Metody oceny cytotoksyczności i immunosupresji preparatów palnych wyrobów tytoniowych

Podsumowanie

Korzystając z zoptymalizowanych testów ex vivo ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), wykazaliśmy, że preparat palnego wyrobu tytoniowego wyraźnie hamuje wewnątrzkomórkowo wydzielane cytokiny za pośrednictwem receptorów i cytolityczną zdolność efektorowych PBMC. Te szybkie testy mogą być przydatne w ocenie produktu i zrozumieniu potencjalnych długoterminowych skutków narażenia na palenie tytoniu.

Streszczenie

Wśród innych zmian patofizjologicznych, przewlekłe narażenie na dym papierosowy powoduje stan zapalny i tłumienie odporności, co wiąże się ze zwiększoną podatnością palaczy na infekcje mikrobiologiczne i występowanie nowotworów. Supresja ex vivo odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem receptorów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) traktowanych składnikami dymu jest atrakcyjnym podejściem do badania mechanizmów i oceny prawdopodobnych długoterminowych skutków narażenia na wyroby tytoniowe. W tym miejscu zoptymalizowaliśmy metody wykonywania testów ex vivo przy użyciu PBMC stymulowanych przez bakteryjny lipopolisacharyd, ligand receptora Toll-podobnego-4. Badano wpływ pożywki kondycjonowanej dymem (WS-CM), preparatu palnego wyrobu tytoniowego (TPP) i nikotyny na wydzielanie cytokin i zabijanie komórek docelowych przez PBMC w testach ex vivo. Pokazujemy, że wydzielane cytokiny IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 i IL-8 oraz cytokiny wewnątrzkomórkowe IFN-γ, TNF-α i MIP-1α były tłumione w PBMC narażonych na WS-CM. Funkcja cytolityczna efektorowych PBMC, określona za pomocą testu zabijania komórek docelowych K562, została również zmniejszona przez ekspozycję na WS-CM; Nikotyna była minimalnie skuteczna w tych testach. Podsumowując, przedstawiamy zestaw ulepszonych testów do oceny skutków TPP w testach ex vivo, a metody te można łatwo zaadaptować do testowania innych interesujących produktów.

Wprowadzenie

Znaczna ilość wiedzy wskazuje na niekorzystne skutki zdrowotne przewlekłego palenia papierosów, w tym choroby układu krążenia (CVD), przewlekłą obturacyjną chorobę płuc (POChP) i raka^1,2. Wiadomo, że przewlekłe palenie papierosów powoduje stan zapalny i supresję immunologiczną, a zmiany te przyczyniają się do zwiększonego ryzyka infekcji bakteryjnych i raka u palaczy³. Techniki in vitro i ex vivo są przydatne w wyjaśnianiu molekularnych podstaw patofizjologicznych skutków dymu papierosowego^4-9 (Tabela 1) i są uznawane za ważne narzędzia do kierowania pojawiającymi się regulacjami dotyczącymi różnych wyrobów tytoniowych^10,11.

Na przykład, wykazaliśmy, że preparaty palnych wyrobów tytoniowych (TPP), takie jak całe medium kondycjonowane dymem (WS-CM) i całkowita ilość cząstek stałych (TPM) są znacznie bardziej cytotoksyczne i szkodliwe dla DNA niż niepalne TPP lub nikotyna^12,13. Zgodnie z opublikowaną pracą, niedawno doniesiono, że palne TPP lub nikotyna^12,13. Zgodnie z opublikowaną pracą, niedawno informowaliśmy, że palne TPP powodowały wyraźną immunosupresję. Zostało to udowodnione przez supresję ligandów receptora Toll-podobnego (TLR), stymulowanie wydzielania cytokin i celowane zabijanie komórek (K562) przez PBMC w modelu ex vivo ¹⁴. Biorąc pod uwagę znaczenie stanu zapalnego w procesach chorobowych wywołanych dymem papierosowym, w niniejszym raporcie przedstawiono dalszą optymalizację warunków testowych w celu oceny immunomodulacyjnego wpływu dymu papierosowego.

Testy ex vivo zazwyczaj mierzyły wewnątrzkomórkowe i wydzielane cytokiny, a także cytolityczną funkcję cytotoksycznych komórek T i NK w testach zabijania komórek K562¹⁴. Testy obejmowały wstępną inkubację z WS-CM i nikotyną, a następnie stymulację PBMC agonistami TLR przez okres 3 dni; końcowe odczyty wykonuje się za pomocą testów immunoenzymatycznych (ELISA) i/lub cytometrii przepływowej. Wykorzystano lipopolisacharyd bakteryjny (LPS), który wiąże się z receptorami TLR-4 i stymuluje PBMC, powodując produkcję cytokin wewnątrzkomórkowych i wydzielanie cytokin. Oprócz optymalizacji różnych etapów testów do oceny efektów immunomodulacyjnych TPP, przedstawiamy również metody izolacji PBMC, testów śmierci komórkowej i kwantyfikacji IL-8. Metody te mogą być stosowane w celu odpowiedzi na inne pytania badawcze i dalej udoskonalane w celu oceny wyrobów tytoniowych w kontekście regulacyjnym.

