Techniki przetwarzania oczu z wszczepioną protezą siatkówki do miejscowej analizy histopatologicznej: Część 2 Implanty nasiatkówkowe z pinezkami siatkówkowymi

Summary

Tutaj opisujemy techniki histologiczne wizualizacji tkanki oka bezpośrednio przylegającej do metalowej protezy nasiatkówkowej i siatkówki.

Abstract

Protezy siatkówki do leczenia niektórych form ślepoty zyskują na popularności w badaniach klinicznych na całym świecie, a obecnie na rynku pojawiają się komercyjne urządzenia. Aby ocenić bezpieczeństwo tych urządzeń, w badaniach przedklinicznych potrzebne są wiarygodne techniki. Jednak elementy z twardego metalu stosowane w niektórych implantach siatkówki nie są kompatybilne z tradycyjnymi procesami histologicznymi, szczególnie biorąc pod uwagę delikatną naturę otaczającej tkanki. W tym miejscu opisujemy techniki oceny stanu zdrowia oka bezpośrednio przylegającego do implantu siatkówki zabezpieczonego nasiatkówkowo metalowym pinezką.

Protezy siatkówki mają układy elektrod stykających się z tkanką oka. Najczęściej stosowanym miejscem do implantacji jest lokalizacja nasiatkówkowa (tylna komora oka), gdzie implant jest przymocowany do siatkówki za pomocą metalowego haczyka, który przenika przez wszystkie warstwy oka. Poprzednie metody nie były w stanie ocenić proksymalnej tkanki oka za pomocą halsu in situ, ze względu na niezdolność tradycyjnych technik histologicznych do cięcia metalowych przedmiotów. W związku z tym trudno było ocenić miejscowe uszkodzenia, jeśli występują, spowodowane wprowadzeniem halsu.

Dlatego opracowaliśmy technikę wizualizacji tkanki wokół siatkówki i implantu. Zmodyfikowaliśmy uznaną technikę, używaną do przetwarzania i wizualizacji twardej tkanki kostnej wokół implantu ślimakowego, dla miękkich, delikatnych tkanek oka. Utrwaloną tkankę oka, w tym implant i przyczepność siatkówki, utrwaliliśmy i osadziliśmy w żywicy epoksydowej, aby ustabilizować i chronić strukturę próbki. Osadzone próbki były następnie mielone, polerowane, barwione i obrazowane pod różnymi powiększeniami na przyrostowych głębokościach przez próbkę. Technika ta pozwoliła na wiarygodną ocenę integralności tkanki oka i cytoarchitektury przylegającej do metalowej przyczepności.

Introduction

Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) jest dziedzicznym zaburzeniem, które powoduje powszechną utratę fotoreceptorów, które są komórkami w najbardziej zewnętrznej warstwie siatkówki odpowiedzialnymi za przekształcanie światła, w postaci fotonów, w aktywność neuronalną. Co ważne, pacjenci z RP zazwyczaj mają szczątkowe neurony w innych warstwach siatkówki, które nadal działają. Protezy siatkówki są w stanie przywrócić tym pacjentom pewne ograniczone widzenie poprzez skierowanie do tych neuronów, które przeżyły, stymulacji elektrycznej, aby aktywować ich ścieżkę wzrokową^1,2. Percepcyjne wyniki badań klinicznych wykazały obiecujące wczesne wyniki, a ostatnio niektóre urządzenia zostały zatwierdzone do użytku komercyjnego. Obecnie istnieją trzy główne lokalizacje anatomiczne, w których umieszczono kliniczne protezy siatkówki: nasiatkówkowo^3,4, podsiatkówkowo^5,6 i nadnaczyniówkowo^7,8. Różne urządzenia wykorzystują różne materiały, a ich forma jest dostosowana do miejsca, w którym są wszczepiane. Jednak wszystkie one tworzą percepcje wizualne poprzez aktywację szczątkowych neuronów siatkówki za pomocą impulsów elektrycznych.

