku może zwiększyć ilość pobranej tkanki (ryc. 7J).
  6. Po zakończeniu zbierania tkanki rozładuj nasadkę, klikając ją prawym przyciskiem myszy i wybierając "Przenieś do", a następnie "Rozładuj".

8. Przechwytywanie brzusznego obszaru nakrywki z szkiełek membranowych PEN

  1. Użyj szkiełka przetworzonego do celów immunohistochemicznych jako przewodnika, aby wybrać interesujący Cię obszar z tkanki na szkiełku membranowym PEN, jak powyżej.
  2. Wybierz zakładkę "Wytnij i uchwyć" na pasku narzędzi Mikrodysekcja. Wybierz zakładkę "Linia cięcia" i nakreśl obszar zainteresowania, korzystając ze slajdu oznaczonego immunohistochemią jako przewodnika.
    UWAGA: Program automatycznie doda miejsca dla lasera IR w celu przymocowania tkanki do nasadki. Użyj zakładki "pojedynczy punkt", aby dodać dodatkowe miejsca, aby lepiej przymocować tkankę do nasadki.
  3. Pod obiektywem 10X wykonać próbę ognia i wycelować laser IR i UV zgodnie z opisem w 4.9 i 4.10. Sprawdź, czy laser UV może przeniknąć przez membranę na szkiełku i czy to cięcie odpowiada lokalizacji na ekranie komputera. Użyj lasera UV o sile wystarczającej tylko do przecięcia błony i tkanki, ale nie uszkadza tkanki (ryc. 5).
  4. Wybierz zakładkę "Idź - przechwytywanie i wycinanie" na pasku narzędzi Mikrodysekcja.
    UWAGA: Komputer automatycznie wystrzeli laser IR we wszystkie oznaczone miejsca w tkance, aby przymocować go do nasadki, a następnie uruchomi laser UV, aby przeciąć membranę i tkankę szkiełka PEN (Rysunek 7C). Dodatkowe stopione miejsca w podczerwieni mogą być konieczne, aby odpowiednio przymocować tkankę do nasadki LCM, którą można również dodać ręcznie.
  5. Zdejmij nasadkę LCM z tkanki, aby ustalić, czy tkanka została usunięta z sekcji (Figura 7C) i przymocowana do nasadki (Figura 7C).
  6. Po zakończeniu zbierania tkanki, aby zdjąć nasadkę, kliknij nasadkę prawym przyciskiem myszy i wybierz "Przenieś do", a następnie "Rozładuj".

9. Izolacja RNA

  1. Aby pobrać RNA z wychwyconych komórek lub tkanki, należy inkubować błonę czapeczki LCM w buforze do lizy RNA przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: W przypadku nakrętek HS dostępny jest adapter, który pozwala na użycie tylko 10 μl buforu do lizy na nasadce i podłącza się go do probówki mikrowirówki o pojemności 0,5 ml. Kapsułki Macro wymagają 50 μl buforu do lizy i podłącza się je bezpośrednio do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
  2. Po inkubacji odwirować bufor do lizy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml.
  3. Aby zapewnić całkowitą lizę wszystkich komórek lub tkanki, należy zdjąć membranę czapeczki LCM z czapeczki i umieścić w buforze do lizy.
  4. Aby przetestować integralność RNA, użyj RNA wyizolowanego z tkanki pozostałej na szkiełku po LCM, aby zmierzyć integralność RNA.
    UWAGA: Ze względu na ograniczoną próbkę RNA uzyskaną za pomocą LCM, zazwyczaj nie jest praktyczne testowanie integralności RNA na izolowanym RNA LCM, jednak RNA z pozostałej tkanki stanowi dobry wskaźnik degradacji RNA spowodowanej utrwalaniem, immunohistochemią i czasem podczas procedury LCM.

