Tutaj opisujemy techniki histologiczne wizualizacji tkanki oka bezpośrednio przylegającej do metalowej protezy nasiatkówkowej i siatkówki.
Artykuł metodologiczny
Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej: Część 2 Implanty nasiatkówkowe z pinezkami siatkówkowymi
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Protezy siatkówki do leczenia niektórych form ślepoty zyskują na popularności w badaniach klinicznych na całym świecie, a obecnie na rynku pojawiają się komercyjne urządzenia. Aby ocenić bezpieczeństwo tych urządzeń, w badaniach przedklinicznych potrzebne są wiarygodne techniki. Jednak elementy z twardego metalu stosowane w niektórych implantach siatkówki nie są kompatybilne z tradycyjnymi procesami histologicznymi, szczególnie biorąc pod uwagę delikatną naturę otaczającej tkanki. W tym miejscu opisujemy techniki oceny stanu zdrowia oka bezpośrednio przylegającego do implantu siatkówki zabezpieczonego nasiatkówkowo metalowym pinezką.
Protezy siatkówki mają układy elektrod stykających się z tkanką oka. Najczęściej stosowanym miejscem do implantacji jest lokalizacja nasiatkówkowa (tylna komora oka), gdzie implant jest przymocowany do siatkówki za pomocą metalowego haczyka, który przenika przez wszystkie warstwy oka. Poprzednie metody nie były w stanie ocenić proksymalnej tkanki oka za pomocą halsu in situ, ze względu na niezdolność tradycyjnych technik histologicznych do cięcia metalowych przedmiotów. W związku z tym trudno było ocenić miejscowe uszkodzenia, jeśli występują, spowodowane wprowadzeniem halsu.
Dlatego opracowaliśmy technikę wizualizacji tkanki wokół siatkówki i implantu. Zmodyfikowaliśmy uznaną technikę, używaną do przetwarzania i wizualizacji twardej tkanki kostnej wokół implantu ślimakowego, dla miękkich, delikatnych tkanek oka. Utrwaloną tkankę oka, w tym implant i przyczepność siatkówki, utrwaliliśmy i osadziliśmy w żywicy epoksydowej, aby ustabilizować i chronić strukturę próbki. Osadzone próbki były następnie mielone, polerowane, barwione i obrazowane pod różnymi powiększeniami na przyrostowych głębokościach przez próbkę. Technika ta pozwoliła na wiarygodną ocenę integralności tkanki oka i cytoarchitektury przylegającej do metalowej przyczepności.
Wprowadzenie
Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) jest dziedzicznym zaburzeniem, które powoduje powszechną utratę fotoreceptorów, które są komórkami w najbardziej zewnętrznej warstwie siatkówki odpowiedzialnymi za przekształcanie światła, w postaci fotonów, w aktywność neuronalną. Co ważne, pacjenci z RP zazwyczaj mają szczątkowe neurony w innych warstwach siatkówki, które nadal działają. Protezy siatkówki są w stanie przywrócić tym pacjentom pewne ograniczone widzenie poprzez skierowanie do tych neuronów, które przeżyły, stymulacji elektrycznej, aby aktywować ich ścieżkę wzrokową1,2. Percepcyjne wyniki badań klinicznych wykazały obiecujące wczesne wyniki, a ostatnio niektóre urządzenia zostały zatwierdzone do użytku komercyjnego. Obecnie istnieją trzy główne lokalizacje anatomiczne, w których umieszczono kliniczne protezy siatkówki: nasiatkówkowo3,4, podsiatkówkowo5,6 i nadnaczyniówkowo7,8. Różne urządzenia wykorzystują różne materiały, a ich forma jest dostosowana do miejsca, w którym są wszczepiane. Jednak wszystkie one tworzą percepcje wizualne poprzez aktywację szczątkowych neuronów siatkówki za pomocą impulsów elektrycznych.