Istnieje możliwość, że każda proteza medyczna uszkodzi otaczającą tkankę z powodu mechanicznych efektów początkowego umieszczenia lub późniejszych ciągłych sił. W przypadku stymulatorów wszczepialnych, takich jak protezy siatkówki, należy dodatkowo wziąć pod uwagę, że parametry elektryczne powinny mieścić się w bezpiecznych granicach. Bezpieczeństwo pacjenta jest najważniejsze, dlatego urządzenia muszą być rygorystycznie testowane w badaniach przedklinicznych przed przejściem do warunków klinicznych^9-15. W naszym artykule towarzyszącym opisaliśmy metodę oceny miejscowej histopatologii oka otaczającego implant umieszczony w przestrzeni nadnaczyniówkowej¹⁶. W niniejszym manuskrypcie opisano technikę wizualizacji tkanki oka otaczającej matrycę elektrod przyklejoną do siatkówki nasiatkówkowo, w modelu przedklinicznym (u kotów) (ryc. 1).

Lokalizacja nasiatkówkowa jest najczęściej używaną pozycją do lokalizacji protezy wizualnej. Umieszczone tutaj układy elektrod są zwykle przymocowane do siatkówki za pomocą metalowej pinezki, która przenika przez wszystkie warstwy oka^17-20. Przed zastosowaniem technik opisanych w niniejszym manuskrypcie trudno było dokładnie ocenić siatkówkę i inne tkanki bezpośrednio otaczające hals. Standardowa fiksacja oka przy użyciu neutralnej buforowanej formaliny powodowała sztuczne uszkodzenie siatkówki spowodowane różnicowym ruchem siatkówki i twardówki w stosunku do ustalonego punktu halsowania. W związku z tym nie można było dokładnie zaobserwować żadnych rzeczywistych uszkodzeń spowodowanych przez przyczepność i matrycę nasiatkówkową. Ponadto przekrój tkanki oka nie mógł być wykonany za pomocą przyczepiania siatkówki in situ, ponieważ metalowe przedmioty nie mogą być łatwo przecięte za pomocą tradycyjnego aparatu histologicznego; Usunięcie sczepienia przed obróbką histologiczną było również niepożądane, ponieważ prowadziło to również do sztucznego uszkodzenia siatkówki.

Cel niniejszego badania był dwojaki: 1) zmniejszenie artefaktu odwarstwienia siatkówki, tak aby można było wiarygodnie ocenić wszelkie uszkodzenia spowodowane przez przyczepność i matrycę implantów nasiatkówkowych; oraz 2) uwidocznienie architektury siatkówki przylegającej do halsu bez jej usuwania. Aby osiągnąć cel 1, zastosowano nową technikę fiksacji (opisaną w towarzyszącym jej artykule¹⁶), która zmniejsza sztuczne rozwarstwienie siatkówki. Aby osiągnąć cel 2, zmodyfikowaliśmy technikę osadzania, szlifowania i polerowania, pierwotnie opracowaną do obserwacji in situ elektrod implantu ślimakowego^21-23. Metody opisane w tym manuskrypcie pozwalają na wizualizację siatkówki otaczającej i przylegającej do halsu in situ, przy jednoczesnej minimalizacji sztucznych uszkodzeń siatkówki, a tym samym umożliwieniu dokładnej oceny wszelkich potencjalnych uszkodzeń spowodowanych przez przyczepność i układ nasiatkówkowy.

Protocol

UWAGA: Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Badań i Etyki Zwierząt Szpitala Królewskiego Wiktoriańskiego Szpitala Okulistycznego i Słuchowego (RVEEH AEC; #10-199AB). Badani byli traktowani zgodnie z "Australijskim Kodeksem Postępowania w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych" Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (2013) oraz "Ustawą o zapobieganiu okrucieństwu wobec zwierząt" (1986 r. z poprawkami). Wszystkie zabiegi chirurgiczne, kliniczne i elektrofizjologiczne przeprowadzano w znieczuleniu i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie.

1. Wyłuszczenie i utrwalenie

UWAGA: Postępuj zgodnie z procedurą enukleacji i utrwalania opisaną szczegółowo w towarzyszącym manuskrypcie¹⁶, zwracając szczególną uwagę na urządzeń lub porty witrektomii, jeśli są obecne. W skrócie obejmuje to:

1. Przezrozdzielczo perfuzjuj obiekt ciepłą solą fizjologiczną, a następnie zimną, neutralną, buforowaną formaliną.
2. Przywiąż szwy do gałki ocznej, aby służyły jako punkty orientacyjne.
3. Wyłuszczenie oka¹⁶, utrzymując urządzenia i wszelkie łatki/wypustki mocujące.
4. Po namocowaniu oka w roztworze Davidsona przez 18 - 36 godzin.
5. Przenieś do 50% etanolu na 6 - 8 godzin.
6. Przenieść do 70% etanolu i przechowywać w lodówce (4 °C) do momentu rozbioru.