Wyniki

Mikrografie na Rysunkach 6 i 7 demonstrują możliwości izolacji pojedynczych neuronów dopaminergicznych. Obecna rozdzielczość anatomiczna wynosi około 5-10 µm, co stanowi najmniejszy rozmiar punktu, który można konsekwentnie uzyskać na nakładkach LCM w celu izolacji komórki. Jedynym ograniczeniem w izolacji specyficznych typów komórek jest możliwość ich wizualizacji. Chociaż LCM umożliwia izolację pojedynczych neuronów dopaminergicznych, najprawdopodobniej dochodzi do zanieczyszczenia fragmentami sąsiednich nieoznakowanych komórek. W związku z tym końcowa próbka stanowi skoncentrowany zbiór neuronów dopaminergicznych, a nie czystą populację tych neuronów. Technologia ta pozwala również na izolację niewielkich obszarów tkanki, takich jak poszczególne jądra lub regiony mózgu, co pokazano na przykładzie izolacji pola brzusznego nakrycia. Wcześniejsze publikacje wykazały zastosowanie tej metody w tkance mózgowej, a także do izolacji tkanki patologicznej od tkanki prawidłowej5,11.

Ponieważ najczęstszym zastosowaniem komórek i tkanek izolowanych za pomocą LCM jest analiza RNA, zaprezentowane procedury zoptymalizowano w celu zachowania integralności RNA. Aby określić jakość RNA pozostałego po LCM, RNA wyizolowano za pomocą kolumn spinowych opartych na krzemionce z tkanek na szkiełkach po LCM, zarówno po szybkiej procedurze fluorescencyjnej immunohistochemii tyrozynohydroksylazy, jak i po utrwaleniu w acetonie. Jakość RNA zmierzono i porównano z wartościami dla RNA z komercyjnie dostępnego RNA całego mózgu (Ryc. 9). Jakość RNA była niższa w próbkach RNA z tkanek użytych do LCM z mniejszą integralnością po immunohistochemii (RIN niedostępny), a następnie po utrwaleniu w acetonie (RIN 2,6) w porównaniu do RNA całego mózgu (RIN 8,2), co można zauważyć po względnym zmniejszeniu wysokości piku rRNA S28 w stosunku do piku S18. Niemniej jednak, RNA zachowało prążki 18S i 28S, a ekspresję genów można było zmierzyć za pomocą Q-PCR.

Aby zmierzyć ilość RNA uzyskanego z neuronów pobranych metodą LCM, neurony dopaminergiczne (50, 100 i 200 neuronów dopaminergicznych) wyizolowano z obszaru brzusznej części pola nakrywki ze szkiełek Silane-prep. RNA wyizolowano przy użyciu kolumn wiriówek opartych na krzemionce, a następnie zmierzono jego ilość. Na podstawie wygenerowanej krzywej wzorcowej, z 50, 100 i 200 neuronów dopaminergicznych wyizolowano odpowiednio łącznie 17,3, 24,8 pg i 50,9 pg/µl (Rysunek 10A). Aby zmierzyć ilość RNA metodą Q-PCR, przeprowadziono odwrotną transkrypcję dla różnych stężeń RNA z całego mózgu oraz RNA z neuronów dopaminergicznych, a następnie zmierzono gen β-actin za pomocą Q-PCR zgodnie z wcześniejszym opisem 5. Na podstawie tych pomiarów obliczono, że stężenia z 50, 100 i 200 neuronów dopaminergicznych wynosiły odpowiednio 3,55, 6,82 i 20,58 pg/µl (Rysunek 10B).