Istnieje możliwość, że każda proteza medyczna uszkodzi otaczającą tkankę z powodu mechanicznych efektów początkowego umieszczenia lub późniejszych ciągłych sił. W przypadku stymulatorów wszczepialnych, takich jak protezy siatkówki, należy dodatkowo wziąć pod uwagę, że parametry elektryczne powinny mieścić się w bezpiecznych granicach. Bezpieczeństwo pacjenta jest najważniejsze, dlatego urządzenia muszą być rygorystycznie testowane w badaniach przedklinicznych przed przejściem do warunków klinicznych9-15. W naszym artykule towarzyszącym opisaliśmy metodę oceny miejscowej histopatologii oka otaczającego implant umieszczony w przestrzeni nadnaczyniówkowej16. W niniejszym manuskrypcie opisano technikę wizualizacji tkanki oka otaczającej matrycę elektrod przyklejoną do siatkówki nasiatkówkowo, w modelu przedklinicznym (u kotów) (ryc. 1).
Lokalizacja nasiatkówkowa jest najczęściej używaną pozycją do lokalizacji protezy wizualnej. Umieszczone tutaj układy elektrod są zwykle przymocowane do siatkówki za pomocą metalowej pinezki, która przenika przez wszystkie warstwy oka17-20. Przed zastosowaniem technik opisanych w niniejszym manuskrypcie trudno było dokładnie ocenić siatkówkę i inne tkanki bezpośrednio otaczające hals. Standardowa fiksacja oka przy użyciu neutralnej buforowanej formaliny powodowała sztuczne uszkodzenie siatkówki spowodowane różnicowym ruchem siatkówki i twardówki w stosunku do ustalonego punktu halsowania. W związku z tym nie można było dokładnie zaobserwować żadnych rzeczywistych uszkodzeń spowodowanych przez przyczepność i matrycę nasiatkówkową. Ponadto przekrój tkanki oka nie mógł być wykonany za pomocą przyczepiania siatkówki in situ, ponieważ metalowe przedmioty nie mogą być łatwo przecięte za pomocą tradycyjnego aparatu histologicznego; Usunięcie sczepienia przed obróbką histologiczną było również niepożądane, ponieważ prowadziło to również do sztucznego uszkodzenia siatkówki.
Cel niniejszego badania był dwojaki: 1) zmniejszenie artefaktu odwarstwienia siatkówki, tak aby można było wiarygodnie ocenić wszelkie uszkodzenia spowodowane przez przyczepność i matrycę implantów nasiatkówkowych; oraz 2) uwidocznienie architektury siatkówki przylegającej do halsu bez jej usuwania. Aby osiągnąć cel 1, zastosowano nową technikę fiksacji (opisaną w towarzyszącym jej artykule16), która zmniejsza sztuczne rozwarstwienie siatkówki. Aby osiągnąć cel 2, zmodyfikowaliśmy technikę osadzania, szlifowania i polerowania, pierwotnie opracowaną do obserwacji in situ elektrod implantu ślimakowego21-23. Metody opisane w tym manuskrypcie pozwalają na wizualizację siatkówki otaczającej i przylegającej do halsu in situ, przy jednoczesnej minimalizacji sztucznych uszkodzeń siatkówki, a tym samym umożliwieniu dokładnej oceny wszelkich potencjalnych uszkodzeń spowodowanych przez przyczepność i układ nasiatkówkowy.
Protokół
UWAGA: Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Badań i Etyki Zwierząt Szpitala Królewskiego Wiktoriańskiego Szpitala Okulistycznego i Słuchowego (RVEEH AEC; #10-199AB). Badani byli traktowani zgodnie z "Australijskim Kodeksem Postępowania w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych" Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (2013) oraz "Ustawą o zapobieganiu okrucieństwu wobec zwierząt" (1986 r. z poprawkami). Wszystkie zabiegi chirurgiczne, kliniczne i elektrofizjologiczne przeprowadzano w znieczuleniu i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie.
1. Wyłuszczenie i utrwalenie
UWAGA: Postępuj zgodnie z procedurą enukleacji i utrwalania opisaną szczegółowo w towarzyszącym manuskrypcie16, zwracając szczególną uwagę na urządzeń lub porty witrektomii, jeśli są obecne. W skrócie obejmuje to:
- Przezrozdzielczo perfuzjuj obiekt ciepłą solą fizjologiczną, a następnie zimną, neutralną, buforowaną formaliną.