2. Usuwanie i preparowanie elektrod.

UWAGA: Nie wszystkie implanty epiretinalne będą miały ten sam współczynnik kształtu, ale generalnie będzie istniał układ elektrod i pewna forma elastycznego i elastycznego materiału nośnego. Urządzenia, które są przyklejane do siatkówki, mają otwór zaczepiowy, w którym metalowa pinezka przenika przez matrycę i tylną część oka, utrzymując je razem.

1. Wizualizuj implant i punkt, w którym jest on przymocowany do siatkówki.
   1. Za pomocą ostrza 15 stopni wykonaj obwodowe nacięcie przezrogówkowe i zdejmij osłonkę rogówki, aby odsłonić leżącą pod spodem tęczówkę i soczewkę.
   2. Za pomocą ostrza o kącie 15 stopni włóż włókna strefowe soczewki i wyjmij soczewkę in toto, odsłaniając tylną komorę za pomocą implantu nasiatkówkowego i metalowej przystawki in situ.
2. W zależności od implantu i wykonywanego badania, przed dalszą sekcją należy usunąć obce elementy.
   UWAGA: W niniejszym przykładzie oceniana matryca epiretinalna składała się z prototypu hermetycznej elektrody diamentowej i pakietu elektroniki umieszczonego w konforemnym nośniku silikonowym (produkowanym we własnym zakresie; patrz ²⁰).
   1. Tutaj ostrożnie wyjmij pakiet elektrod diamentowych przez dokładne rozcięcie skalpelem. Pozostaw silikonowy korpus implantu wraz z przyczepem siatkówkowym i resztkami platynowego okablowania (ryc. 2). Jeśli wbudowana macierz/obudowa nie jest częścią badanego projektu urządzenia, należy pominąć ten krok (2.2).
3. Ostrożnie przeciąć próbkę, która zawiera sczepianie i otaczającą tkankę w pożądanej orientacji. Użyj cienkich nożyczek preparacyjnych, aby wyciąć paski o pełnej grubości z tyłu oka, w tym twardówkę, naczyniówkę i siatkówkę. Pobrać próbkę, która daje podłużny przekrój poprzeczny halki, pokazujący wszystkie warstwy siatkówki przylegające do halki (rysunek 2)
   UWAGA: Pożądana orientacja próbki może się różnić w zależności od konkretnego pożądanego wyniku. Na przykład, jeśli chce się zbadać bliskość uszkodzenia przyczepności do tarczy optycznej, to tarcza optyczna powinna zostać włączona do próbki.