Aby zademonstrować, jak izolacja neuronów dopaminergicznych wypada w porównaniu z izolacją całego pola brzusznego nakrywki (VTA) za pomocą LCM, poziom ekspresji genów specyficznych dla neuronów dopaminergicznych (Nurr1, hydroksylaza tyrozynowa i transporter dopaminy) zmierzono za pomocą Q-PCR w tych dwóch różnych typach próbek i porównano z ekspresją β-actin (Rycina 11). Ponieważ niższe wartości Ct są uzyskiwane przy wyższym stężeniu badanego genu, spadek wartości ΔCt wskazuje na zwiększoną ekspresję genów neuronów dopaminergicznych w stosunku do β-actin. Wykazuje to, w jaki sposób izolacja pojedynczych neuronów dopaminergicznych koncentruje ekspresję genów specyficznych dla tych neuronów. W próbkach z pola brzusznego nakrywki geny specyficzne dla neuronów dopaminergicznych ulegają rozcieńczeniu, ponieważ zbierane są również inne komórki (neurony niedopaminergiczne i komórki glejowe), które wykazują ekspresję β-actin, ale nie wykazują ekspresji genów neuronów dopaminergicznych.

Schemat laserowej mikrodysekcji; izolacja tkanki przy użyciu lasera IR na szkiełku przedmiotowym.
Rycina 1. Wychwytywanie laserowe przy użyciu podczerwonego (IR) lasera przechwytującego. Mała plastikowa nakładka LCM posiada membranę na spodzie, która jest umieszczana na tkance zamocowanej na szkiełku przedmiotowym (krok 1). Po zidentyfikowaniu interesującej tkanki lub komórki, laser IR jest emitowany przez nakładkę LCM, aby stopić niewielkie wgłębienie w membranie na znajdującej się poniżej tkance/komórce (krok 2). Po zdjęciu nakładki LCM tkanka zostaje oddzielona od szkiełka mikroskopowego i pozostaje przytwierdzona do nakładki LCM.

Schemat mikrodysekcji laserowej; lasery IR i UV wycinają próbki komórek na membranie szkiełka.
Rycina 2. Wychwytywanie laserowe z użyciem podczerwonego (IR) lasera przechwytującego i ultrafioletowego (UV) lasera tnącego. W celu pobrania większych obszarów tkanki lub ułatwienia odzyskiwania komórek za pomocą lasera UV, tkankę montuje się na szkiełku z membraną połączoną ze szkiełkiem wzdłuż zewnętrznego narożnika (szkiełka z membraną PEN). Na tkankę nakłada się nasadkę LCM, a za pomocą podczerwonego lasera przechwytującego przetapia się membranę nasadki, aby przytwierdzić tkankę do nasadki LCM (Krok 1 i 2). Następnie za pomocą ultrafioletowego lasera tnącego przecina się membranę szkiełka oraz tkankę (Krok 3 i 4), tak aby po zdjęciu nasadki tkanka została oddzielona od szkiełka i pozostała na nasadce LCM (Krok 5).

Obrazy seryjnych przekrojów mózgu; analiza histologiczna do badania porównawczego; wynik eksperymentalny.
Rycina 3. System mikrodissekcji laserowej (LCM).Mapa (Road Map). Niniejszy system mikrodissekcji laserowej pomieści jednocześnie 3 preparaty. Po umieszczeniu preparatów w mikroskopie generowane są obrazy mapy (Road Map) przy niskim powiększeniu dla każdego z nich. Wybranie obszaru na obrazie mapy przesuwa okno obrazu na żywo (Live Image) do tego regionu. W celach demonstracyjnych mesencefalon myszy został pocięty na przekroje o grubości 10 µm na 3 preparaty. Pierwszy preparat został przebarwiony pod kątem immunoreaktywności tyrozynowej hydroksylazy z użyciem diaminobenzydyny jako chromogenu (A). Przekroje zamontowano albo na szkiełkach Silane-prep (B), albo na szkiełkach z błoną PEN (C). Oba te preparaty zostały przebarwione przy użyciu szybkiej fluorescencyjnej immunohistochemii tyrozynowej hydroksylazy. Strzałki w (C) wskazują miejsce przytwierdzenia błony PEN do szkiełka szklanego. Tkanka znajdująca się poza tą granicą nie może zostać pobrana za pomocą LCM.