- Przywiąż szwy do gałki ocznej, aby służyły jako punkty orientacyjne.
- Wyłuszczenie oka16, utrzymując urządzenia i wszelkie łatki/wypustki mocujące.
- Po namocowaniu oka w roztworze Davidsona przez 18 - 36 godzin.
- Przenieś do 50% etanolu na 6 - 8 godzin.
- Przenieść do 70% etanolu i przechowywać w lodówce (4 °C) do momentu rozbioru.
2. Usuwanie i preparowanie elektrod.
UWAGA: Nie wszystkie implanty epiretinalne będą miały ten sam współczynnik kształtu, ale generalnie będzie istniał układ elektrod i pewna forma elastycznego i elastycznego materiału nośnego. Urządzenia, które są przyklejane do siatkówki, mają otwór zaczepiowy, w którym metalowa pinezka przenika przez matrycę i tylną część oka, utrzymując je razem.
- Wizualizuj implant i punkt, w którym jest on przymocowany do siatkówki.
- Za pomocą ostrza 15 stopni wykonaj obwodowe nacięcie przezrogówkowe i zdejmij osłonkę rogówki, aby odsłonić leżącą pod spodem tęczówkę i soczewkę.
- Za pomocą ostrza o kącie 15 stopni włóż włókna strefowe soczewki i wyjmij soczewkę in toto, odsłaniając tylną komorę za pomocą implantu nasiatkówkowego i metalowej przystawki in situ.
- W zależności od implantu i wykonywanego badania, przed dalszą sekcją należy usunąć obce elementy.
UWAGA: W niniejszym przykładzie oceniana matryca epiretinalna składała się z prototypu hermetycznej elektrody diamentowej i pakietu elektroniki umieszczonego w konforemnym nośniku silikonowym (produkowanym we własnym zakresie; patrz 20).- Tutaj ostrożnie wyjmij pakiet elektrod diamentowych przez dokładne rozcięcie skalpelem. Pozostaw silikonowy korpus implantu wraz z przyczepem siatkówkowym i resztkami platynowego okablowania (ryc. 2). Jeśli wbudowana macierz/obudowa nie jest częścią badanego projektu urządzenia, należy pominąć ten krok (2.2).
- Ostrożnie przeciąć próbkę, która zawiera sczepianie i otaczającą tkankę w pożądanej orientacji. Użyj cienkich nożyczek preparacyjnych, aby wyciąć paski o pełnej grubości z tyłu oka, w tym twardówkę, naczyniówkę i siatkówkę. Pobrać próbkę, która daje podłużny przekrój poprzeczny halki, pokazujący wszystkie warstwy siatkówki przylegające do halki (rysunek 2)
UWAGA: Pożądana orientacja próbki może się różnić w zależności od konkretnego pożądanego wyniku. Na przykład, jeśli chce się zbadać bliskość uszkodzenia przyczepności do tarczy optycznej, to tarcza optyczna powinna zostać włączona do próbki.
3. Odwodnienie, osadzanie, montaż, szlifowanie, barwienie i obrazowanie
- Odwadniać próbkę przez trzy dni w stopniowych etapach etanolu:
- Odwodnić próbkę w 70% etanolu przez 2 godziny dwukrotnie.
- Odwodnić próbkę w 80% etanolu przez 2 godziny dwa razy, a następnie O/N.
- Odwodnić próbkę w 90% etanolu przez 2 godziny dwukrotnie.
- Odwodnić próbkę w 100% etanolu przez 2 godziny dwa razy, a następnie O/N.
- Odwodnić próbkę w 100% acetonie przez 2 godziny dwukrotnie.
- Wyjmij próbkę z acetonu i obserwuj ją pod mikroskopem świetlnym, jak wysycha na powietrzu w temperaturze pokojowej. Przenieś próbkę do żywicy epoksydowej (patrz krok 3.4) tuż przed tym, jak zacznie się zwijać/zapadać.