3. Odwodnienie, osadzanie, montaż, szlifowanie, barwienie i obrazowanie

1. Odwadniać próbkę przez trzy dni w stopniowych etapach etanolu:
   1. Odwodnić próbkę w 70% etanolu przez 2 godziny dwukrotnie.
   2. Odwodnić próbkę w 80% etanolu przez 2 godziny dwa razy, a następnie O/N.
   3. Odwodnić próbkę w 90% etanolu przez 2 godziny dwukrotnie.
   4. Odwodnić próbkę w 100% etanolu przez 2 godziny dwa razy, a następnie O/N.
2. Odwodnić próbkę w 100% acetonie przez 2 godziny dwukrotnie.
   1. Wyjmij próbkę z acetonu i obserwuj ją pod mikroskopem świetlnym, jak wysycha na powietrzu w temperaturze pokojowej. Przenieś próbkę do żywicy epoksydowej (patrz krok 3.4) tuż przed tym, jak zacznie się zwijać/zapadać.
      UWAGA: Usunięcie płynu z tkanek miękkich powoduje zapadnięcie się komórek i obkurczenie. Zrozumienie, kiedy dochodzi do zwijania/zapadania się tkanki, rozwija się wraz z doświadczeniem.
3. Przygotuj żywicę epoksydową klasy medycznej zgodnie ze wskazówkami producenta. Aby utwardzić żywicę, należy użyć temperatury 55 °C przez 1 godzinę lub 24 godziny w temperaturze pokojowej. Umieścić w komorze próżniowej na ~ 5 minut przy ~ 50 mbar w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Reguluj podciśnienie ręcznie, ponieważ nadmierna próżnia spowoduje wrzenie mieszanki epoksydowej, a odgazowanie nie nastąpi skutecznie
   UWAGA: Wykonaj krok 3.3 równolegle z krokiem 3.2.
4. Zanurz próbkę w przezroczystej żywicy epoksydowej. Zanurz tkankę oka w odgazowanej żywicy epoksydowej w odpowiednim zamykanym pojemniku i pozostaw O/N w temperaturze RT do utwardzenia.
5. Należy zwrócić uwagę, aby osadzić próbkę w żądanej orientacji (rysunek 2), zmieniając rozmiar i ponownie osadzając utwardzony blok epoksydowy. Ponownie osadź blok o zmienionym rozmiarze zawierający tkankę oka w taki sposób, aby długa oś przyczepności była zorientowana równolegle do dna formy (żółty kubek - rysunek 3A).
6. Zamontuj żywicę w uchwycie na próbkę do mielenia i zmiel próbkę (230 - 250 obr./min z włączoną wodą, mielenie ręczne) za pomocą papieru z węglika krzemu (zaczynając od siatki 800; Rysunki 3C i 3E).
7. W celu barwienia zanurz powierzchnię gruntu w barwie błękitu toluidynowego na 3-5 minut lub do momentu powstania plamy (ryc. 3F).
8. Spłucz wodą z kranu (Rysunek 3G).
9. Zobrazuj powierzchnię gruntu próbki za pomocą lunety do preparacji o dużej mocy, aby uwidocznić warstwy komórkowe siatkówki (ryc. 3H). Nałóż kroplę wody destylowanej na górną powierzchnię żywicy epoksydowej nad próbką, aby wygładzić dyfrakcję na granicy faz powietrze-żywica epoksydowa. Do oświetlenia próbki należy użyć światłowodowego źródła światła typu "gęsia szyja".
10. Powtórzyć kroki 3.6 – 3.9, za każdym razem szlifując wstępnie ustawioną grubość próbki (minimalny precyzyjny i powtarzalny przyrost mielenia uchwytu próbki wynosi 20 μm).

Results

Protokół fiksacji znacznie zmniejszył sztuczne oderwanie i rozwarstwienie siatkówki¹⁶. Orientacja próbki w bloku epoksydowym została osiągnięta w sposób spójny przy użyciu opisanego dwuetapowego procesu zatapiania. Procedura mielenia przyrostowego wymagała umiarkowanego poziomu zręczności manualnej w celu osiągnięcia optymalnych wyników, ale była wspomagana przez regulowany uchwyt próbki, który zapewniał precyzyjną kontrolę nad rozdzielczością przyrostu. We wszystkich przypadkach (n = 5) przyczepność została zlokalizowana i wypolerowana/wypolerowana z pożądanymi i spójnymi wynikami. Siatkówki przylegające do pinezek były rozpuszczalne i odpowiednio zabarwione. Polerowanie powierzchni bloku żywicy epoksydowej papierem z węglika krzemu klasy P#800 było wystarczające do zobrazowania makrostruktury komórkowej osadzonej tkanki. W razie potrzeby do dalszego polerowania powierzchni na dowolnej głębokości można użyć papieru wyższej jakości lub zawiesiny diamentowej. Stwierdzono, że mikroskop preparacyjny i źródło światła typu "gęsia szyja" ze światłowodu nadają się do obrazowania powierzchni bloku naziemnego i osadzonej próbki tkanki. Położenie źródła światła zmieniano metodą prób i błędów, aby znaleźć miejsce i kąt, które dawały najlepsze oświetlenie i kontrast pod mikroskopem. Dodanie kropli wody destylowanej do powierzchni bloku, powyżej próbki, było przydatne w celu zmniejszenia dyfrakcji ścieżki światła i/lub wygładzenia zniekształceń na granicy faz epoksydowo-powietrznych. Rysunek 4 przedstawia przykładowe obrazy tkanki siatkówki uwidocznionej bezpośrednio przy tytanowym przyklejeniu siatkówki przy użyciu tej techniki. Niesztuczne odwarstwienie i fałdowanie siatkówki można zobaczyć po obu stronach silikonu (ryc. 4A). Widoczny jest wałek sczepny zatopiony w silikonie; Głowa halsu przeniknęła do siatkówki i twardówki. W niezabarwionej siatkówce po obu stronach silikonu występuje niesztuczne odwarstwienie siatkówki (ryc. 4C). Technika wykazała, że w tym przypadku występuje dezorganizacja siatkówki przylegająca do przyczepności i ucisku siatkówki po jednej stronie z powodu ukośnego kąta wprowadzenia. Należy zauważyć, że przedstawione obrazy są jedynie ilustracjami sukcesu techniki, a nie reprezentatywnymi dla histopatologii uszkodzeń halsowych w ogóle.