Migracja kropli w różnych warunkach pokazana na obrazie z mikroskopii kontrastowej dla badania materiału.
Rycina 4. Użycie lasera IR do przechwytywania. Laser IR do przechwytywania jest wykorzystywany do stopienia membrany nakładki LCM w celu przytwierdzenia tkanki do nakładki LCM i oddzielenia jej od pozostałej części tkanki. Moc lasera IR do przechwytywania musi być wystarczająca, aby stopić membranę nakładki LCM w stopniu umożliwiającym kontakt z leżącą poniżej tkanką i szkiełkiem przedmiotowym. Powyższy obraz pokazuje sytuację, w której moc lasera była niewystarczająca do stopienia membrany do szkiełka (dwie plamki po lewej). Gdy stopiona membrana dotyka szkiełka przedmiotowego, można zaobserwować gruby czarny kontur (plamka po prawej). Intensywność lasera można regulować, zmieniając moc (Power: 3-100 mW), czas impulsu (Pulse: 100-1,000,000 µsec) oraz liczbę uderzeń (# Hits) lasera. Dodatkowo wielokrotne wystrzeliwanie lasera IR w to samo miejsce może dodatkowo stopić membranę. Celowanie lasera IR należy skorygować za każdym razem, gdy nakładka LCM zostanie przesunięta lub gdy zmieniany jest obiektyw. Pasek skali = 100 µm.

Obraz mikroskopowy; cysty i trofozoity Giardia; mikroskopia; diagnostyczne badanie parazytologiczne.
Rycina 5. Wykorzystanie laserowego noża UV. Laserowy nóż UV jest używany do wycinania przez membranę PEN i tkankę. Przed użyciem należy określić minimalną intensywność niezbędną do przecięcia membrany i tkanki, ponieważ laser UV może uszkodzić tkankę. Powyżej przedstawiono trzy punkty (strzałki) o różnych intensywnościach lasera UV, gdzie rozmiar lewego punktu jest wystarczający dla sekcji 10 µm, środkowy punkt dla grubszych sekcji, a prawy punkt obrazuje zbyt wysoką intensywność lasera UV. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia konfokalna i w jasnym polu wzrostu grzybów i sporulacji w kulturze eksperymentalnej.
Rycina 6. Bezpośrednia izolacja neuronów immunoreaktywnych na tyrozynohydroksylazę przy użyciu lasera IR. Przedstawiono neurony dopaminergiczne po szybkim znakowaniu fluorescencyjnym na tyrozynohydroksylazę (A). W momencie wystrzału lasera IR, który topi membranę nakładki LCM nad tymi neuronami (D), usunięcie nakładki powoduje odebranie tych komórek z preparasu (B, E). Następnie można zwizualizować te neurony przyczepione do nakładki LCM (C, F). Pasek skali = 250 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie mikroskopowe fluorescencyjne, schemat, pokazujący znakowane struktury ze strzałkami wskazującymi poszczególne regiony.
Rycina 7. Bezpośrednia izolacja neuronów immunoreaktywnych na tyrozynohydroksylazę z szkiełek z membraną PEN przy użyciu laserów IR i UV. Powyżej przedstawiono neurony znakowane na tyrozynohydroksylazę (A). Neurony te mogą zostać przytwierdzone do nakładki LCM za pomocą lasera IR i wycięte z szkiełka z membraną PEN za pomocą lasera UV (B). Pasek skali = 250 µm.Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza seryjnych przekrojów mózgu, mozaika obrazów mikroskopowych, podkreślająca architekturę tkanek i wzorce barwienia.
Rycina 8. Pośrednia izolacja pola brzusznego nakrywy za pomocą immunoreaktywności tyrozynowej hydroksylazy. Lokalizacja neuronów dopaminergicznych w polu brzusznym nakrywy została zwizualizowana w przekroju przy użyciu standardowych technik immunohistochemicznych (A i E). Ten obrazowany immunohistochemicznie przekrój posłużył jako wzorzec do zlokalizowania pola brzusznego nakrywy w sąsiednich, niebarwionych przekrojach (B i F). Przy użyciu lasera UV, pole brzuszne nakrywy zostało przytwierdzone do nakładki LCM za pomocą lasera IR i wycięte ze szkiełka laserem UV (C i D); pokazano je przytwierdzone do nakładki HS LCM (D). Przedstawiono również region pola brzusznego izolowany ze szkiełek Silane-prep przy użyciu wyłącznie lasera IR, przytwierdzony do nakładki Macro (F-K). Należy zauważyć, że w celu zebrania większości tkanki z tego regionu konieczne było przeprowadzenie więcej niż jednej próby (porównać G i J). Pasek skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy analizy integralności RNA z markerami 18S, 28S; wyniki elektroforezy, cały mózg, sekcje.
Rysunek 9. Jakość RNA. Reprezentatywne elektroferogramy i powiązane obrazy żeli dla komercyjnie dostępnego RNA z całego mózgu (A) oraz RNA wyizolowanego z sekcji po fiksacji acetonem i LCM (B) lub szybkiej immunohistochemii tyrozynowej hydroksylazy z fluorescencją i LCM (C). Chociaż jakość RNA była obniżona w sekcjach poddanych immunohistochemii w porównaniu do RNA z całego mózgu, elektroferogramy wykazują w przeważającej mierze nienaruszone RNA na podstawie obecności pików rRNA S18 i S28. Stężenie RNA z całego mózgu wynosiło 6,487 pg/µl przy RIN wynoszącym 8,2. Stężenie RNA z tkanki utrwalonej acetonem wynosiło 5,036 pg/µl przy RIN wynoszącym 2,6. RNA otrzymane po immunohistochemii miało stężenie 4,474 pg/µl, a wartość RIN była niedostępna.