UWAGA: Usunięcie płynu z tkanek miękkich powoduje zapadnięcie się komórek i obkurczenie. Zrozumienie, kiedy dochodzi do zwijania/zapadania się tkanki, rozwija się wraz z doświadczeniem.
- Wyjmij próbkę z acetonu i obserwuj ją pod mikroskopem świetlnym, jak wysycha na powietrzu w temperaturze pokojowej. Przenieś próbkę do żywicy epoksydowej (patrz krok 3.4) tuż przed tym, jak zacznie się zwijać/zapadać.
- Przygotuj żywicę epoksydową klasy medycznej zgodnie ze wskazówkami producenta. Aby utwardzić żywicę, należy użyć temperatury 55 °C przez 1 godzinę lub 24 godziny w temperaturze pokojowej. Umieścić w komorze próżniowej na ~ 5 minut przy ~ 50 mbar w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Reguluj podciśnienie ręcznie, ponieważ nadmierna próżnia spowoduje wrzenie mieszanki epoksydowej, a odgazowanie nie nastąpi skutecznie
UWAGA: Wykonaj krok 3.3 równolegle z krokiem 3.2. - Zanurz próbkę w przezroczystej żywicy epoksydowej. Zanurz tkankę oka w odgazowanej żywicy epoksydowej w odpowiednim zamykanym pojemniku i pozostaw O/N w temperaturze RT do utwardzenia.
- Należy zwrócić uwagę, aby osadzić próbkę w żądanej orientacji (rysunek 2), zmieniając rozmiar i ponownie osadzając utwardzony blok epoksydowy. Ponownie osadź blok o zmienionym rozmiarze zawierający tkankę oka w taki sposób, aby długa oś przyczepności była zorientowana równolegle do dna formy (żółty kubek - rysunek 3A).
- Zamontuj żywicę w uchwycie na próbkę do mielenia i zmiel próbkę (230 - 250 obr./min z włączoną wodą, mielenie ręczne) za pomocą papieru z węglika krzemu (zaczynając od siatki 800; Rysunki 3C i 3E).
- W celu barwienia zanurz powierzchnię gruntu w barwie błękitu toluidynowego na 3-5 minut lub do momentu powstania plamy (ryc. 3F).
- Spłucz wodą z kranu (Rysunek 3G).
- Zobrazuj powierzchnię gruntu próbki za pomocą lunety do preparacji o dużej mocy, aby uwidocznić warstwy komórkowe siatkówki (ryc. 3H). Nałóż kroplę wody destylowanej na górną powierzchnię żywicy epoksydowej nad próbką, aby wygładzić dyfrakcję na granicy faz powietrze-żywica epoksydowa. Do oświetlenia próbki należy użyć światłowodowego źródła światła typu "gęsia szyja".
- Powtórzyć kroki 3.6 – 3.9, za każdym razem szlifując wstępnie ustawioną grubość próbki (minimalny precyzyjny i powtarzalny przyrost mielenia uchwytu próbki wynosi 20 μm).