Rysunek 1. Umieszczenie układu elektrod nasiatkówkowych.(A) Schematyczny schemat oka przedstawiający powiększony przekrój poprzeczny tylnej twardówki, naczyniówki i zdegenerowanej siatkówki (bez fotoreceptorów). Układ elektrod jest przedstawiony na niebiesko, przymocowany nasiatkówkowo. (B) Wspomagane komputerowo rysowanie układu elektrod nasiatkówkowych. a, układ scalony ("chip") i pakiet elektrod; b, tytanowa przyczepność siatkówki; c, obudowa silikonowa klasy medycznej; d, punkt wyjścia ołowiu. Panel A zmodyfikowany na podstawie oryginalnej ilustracji dostarczonej dzięki uprzejmości Bionic Vision Australia, prawa autorskie Beth Croce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Usunięcie elektrody i wypreparowanie oka. Zdjęcia makro o wysokim zakresie dynamiki wyłuszczonego oka kota z przyczepnością nasiatkówkową in situ. (A) Po utrwaleniu utrwalaczem Davidsona w celu zachowania architektury siatkówki¹⁶, wyłuszczone oko zostało wypreparowane. Pakiet matrycy elektrod został usunięty z silikonowego nośnika (przerywany kwadratowy kontur wskazuje na oryginalną lokalizację matrycy elektrod) z pozostałym przyczepem (strzałką) i silikonowym korpusem implantu. (B) Oko zostało wypreparowane z przekrojem podłużnym przylegającym do halsu (linia przerywana). Przyczepność pozostaje osadzona w tylnej ścianie muszli ocznej (strzałka), stabilizowana głównie przez twardówkę. Wycinek tkanki zawierający sczep przygotowano do zatapiania i rozdrabniania żywicy (prawy segment), natomiast wycinek zawierający siatkówkę pod usuniętym układem elektrod przygotowano do standardowej obróbki histologicznej¹⁶ (lewy segment). Linijka z odstępem co 0,5 mm jest pokazana na dolnej krawędzi każdego panelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Osadzanie żywicy epoksydowej i szlifowanie tkanki sczepnej i siatkówki. Fotografie próbki tkanki osadzonej w żywicy epoksydowej i wyrównanej, szlifowania, barwienia i obrazowania tkanki sczepnej i siatkówki. (A) Próbka sczepności została osadzona w bloku żywicy epoksydowej. Za pomocą formy próbka została zorientowana w taki sposób, aby płaszczyzna podłużna była równoległa do dna formy. (B) Utwardzony blok epoksydowy zawierający próbkę sczepiania się. (C) Blok epoksydowy został zamontowany w uchwycie na próbki do szlifowania, gotowy do szlifowania. (D) Próbka została zorientowana w taki sposób, aby zobrazowane odcinki tkanki naziemnej zawierały warstwy komórkowe siatkówki i oś podłużną halsyfikacji. (E) Próbka została zmielona przy użyciu papieru z węglika krzemu na szlifierce obrotowej. (F) Szlifowana powierzchnia bloku została zabarwiona błękitem toluidynowym w celu identyfikacji warstw siatkówki. (G) Blok został opłukany w wodzie z kranu w celu usunięcia nadmiaru plamy. (H) Warstwy siatkówki i przyczepność zabarwione na niebiesko toluidyną zostały zobrazowane za pomocą lunety sekcyjnej o dużej mocy.