Wykres ilości RNA pokazujący fluorescencję neuronów dopaminergicznych i wartości Ct; wyniki analizy danych.
Rycina 10. Ilość RNA. Aby określić ilość RNA w neuronach uzyskanych metodą LCM, stworzono krzywą standardową stężeń RNA przy użyciu fluorospektrometru i Q-PCR. Dla pomiarów fluorospektrometrycznych (A), większy wykres przedstawia wyższy zakres ilości RNA, a mniejszy wykres pokazuje czułość tego testu aż do 10 pg/µl. Stężenia RNA uzyskane z 50, 100 i 200 neuronów dopaminergicznych wynosiły odpowiednio 17,3, 24,8 i 50,9 pg/µl. W przypadku pomiaru ilości RNA metodą Q-PCR (B), stężenia RNA uzyskane z 50, 100 i 200 neuronów dopaminergicznych wynosiły odpowiednio 3,55, 6,82 i 20,58 pg/µl.

Wykres słupkowy ekspresji mRNA; ΔCt dla Nurr1, hydroksylazy tyrozynowej i transportera dopaminy; badanie neuronów.
Rycina 11. Stężenie genów swoistych dla neuronów dopaminergicznych po izolacji pojedynczych neuronów dopaminergicznych. Przedstawiono różnicę w Ct (ΔCt) pomiędzy genami swoistymi dla neuronów dopaminergicznych (Nurr1, hydroksylazą tyrozynową i transporterem dopaminy) a β-aktyną w próbkach neuronów dopaminergicznych z pola brzusznego nakrywki wyizolowanych za pomocą LCM w porównaniu do ekspresji w preparatach całego obszaru pola brzusznego nakrywki. Ponieważ niższe wartości Ct są uzyskiwane przy wyższym stężeniu badanego genu, spadek ΔCt wskazuje na zwiększoną ekspresję genów neuronów dopaminergicznych w stosunku do β-aktyny, ponieważ w próbkach z pola brzusznego nakrywki zostaną zebrane inne komórki (neurony niedopaminergiczne i komórki glejowe), które wykazują ekspresję β-aktyny, ale nie wykazują ekspresji genów neuronów dopaminergicznych.