Tabela 1. Opublikowane doniesienia z badań nad metodami in vitro i ex vivo stosowanymi do badania patofizjologicznego działania preparatów wyrobów tytoniowych na varilus. CS, medium do dymu papierosowego; CSC, kondensat dymu papierosowego; CSE, ekstrakt dymu papierosowego; ELISA, test immunoenzymatyczny immunoenzymatyczny; GADPH, dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego; qPCR, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy; RT, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym; TS, dym tytoniowy.

Autor (rok studiów)	Laan i in. (2004)	Moodie i in. (2004)	Oltmanns i in. (2005)	Vayssier (1998)	Witherden i in. (2004)	Birrell i in. (2008)
Użyte ogniwa	Ludzkie komórki śródbłonka oskrzeli (BEAS-2B), ludzkie neutrofile	Ludzkie komórki nabłonka pęcherzyków płucnych (A549)	Ludzkie komórki mięśni gładkich dróg oddechowych (HASMC)	Ludzkie komórki premonocytarne U937, ludzkie monocyty	Komórki nabłonkowe pęcherzyków płucnych typu II (ATII)	Ludzka monocytowa linia komórkowa (THP-1), ludzkie makrofagi płucne
Używany TPP	Cse	Csc	Cse	Ts	Cse	Cs
Zastosowana metoda	ELISA, qPCR, migracja, zmiana elektromobilności	Immunohistochemia, elektroforeza, zestaw do skanowania, RT-PCR, ELISA	ELISA, RT-PCR, qPCR, elektroforeza	Zmiana mobilności żelu	Mikroskopia świetlna, mikroskopia elektronowa, elektroforeza, ELISA	qPCR, ELISA, zestaw E-toxate (Sigma), test płytki p65 (TransAM), elektroforeza, różne zestawy do testów immunologicznych
miara	IL-8, GM-CF, AP-1, NF-κB, migracja	Acetylotransferazy histonowe, deacetylazy histonowe, NF-κB, IL-8, p-I κB-α, GADPH	HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaksyna	Białka szoku cieplnego/stresu (HSP/Hsp70), czynnik transkrypcyjny HF, NF-κB, TNF-α	Białko powierzchniowo czynne (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ	IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, fosforylacja MAPK/JNK/ERK, wiązanie cJUN:DNA, glutation, p65:wiązanie DNA
Efekt końcowy	CSE obniża produkcję cytokin poprzez supresję aktywacji AP-1.	H2O2i CSC zwiększają acetylację białek histonowych, zmniejszają aktywność deacetylazy histonowej, różnicowo regulują uwalnianie cytokin prozapalnych.	Dym papierosowy może powodować uwalnianie IL-8 z HASMC, wzmocnione przez TNF-α, 20% CSE mniej uwalniania IL-8, hamowanie eotaksyny i RANTES przez dym papierosowy.	Czynnik transkrypcyjny HF aktywowany przez TS, który był związany z nadekspresją Hsp70 i hamowaniem aktywności wiązania NFkB oraz uwalnianiem TNF-α.	Obniżony poziom chemokiny pochodzącej z komórek ATII upośledza naprawę pęcherzyków płucnych, przyczyniając się do uszkodzenia pęcherzyków płucnych wywołanego dymem papierosowym i rozedmy płuc.	Dane dostarczają mechanistycznego wyjaśnienia, dlaczego palacze mają zwiększoną liczbę infekcji dróg oddechowych. Tłumieniu odpowiedzi wrodzonej towarzyszy wzrost IL-8.

Protokół

UWAGA: Pisemna świadoma zgoda na przeprowadzenie tego badania została uzyskana w lokalnej jednostce badań klinicznych na podstawie zatwierdzenia IRB, zgodnie z Dobrymi Praktykami Klinicznymi. Przetwarzanie krwi, izolacja PBMC i inne eksperymenty z hodowlami komórkowymi są przeprowadzane w sterylnych warunkach, przy użyciu sterylnych mikrobiologicznie materiałów i odczynników.