Wyniki
Protokół fiksacji znacząco zredukował artefaktowe odwarstwienie i delaminację siatkówki16. Orientację preparatu w bloku epoksydowym uzyskano w sposób spójny, stosując opisany dwuetapowy proces zatapiania. Procedura szlifowania stopniowego wymagała umiarkowanej zręczności manualnej w celu osiągnięcia optymalnych wyników, jednak ułatwił ją regulowany uchwyt na preparat, który zapewniał precyzyjną kontrolę nad rozdzielczością przyrostów. We wszystkich przypadkach (n = 5) tackę zlokalizowano i poddano szlifowaniu/polerowaniu z pożądanymi i spójnymi rezultatami. Siatkówki sąsiadujące z tackami były możliwe do rozdzielenia i zostały odpowiednio zabarwione. Polerowanie powierzchni bloku z żywicy epoksydowej papierem z węglika krzemu o gradacji P#800 było wystarczające do obrazowania makrostruktury komórkowej zatopionej tkanki. W razie potrzeby można zastosować papier o wyższej gradacji lub zawiesinę diamentową, aby dodatkowo wypolerować powierzchnię na dowolnej zadanej głębokości. Do obrazowania powierzchni szlifowanego bloku i próbki zatopionej tkanki za odpowiednie uznano mikroskop sekcyjny oraz światłowodowe źródło światła typu „gęsia szyja”. Pozycję źródła światła zmieniano metodą prób i błędów, aby znaleźć lokalizację i kąt zapewniające najlepsze oświetlenie i kontrast w mikroskopie. Dodanie kropli wody destylowanej na powierzchnię bloku, powyżej próbki, było pomocne w redukcji dyfrakcji drogi światła i/lub wygładzeniu zniekształceń na granicy epoksydu i powietrza. Rycina 4 przedstawia przykładowe obrazy tkanki siatkówki zwizualizowanej bezpośrednio przy tytanowej tackie siatkówkowej przy użyciu tej techniki. Nieartefaktowe odwarstwienie i fałdowanie siatkówki jest widoczne po obu stronach silikonu (Rycina 4A). Trzon tacki jest widoczny jako zatopiony w silikonie; główka tacki przebiła siatkówkę i twardówkę. Po obu stronach silikonu w niezabarwionej siatkówce widoczne jest nieartefaktowe odwarstwienie siatkówki (Rycina 4C). Technika ta wykazała, że w tym przypadku występuje dezorganizacja siatkówki w sąsiedztwie tacki oraz kompresja siatkówki po jednej stronie z powodu skośnego kąta wprowadzenia. Należy zauważyć, że przedstawione obrazy są jedynie ilustracjami skuteczności techniki, a nie reprezentatywnym przykładem histopatologii uszkodzeń spowodowanych tackami w ujęciu ogólnym.
Rysunek 1. Umiejscowienie epiretinalnej macierzy elektrod. (A) Schemat oka przedstawiający powiększony przekrój poprzeczny tylnej części twardówki, naczyniówki i zdegenerowanej siatkówki (pozbawionej fotoreceptorów). Macierz elektrod zaznaczono na niebiesko, przymocowaną epiretinalnie. (B) Rysunek komputerowy epiretinalnej macierzy elektrod. a, układ scalony („chip”) i obudowa elektrod; b, tytanowy Tack siatkówkowy; c, obudowa z silikonu klasy medycznej; d, punkt wyjścia przewodu. Panel A zmodyfikowano na podstawie oryginalnej ilustracji udostępnionej przez Bionic Vision Australia, copyright Beth Croce. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2. Usunięcie elektrody i sekcja oka. Makrofotografie o wysokiej rozpiętości tonalnej enukleowanego oka kota z tacką epiretynalną in situ. (A) Po utrwaleniu fiksatywem Davidsona w celu zachowania architektury siatkówki16, enukleowane oko poddano sekcji. Pakiet macierzy elektrod usunięto z silikonowego nośnika (przerywany kwadrat wskazuje pierwotną lokalizację macierzy elektrod), przy czym tacka (strzałka) i silikonowy korpus implantu pozostały na miejscu. (B) Oko poddano sekcji wzdłuż przekroju podłużnego sąsiadującego z tacką (przerywana linia). Tacka pozostaje osadzona w tylnej ścianie gałki ocznej (strzałka), stabilizowana głównie przez twardówkę. Przekrój tkanki zawierający tackę przygotowano do zatapiania w żywicy i szlifowania (segment prawy), natomiast przekrój zawierający siatkówkę pod usuniętą macierzą elektrod przygotowano do standardowego przetwarzania histologicznego16 (segment lewy). Na dolnej krawędzi każdego panelu widoczna jest linijka z podziałką 0.5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3. Zatapianie w żywicy epoksydowej i szlifowanie tacki oraz tkanki siatkówki. Fotografie próbki tkanki zatopionej w żywicy epoksydowej i wyrównanej, szlifowania, barwienia oraz obrazowania tacki i tkanki siatkówki. (A) Próbka tacki została zatopiona w bloku żywicy epoksydowej. Przy użyciu formy próbkę zorientowano tak, aby płaszczyzna podłużna była równoległa do dna formy. (B) Utwardzony blok epoksydowy zawierający próbkę tacki. (C) Blok epoksydowy zamontowano w uchwycie do szlifowania próbek, w celu przygotowania do szlifowania. (D) Próbkę zorientowano tak, aby obrazowane sekcje szlifowanej tkanki zawierały komórkowe warstwy siatkówki oraz oś podłużną tacki. (E) Próbkę szlifowano przy użyciu papieru z węglika krzemu na szlifierce rotacyjnej. (F) Szlifowaną powierzchnię bloku zabarwiono błękitem toluidyny w celu zidentyfikowania warstw siatkówki. (G) Blok przepłukano wodą z kranu, aby usunąć nadmiar barwnika. (H) Zabarwione błękitem toluidyny warstwy siatkówki oraz tacka zostały obrazowane przy użyciu wysokiej mocy stereomikroskopu sekcyjnego.