Dyskusja

LCM to potężna technika preparowania dyskretnych populacji komórek lub regionów tkanki z wycinków tkanek na szkiełku mikroskopowym, a następnie izolacji RNA, mikroRNA, DNA i białek. Stosowanie LCM w połączeniu z analizą przy użyciu technologii wysokoprzepustowych, takich jak mikromacierz, sekwencjonowanie RNA nowej generacji, analiza epigenetyczna DNA i proteomika, staje się coraz bardziej powszechne, ponieważ poprawia się czułość tych technik i zmniejsza się ilość potrzebnego materiału wyjściowego 8-12. Dzięki LCM uzyskuje się lepszą rozdzielczość anatomiczną próbki, a zrozumienie tych próbek na podstawie dalszych pomiarów jest znacznie lepsze. Jednym z zastrzeżeń związanych z LCM jest to, że zapewnia on skoncentrowaną próbkę interesujących komórek, ale niekoniecznie czystą populację komórek. Granice precyzji oznaczają, że wystąpi pewne zanieczyszczenie z sąsiednich tkanek. Jednak ta technika koncentruje interesujące komórki, aby zminimalizować efekty związane z otaczającymi tkankami i komórkami oraz zmaksymalizować efekty eksperymentalne na komórkach będących przedmiotem zainteresowania.

Immunohistochemia bezpośrednia i pośrednia

Ponieważ LCM jest obecnie wykorzystywany głównie do izolacji i pomiaru RNA, utrzymanie RNA w stanie nienaruszonym jest bardzo ważnym kryterium. Utrzymanie integralności RNA jest głównym uzasadnieniem stosowania immunohistochemii pośredniej do kierowania sekcją tkanek, która eliminuje konieczność bezpośredniego barwienia tkanki, co może degradować RNA (ryc. 10). Gdy jednak pytanie eksperymentalne wymaga izolacji określonej populacji komórek, takich jak neurony dopaminowe, wymagana jest bezpośrednia immunohistochemia fluorescencyjna. Zastosowanie protokołu szybkiego znakowania immunohistochemicznego może zminimalizować degradację RNA podczas zabiegu. Krótki czas inkubacji wynika z zastosowania wysokich stężeń przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, stężeń około 10-20 razy wyższych niż te, które są konieczne dla konwencjonalnej immunohistochemii z 2-godzinną inkubacją. Jeśli jednak wymagany jest dłuższy czas inkubacji, Brown i Smith zastosowali o wysokiej zawartości soli, aby zahamować degradację RNA i uzyskać dobrej jakości RNA o długim czasie inkubacji (do 20 godzin) 13. Podejście to może być również stosowane, jeśli między oznakowaniem tkanki a uzyskaniem dostępu do systemu LCM wymagany jest znaczny czas.

Wybór prowadnic - szkiełka z membraną PEN, preparatem silikonowym i szkła niepowlekanego