Ryc. 4. Obrazy halsu i siatkówki o dużej i niskiej mocy. W różnych momentach procesu mielenia wykonano zdjęcia za pomocą lunety preparcyjnej, pokazując podłużne odcinki halsu (gwiazdka) przenikające przez oko i wychodzące z twardówki ("S"), przylegające silikon (haszysz) i toluidynę zabarwioną na niebiesko i niezabarwioną siatkówkę ("R"). Należy pamiętać, że są to przykładowe obrazy mające na celu jedynie zademonstrowanie obecnej techniki wizualizacji i nie są reprezentatywne dla wszystkich wyników histologicznych implantów nasiatkówkowych lub implantów typu tack. Pozostałości uziemienia okablowania platynowego są widoczne w panelach AD ("W"). (A) Niezabarwiony obraz halsu o małej mocy przenikającego siatkówkę i twardówkę. (B) Obraz o dużej mocy odwarstwienia i fałdowania siatkówki w niezabarwionej siatkówce przylegającej do nośnika silikonowego na zdjęciu A. (C) Obraz o niskiej mocy w środku wału sczepnego. (D) Obraz o dużej mocy środka sczepnego na rysunku C. (E) W oddzielnej próbce, bez nośnika silikonowego, pokazany jest obraz siatkówki zabarwionej na niebiesko toluidyną o dużej mocy pod rękojeścią sczepnej, bezpośrednio przed szlifowaniem wałka sczepnego. (F) Normalna architektura siatkówki zabarwiona na niebiesko toluidyną (GCL: warstwa komórek zwojowych siatkówki; INL: wewnętrzna warstwa jądrowa; ONL: zewnętrzna warstwa jądrowa; PR: fotoreceptory; T: kocia tapetum lucidum) zwizualizowana przy użyciu tej samej techniki szlifowania. Podziałki w każdym panelu to: A i C = 2 mm; B i D = 500 μm; E = 200 μm; F = 100 μm.

Discussion

Standardowe techniki histologiczne nie są w stanie przetwarzać implantów z twardego metalu in situ ze względu na ograniczenia w cięciu tych obiektów za pomocą ostrzy metalowych, szklanych, a nawet diamentowych. W naszym artykule^{towarzyszącym 16} wykazaliśmy, że zastosowanie zmodyfikowanej techniki fiksacji całego oka może zmniejszyć sztuczne rozwarstwienie siatkówki. W obecnym manuskrypcie uznana technika szlifowania i polerowania do wizualizacji implantów ślimakowych^21-23in situ została zmodyfikowana dla protez siatkówki. Tytanowa folia, używana do mocowania matrycy elektrod do siatkówki, nasiatkówkowo, została osadzona w żywicy epoksydowej wraz z otaczającą tkanką oka. Ten blok żywicy został następnie odpowiednio zorientowany i stopniowo szlifowany/polerowany, aby ujawnić morfologię tkanki bezpośrednio przylegającej do metalowej przyczepności. Zdjęcia wypolerowanej powierzchni bloku na różnych głębokościach zostały wykonane za pomocą potężnego mikroskopu preparacyjnego. Technika ta jest przydatna do: wizualizacji i oceny odpowiedzi tkanek sąsiadujących z implantem nasiatkówkowym; ocena urazu chirurgicznego związanego z implantacją implantu; określenie reakcji biologicznej na składniki z twardego metalu; oraz do pomiaru odległości między implantem a powierzchnią siatkówki.

Technika ta będzie przydatna w przyszłych badaniach bezpieczeństwa w zakresie wizualizacji in situ obszaru przylegającego do przyczepu siatkówki lub innych twardych (np . metalicznych) obiektów w oku. Ma to bezpośrednie zastosowanie w ocenie bezpieczeństwa przedklinicznego protez przyklejanych do siatkówki nasiatkówkowo. Może być również przydatny do oceny uszkodzeń tkanek w obszarach siatkówki stykających się z implantami znajdującymi się w lokalizacji podsiatkówkowej.

Istnieje kilka sposobów sprawdzenia, czy technika została wykonana poprawnie. Na każdym etapie siatkówka powinna pozostać przyczepiona do zewnętrznych warstw oka. Jeśli występuje duże sztuczne odwarstwienie siatkówki, może to wskazywać na problem z fiksacją. Gdy próbka jest osadzona i ponownie zorientowana w końcowym bloku żywicy, siatkówka powinna być zbliżona do prostopadłej powierzchni szlifierskiej bloku; Zminimalizuje to ukośne cięcie. Przydatne jest sprawdzenie, czy liczba stopniowych etapów szlifowania (o znanej wielkości kroku) wymaganych do przejścia przez obiekt (taki jak przyczepność siatkówki) jest odpowiednio skorelowana z wymiarami obiektu.