Rycina 4. Obrazy przy dużym i małym powiększeniu tacki i siatkówki. Na różnych etapach procesu szlifowania wykonano zdjęcia za pomocą stereomikroskopu, przedstawiające przekroje podłużne tacki (gwiazdka) penetrującej oko i wychodzącej przez twardówkę („S”), przylegający silikon (kratka) oraz siatkówkę barwioną błękitem toluidyny i niebarwioną („R”). Należy zauważyć, że są to jedynie obrazy poglądowe służące do zademonstrowania obecnej techniki wizualizacji i nie są reprezentatywne dla wszystkich wyników histologicznych implantu epiretinalnego lub wprowadzania tacki. Szlifowane pozostałości platynowych przewodów są widoczne w panelach A-D („W”). (A) Obraz przy małym powiększeniu, niebarwiony, przedstawiający tackę penetrującą siatkówkę i twardówkę. (B) Obraz przy dużym powiększeniu ukazujący odwarstwienie i fałdowanie siatkówki w niebarwionej siatkówce sąsiadującej z nośnikiem silikonowym na obrazie A. (C) Obraz przy małym powiększeniu w centrum trzonu tacki. (D) Obraz przy dużym powiększeniu centrum tacki z obrazu C. (E) W oddzielnej próbce, bez nośnika silikonowego, pokazano obraz przy dużym powiększeniu siatkówki barwionej błękitem toluidyny pod główką tacki, bezpośrednio przed szlifowaniem trzonu tacki. (F) Normalna architektura siatkówki barwiona błękitem toluidyny (GCL: warstwa komórek zwojowych siatkówki; INL: wewnętrzna warstwa jądrowa; ONL: zewnętrzna warstwa jądrowa; PR: fotoreceptory; T: tapetum lucidum kota) wizualizowana przy użyciu tej samej techniki szlifowania. Paski skali w każdym panelu wynoszą: A i C = 2 mm; B i D = 500 µm; E = 200 µm; F = 100 µm.
Dyskusja
Standardowe techniki histologiczne nie są w stanie przetwarzać implantów z twardego metalu in situ ze względu na ograniczenia w cięciu tych obiektów za pomocą ostrzy metalowych, szklanych, a nawet diamentowych. W naszym artykuletowarzyszącym 16 wykazaliśmy, że zastosowanie zmodyfikowanej techniki fiksacji całego oka może zmniejszyć sztuczne rozwarstwienie siatkówki. W obecnym manuskrypcie uznana technika szlifowania i polerowania do wizualizacji implantów ślimakowych21-23in situ została zmodyfikowana dla protez siatkówki. Tytanowa folia, używana do mocowania matrycy elektrod do siatkówki, nasiatkówkowo, została osadzona w żywicy epoksydowej wraz z otaczającą tkanką oka. Ten blok żywicy został następnie odpowiednio zorientowany i stopniowo szlifowany/polerowany, aby ujawnić morfologię tkanki bezpośrednio przylegającej do metalowej przyczepności. Zdjęcia wypolerowanej powierzchni bloku na różnych głębokościach zostały wykonane za pomocą potężnego mikroskopu preparacyjnego. Technika ta jest przydatna do: wizualizacji i oceny odpowiedzi tkanek sąsiadujących z implantem nasiatkówkowym; ocena urazu chirurgicznego związanego z implantacją implantu; określenie reakcji biologicznej na składniki z twardego metalu; oraz do pomiaru odległości między implantem a powierzchnią siatkówki.