Stosowanie szkiełek podstawowych z niepowlekanego szkła do LCM odnotowano 14 przypadków. W naszym laboratorium stwierdzono, że preparaty silanowe są optymalnym wyborem, ponieważ powłoka ta wystarczająco mocuje tkankę do szkiełka w celu przeprowadzenia immunohistochemii bez utraty tkanki, ale nadal pozwala na przymocowanie tkanki do czapek LCM i usunięcie z szkiełka. Niepowlekane szkiełka wykazały pewną utratę tkanki podczas procedury immunohistochemicznej. Jeśli jednak stosuje się immunohistochemię pośrednią, retencja tkanek staje się mniejszym problemem. Przy odpowiednim odwodnieniu wychwytywanie komórek lub tkanek ze szkiełek przygotowanych do silanu nie stanowiło problemu. Każde z różnych podejść do izolowania neuronów lub regionów mózgu opisanych w tym artykule ma zalety i wady. Do izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych zastosowanie preparatów silanowych ma tę zaletę, że ma lepszą optykę i jest tańsze niż szkiełka z membraną PEN. Wadą jest to, że czasami wychwytywanie komórek może być trudne, jeśli nie ma wystarczającego odwodnienia (patrz poniżej) i na szkiełku może pozostać trochę tkanki. Zaletą szkiełek z membranami PEN jest to, że zastosowanie połączenia lasera IR i lasera UV zapewnia zebranie neuronów dopaminowych. Niepowodzenie w pobieraniu komórek ze szkiełek membranowych PEN prawie nigdy nie występuje, ponieważ są one mniej zależne od odwodnienia niż szkiełka szklane. Dodatkową zaletą jest to, że laser UV może być używany do dokładniejszego przybliżenia kształtu interesujących neuronów, w porównaniu z okręgiem do wychwytywania neuronów ze szklanych szkiełek za pomocą lasera IR. W przypadku izolacji obszarów tkanki, szkiełka membranowe PEN są znacznie lepsze i uzasadniają dodatkowe koszty. Takie podejście powoduje całkowite usunięcie całej tkanki wyciętej na błonie, jest znacznie szybsze niż uchwycenie dużego obszaru tkanki za pomocą samego lasera IR i można pobrać grubsze skrawki tkanki. Używanie wyłącznie lasera na podczerwień wymaga, aby membrana nasadki LCM była całkowicie stopiona na całej powierzchni tkanki. Dodatkowo typowe jest niepełne pobranie tkanki, które zwykle wymaga wielu prób. Chociaż trwa to dłużej niż izolowanie tkanki od szkiełka membranowego PEN, jeśli dostępna tkanka znajduje się już na szkiełku podstawowym lub laser UV nie jest dostępny, jest to realna opcja, ponieważ większość tkanki można pobrać (ryc. 8J).

Kroki krytyczne

Inkubacja 100% etanolu jest jednym z najważniejszych kroków. W celu pobrania komórek ze szkiełek preparatycznych silanu wymagane jest całkowite odwodnienie tkanki. Dlatego każda woda, która nie zostanie usunięta, co jest związane głównie z inkubacją 100% etanolu, wpłynie na zdolność pobierania komórek ze szkiełek. Aby rozwiązać ten problem, należy często zmieniać roztwory 100% etanolu, ponieważ wchłanianie wody z powietrza lub przenoszenie z poprzednich etapów prania może wpływać na odwodnienie. Dodatkowo sita molekularne służą do pochłaniania wszelkich zanieczyszczeń wody. System LCM powinien być idealnie umieszczony w małym pomieszczeniu z osuszaczem, aby utrzymać warunki niskiej wilgotności.

Dobre sekcje kriostatu mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego LCM. Skrawki muszą być płaskie, a fałdy w tkance zminimalizowane. Fałdy w tkance zwiększą odległość między czapeczką LCM i zapobiegną jej kontaktowi z tkanką. Wtedy trudno jest wystarczająco stopić osłonę membrany na tkance. W przypadku szkiełek podstawowych zazwyczaj grubość przekroju wynosi od 6 do 12 μm. Grubsze sekcje można uchwycić za pomocą prowadnic membranowych PEN.