Technikę tę można zoptymalizować na kilka sposobów. Zarysowania na powierzchni bloku epoksydowego związane z procesem szlifowania można zredukować dzięki stopniowemu polerowaniu o coraz drobniejszym gatunku. Do niniejszego badania użyliśmy papieru z węglika krzemu klasy 800, 1000, 1200, 2400 i 4000. Pasta diamentowa może być również stosowana w celu poprawy wykończenia powierzchni. Drobniejsze wykończenie powierzchni zapewnia wyższą jakość obrazu, ale kosztem dodatkowego czasu polerowania. Innym krytycznym czynnikiem wpływającym na poprawę wyników tej techniki jest wybór i jakość optyki i oświetlenia użytego do uchwycenia obrazu. Inne podstawowe barwienia histologiczne – w szczególności barwienia Nissl – mogą być stosowane zamiast błękitu toluidynowego, ale mogą wymagać dalszej optymalizacji. Niektóre plamy plamią zarówno żywicę, jak i tkankę (np. Eozyna), dlatego po barwieniu może być wymagane płytkie polerowanie w celu usunięcia przebarwień tła. Nie próbowano stosować specjalistycznych barwień, barwników fluorescencyjnych i barwień immunohistochemicznych, ale jeśli nie jest pożądany bardzo konkretny wynik, czas potrzebny do wykonania tych barwień na każdym poziomie mielenia może być zaporowy. Możliwe jest jednak zabarwienie tkanki jako całości przed etapem zatapiania (etap 3.4)²⁴.

Głównym ograniczeniem tej techniki jest to, że po zeszlifowaniu obszaru zainteresowania nie można go odzyskać, dlatego rozsądnie jest uchwycić wiele (być może zbędnych) obrazów w różnych powiększeniach na każdym etapie szlifowania i polerowania. Ważne jest również, aby przy każdej regulacji głębokości szlifowania stosować małe przyrosty. Innym ograniczeniem tej techniki jest powiększenie optyczne i rozdzielczość w porównaniu z tkanką zamontowaną na szkiełku podstawowym i oglądaną za pomocą standardowego (transmisyjnego) mikroskopu świetlnego. Do celów prototypowania i oceny bezpieczeństwa nowatorskiego implantu pierwszorzędne znaczenie ma ogólna ocena patologiczna. Technika ta zapewnia skuteczną metodę obserwacji klinicznie istotnych uszkodzeń związanych z przyczepnością siatkówki. Przy nabraniu wprawy, całkowity czas potrzebny na zebranie, zmielenie, wypolerowanie i sfotografowanie danej próbki (raz osadzonej) jest porównywalny z czasem, jaki zajęłoby przecięcie bloku parafiny lub wycinka mrożonego.

Istnieje również możliwość rozszerzenia obecnych technik na zastosowania wykraczające poza zakres implantów siatkówki. Technika ta nadaje się do oceny tkanki przylegającej do twardego implantu, w przypadku gdy ekstrakcja implantu nie jest możliwa lub uszkodziłaby interfejs. Na przykład technika ta może zostać rozszerzona o ocenę implantów wykonanych z metalu (np. platyny, nitinolu itp.), których nie można przeciąć konwencjonalnymi technikami histologicznymi, takimi jak głębokie elektrody mózgowe lub nerwy obwodowe, kaniule do dostarczania leków, stenty naczyniowe lub protezy ortopedyczne.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aceton	Chem-Supply	AA008	Propanone BHD Klasa medyczna
Epo-Tek 301 Technologia	epoksydowo-epoksydowa	Część A 1675-54-3 Część B 9046-10-0
Etanol 70-75% v/v	Merck PTY LTD	4.10261	Alkohol
etylowy	Merck PTY LTD	90143	Alkohol
Toluidyna niebieska O	Sigma-Aldrich	T3260
Kwas etylenodiamino-tetraoctowy	Sigma-Aldrich
Maszyna do szlifowania/polerowania TegraPol	Struers	TegraPol-25
AccuStop	Mikroskop Struers	Accustop
Light	Obiektyw Leica	MZ16
Obiektyw	Leica	2.0x Planapo Obiektyw
Cyfrowy Mikroskop Fotograficzny	Leica	DFC-420C
	Leica	Pakiet aplikacji w wersji 4.1.0