Technika ta będzie przydatna w przyszłych badaniach bezpieczeństwa w zakresie wizualizacji in situ obszaru przylegającego do przyczepu siatkówki lub innych twardych (np . metalicznych) obiektów w oku. Ma to bezpośrednie zastosowanie w ocenie bezpieczeństwa przedklinicznego protez przyklejanych do siatkówki nasiatkówkowo. Może być również przydatny do oceny uszkodzeń tkanek w obszarach siatkówki stykających się z implantami znajdującymi się w lokalizacji podsiatkówkowej.
Istnieje kilka sposobów sprawdzenia, czy technika została wykonana poprawnie. Na każdym etapie siatkówka powinna pozostać przyczepiona do zewnętrznych warstw oka. Jeśli występuje duże sztuczne odwarstwienie siatkówki, może to wskazywać na problem z fiksacją. Gdy próbka jest osadzona i ponownie zorientowana w końcowym bloku żywicy, siatkówka powinna być zbliżona do prostopadłej powierzchni szlifierskiej bloku; Zminimalizuje to ukośne cięcie. Przydatne jest sprawdzenie, czy liczba stopniowych etapów szlifowania (o znanej wielkości kroku) wymaganych do przejścia przez obiekt (taki jak przyczepność siatkówki) jest odpowiednio skorelowana z wymiarami obiektu.
Technikę tę można zoptymalizować na kilka sposobów. Zarysowania na powierzchni bloku epoksydowego związane z procesem szlifowania można zredukować dzięki stopniowemu polerowaniu o coraz drobniejszym gatunku. Do niniejszego badania użyliśmy papieru z węglika krzemu klasy 800, 1000, 1200, 2400 i 4000. Pasta diamentowa może być również stosowana w celu poprawy wykończenia powierzchni. Drobniejsze wykończenie powierzchni zapewnia wyższą jakość obrazu, ale kosztem dodatkowego czasu polerowania. Innym krytycznym czynnikiem wpływającym na poprawę wyników tej techniki jest wybór i jakość optyki i oświetlenia użytego do uchwycenia obrazu. Inne podstawowe barwienia histologiczne – w szczególności barwienia Nissl – mogą być stosowane zamiast błękitu toluidynowego, ale mogą wymagać dalszej optymalizacji. Niektóre plamy plamią zarówno żywicę, jak i tkankę (np. Eozyna), dlatego po barwieniu może być wymagane płytkie polerowanie w celu usunięcia przebarwień tła. Nie próbowano stosować specjalistycznych barwień, barwników fluorescencyjnych i barwień immunohistochemicznych, ale jeśli nie jest pożądany bardzo konkretny wynik, czas potrzebny do wykonania tych barwień na każdym poziomie mielenia może być zaporowy. Możliwe jest jednak zabarwienie tkanki jako całości przed etapem zatapiania (etap 3.4)24.
Głównym ograniczeniem tej techniki jest to, że po zeszlifowaniu obszaru zainteresowania nie można go odzyskać, dlatego rozsądnie jest uchwycić wiele (być może zbędnych) obrazów w różnych powiększeniach na każdym etapie szlifowania i polerowania. Ważne jest również, aby przy każdej regulacji głębokości szlifowania stosować małe przyrosty. Innym ograniczeniem tej techniki jest powiększenie optyczne i rozdzielczość w porównaniu z tkanką zamontowaną na szkiełku podstawowym i oglądaną za pomocą standardowego (transmisyjnego) mikroskopu świetlnego. Do celów prototypowania i oceny bezpieczeństwa nowatorskiego implantu pierwszorzędne znaczenie ma ogólna ocena patologiczna. Technika ta zapewnia skuteczną metodę obserwacji klinicznie istotnych uszkodzeń związanych z przyczepnością siatkówki. Przy nabraniu wprawy, całkowity czas potrzebny na zebranie, zmielenie, wypolerowanie i sfotografowanie danej próbki (raz osadzonej) jest porównywalny z czasem, jaki zajęłoby przecięcie bloku parafiny lub wycinka mrożonego.