LCM oferuje techniczną możliwość wykonywania bardzo precyzyjnych sekcji tkanek i komórek z preparatów mikroskopowych. To znacznie zwiększa rozdzielczość dalszej analizy w porównaniu z grubym rozwarstwieniem fragmentów tkanki. Chociaż LCM może być czasochłonny i pracochłonny, nie wymaga rozległego szkolenia ani wiedzy specjalistycznej, a w połączeniu z innymi technologiami o wysokiej przepustowości może znacznie poprawić zrozumienie procesu biologicznego, gdy używane są dyskretne komórki lub regiony anatomiczne.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez National Institute of Mental Health (1R15MH084209 - 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) oraz National Science Foundation (DBI0723080 07070646).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System mikrodysekcji Veritas Laser CaptureLife Technologies, Grand Island, NYNowszy model jest już w sprzedaży
CapSure Macro LCM CapsLife Technologies, Grand Island, NowyLCM0211
CapSure HS LCM CapsLife Technologies, Grand Island, Nowy JorkLCM0213
Prowadnice membranowe PENLife Technologies, Grand Island, Nowy Jorks4651
Preparaty silanoweSigma-Aldrich, St. Louis, MOS4651
95% Etanol-RNazywolne Sigma-Aldrich, St. Louis, MOE7148
100% Etanol-RNazybez Sigma-Aldrich, St. Louis, MOE7023
Bez rnazy TritonSigma-Aldrich, St. Louis, MOT8787
Sito molekularneEDM Millipore, Billerica, MAMX1583D
Przeciwciało przeciwko hydroksyazie tyrozynyEDM Millipore, Billerica, MAAb152
Alexa Fluor 488 koza anty-królicza IgGLife Technologies, Grand Island, Nowy JorkA-11008
2100 BioanalyzerAgilent Technologies, Santa Clara, KaliforniaG2939AA
Stratagene MX 3005PAgilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia401513
Fluorospektrometr Nanodrop 3300Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreenLife Technologies, Grand Island, Nowy JorkR11490
RNaseZapLife Technologies, Grand Island, Nowy JorkAM9780
Jork

Bibliografia

  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  2. Schutze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nature biotechnology. 16, 737-742 (1998).
  3. Schutze, K., Posl, H., Lahr, G. Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine. Cellular and Molecular Biology. 44, 735-746 (1998).
  4. Vandewoestyne, M., Van Nieuwerburgh, F., Van Hoofstat, D., Deforce, D. Evaluation of three DNA extraction protocols for forensic STR typing after laser capture microdissection. Forensic Science International Genetics. 6, 258-262 (2012).
  5. Eells, J. B., Wilcots, J., Sisk, S., Guo-Ross, S. X. NR4A gene expression is dynamically regulated in the ventral tegmental area dopamine neurons and is related to expression of dopamine neurotransmission genes. Journal of Molecular Neuroscience. 46, 545-553 (2012).
  6. Seelan, R. S., et al. Epigenetic analysis of laser capture microdissected fetal epithelia. Analytical Biochemistry. 442, 68-74 (2013).
  7. Kim, W., et al. miR-126 contributes to Parkinson's disease by dysregulating the insulin-like growth factor/phosphoinositide 3-kinase signaling. Neurobiology of Aging. 35, 1712-1721 (2014).
  8. Bohm, C., et al. Effects of antidepressant treatment on gene expression profile in mouse brain: cell type-specific transcription profiling using laser microdissection and microarray analysis. Journal of Neurochemistry. 97, Suppl 1. 44-49 (2006).
  9. Kadkhodaei, B., et al. Transcription factor Nurr1 maintains fiber integrity and nuclear-encoded mitochondrial gene expression in dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2360-2365 (2013).
  10. Miller, R. A., et al. Quantitative Proteomics in Laser Capture Microdissected Sleep Nuclei From Rat Brain. Journal of Neurogenetics. , (2014).
  11. Roberts, E., et al. Application of laser capture microdissection and protein microarray technologies in the molecular analysis of airway injury following pollution particle exposure. Journal of Toxicology and Environmental Health. A. 67, 851-861 (2004).
  12. Yuferov, V., Nielsen, D., Butelman, E., Kreek, M. J. Microarray studies of psychostimulant-induced changes in gene expression. Addiction Biology. 10, 101-118 (2005).
  13. Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15, 2364-2374 (2009).
  14. Curran, S., McKay, J. A., McLeod, H. L., Murray, G. I. Laser capture microscopy. Molecular Pathology. 53, 64-68 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja neuronów dopaminergicznychimmunohistochemia tyrozynowej hydroksylazyizolacja RNAszkiełka z membraną PENpodczerwony laser do mikrodysekcjiultrafioletowy laser tnącyilościowa PCRodwadnianie tkanek
Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.