Istnieje również możliwość rozszerzenia obecnych technik na zastosowania wykraczające poza zakres implantów siatkówki. Technika ta nadaje się do oceny tkanki przylegającej do twardego implantu, w przypadku gdy ekstrakcja implantu nie jest możliwa lub uszkodziłaby interfejs. Na przykład technika ta może zostać rozszerzona o ocenę implantów wykonanych z metalu (np. platyny, nitinolu itp.), których nie można przeciąć konwencjonalnymi technikami histologicznymi, takimi jak głębokie elektrody mózgowe lub nerwy obwodowe, kaniule do dostarczania leków, stenty naczyniowe lub protezy ortopedyczne.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Irfan Durmo jest pracownikiem firmy Cochlear Ltd.
Podziękowania
Nicole Vella (Macquarie University) za dostarczenie odczynników; Alexia Saunder (Instytut Bioniki; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) za wsparcie eksperymentalne; personel Centrum Badań Biologicznych Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) zajmujący się opieką nad zwierzętami; Sue Pierce (RVEEH) za poradę weterynaryjną; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamarze Brawn (BVA) i personelowi BVA w celu uzyskania wsparcia administracyjnego.
To badanie było wspierane przez Australijską Radę ds. Badań Naukowych (ARC) poprzez grant Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology dla Bionic Vision Australia (BVA). Instytut Bioniki otrzymuje wsparcie w zakresie infrastruktury operacyjnej od rządu stanu Wiktoria, a także potwierdza wsparcie ze strony Bertalli Family Trust i J T Reid Charitable Trust. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.
Autorami tego manuskryptu są konsorcja Bionic Vision Australia (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos i Jonathan Yeoh.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Aceton | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Klasa medyczna |
| Epo-Tek 301 Technologia | epoksydowo-epoksydowa | Część A 1675-54-3 Część B 9046-10-0 | |
| Etanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alkohol |
| etylowy | Merck PTY LTD | 90143 | Alkohol |
| Toluidyna niebieska O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Kwas etylenodiamino-tetraoctowy | Sigma-Aldrich | ||
| Maszyna do szlifowania/polerowania TegraPol | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop | Mikroskop Struers | Accustop | |
| Light | Obiektyw Leica | MZ16 | |
| Obiektyw | Leica | 2.0x Planapo Obiektyw | |
| Cyfrowy Mikroskop Fotograficzny | Leica | DFC-420C | |
| Leica | Pakiet aplikacji w wersji 4.1.0 |
Bibliografia
- Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. Visual prostheses for the blind. Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).
- Santos, A., et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).
- Humayun, M. S., et al. Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis. Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).
- Roessler, G., et al. Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).
- Chow, A. Y., et al. The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).
- Fujikado, T., et al. Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).
- Saunders, A. L., et al. Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis. Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).
- Lee, S. W., et al. Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).
- Sakaguchi, H., et al. Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes. Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).
- Majji, A. B., et al. Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Walter, P., et al. Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits. Retina. 19, 546-552 (1999).
- Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).
- Colodetti, L., et al. Pathology of damaging electrical stimulation in the retina. Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).
- Nayagam, D. A. X., et al. Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study. PLoS One. 9, e97182(2014).
- Nayagam, D. A. X., et al. Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411(2013).
- Laube, T., et al. Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs. Graefe's Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).
- Gerding, H., et al. Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants. Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).
- Seo, J. -M., et al. Silicon retinal tack for the epiretinal fixation of the polyimide electrode array. Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).
- Hadjinicolaou, A. E., et al. Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis. Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).
- Briggs, R. J., et al. Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode. Audiol Neurootol. 11, Suppl 1. 42-48 (2006).
- Shepherd, R., et al. An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies. Hear Res. 277, 20-27 (2011).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21, 205-211 (2000).
- Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy. Brain Res. 1000, 200-210 (2004).
Przedruki i uprawnienia