1. Przygotowanie do WS-CM

1. Wygeneruj WS-CM zgodnie z wcześniejszym opisem¹².
   1. Przygotuj WS-CM, przepuszczając dym z czterech papierosów referencyjnych 3R4F przez podłoże Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 bez czerwieni fenolowej, stosując następujący schemat palenia: odpowiednio 35-60-2, objętość zaciągnięcia w ml, odstęp między zaciągnięciami w sekundach i czas zaciągnięcia w sekundach. Z każdego preparatu pobierana jest próbka o objętości 20 ml.
2. Oznacz rurkę (tuby) datą, godziną zakończenia oraz nazwą i numerem papierosa. Przechowywać 500 μl porcji w temperaturze -80 °C natychmiast po zakończeniu wędzenia.
3. Przeanalizuj podwielokrotności zamrożonego WS-CM, aby określić poziomy nikotyny, nitrozoamin specyficznych dla tytoniu i wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, jak opisano wcześniej¹².

2. Izolacja PBMC

1. Pobranie świeżej krwi od zdrowych dawców (którzy nie są konsumentami wyrobów tytoniowych) Odizoluj PBMC od świeżej krwi, jak opisano poniżej, na podstawie oddzielnego zezwolenia Wake Forest Baptist Health IRB¹⁵.
   1. Przed przybyciem worka na krew należy przygotować butelkę o pojemności 500 ml, nożyczki, bufor izolacyjny i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) (RT) firmy Dulbecco w kapturze do hodowli komórkowych na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Bufor izolacyjny musi być chroniony przed światłem.
   2. Trzymaj worek na krew do góry nogami i przetnij rurkę tuż poniżej miejsca, w którym została zaciśnięta, pozostawiając co najmniej 3 cm rurki.
   3. Zdjąć nakrętkę z butelki o pojemności 500 ml i przytrzymać probówkę nad otworem butelki. Podnieś worek na krew i odwróć go, aby krew mogła swobodnie przepływać z worka do butelki, aż worek będzie pusty. Pozwól, aby krew spłynęła na wewnętrzną ściankę butelki, a nie prosto w dół, aby uniknąć tworzenia pęcherzyków.
   4. Wlać bufor izolacyjny do butelki w stosunku 1:5 buforu izolacyjnego do krwi. Szczelnie zakręć butelkę i delikatnie odwróć ją od końca do końca, 10 razy. Pozostawić butelkę w kapturze do hodowli komórkowej do inkubacji przy wyłączonym świetle, na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   5. Nad krwią utworzy się jasna, słomkowa warstwa. Usunąć tę warstwę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Pobrana ilość może wahać się od 50 do 300 ml, w zależności od osoby, która oddała krew.
   6. Odwirować probówki o sile 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   7. Odessać półprzezroczysty supernatant, pozostawiając ciemny krwisty granul. Granulka będzie luźna, ale lepka.
   8. Odpipetować 3 ml buforu izolacyjnego do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
   9. Do osadu zawiesinowego dodać 20 ml DPBS na każde 50 ml płynu o barwie słomkowej zebranej w kroku 2.1.5. Wirować, aby dokładnie wymieszać i skonsolidować zawieszoną ciecz z wielu probówek. Ten płyn zawiera zawieszone krwinki.
   10. Za pomocą pipety do przenoszenia przenieść 5 ml zawieszonych krwinek na 3 ml buforu izolacyjnego zgodnie z krokiem 2.1.8. Powoli i delikatnie przechylić stożkową probówkę o pojemności 15 ml, która zawiera zawiesinę komórek, aby utworzyć dwie oddzielne warstwy. Wirować probówki o sile 400 x g przez 40 minut przy temperaturze pokojowej przy minimalnym przyspieszeniu i bez hamulca.
   11. Za pomocą pipety transferowej usunąć powstałą mętną warstwę środkową (kożuchową powłokę) zawierającą PBMC do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Unikaj rysowania innych przezroczystych warstw pod nim. Przenieść nie więcej niż 25 ml do każdej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
   12. Dodać 25 ml buforu do pracy na zimno (lub więcej, aby wypełnić całą pozostałą objętość stożkowej probówki o pojemności 50 ml) w celu przemycia komórek. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   13. Zawiesić osad za pomocą 10 ml buforu bieżącego. Zawiera PBMCs. Policz komórki i użyj natychmiast lub umieść na lodzie do zamrożenia.

3. Zamrażanie i rozmrażanie PBMC

1. Odwirować PBMC zebrane w kroku 2.1.13 przez 10 minut przy 400 x g.
2. Napełnij pojemnik do zamrażania alkoholem izopropylowym zgodnie z instrukcjami producenta. UWAGA: Alkohol izopropylowy jest łatwopalny i silnie toksyczny.
3. Zawiesić osad za pomocą pożywki RPMI 1640 (4 °C) zawierającej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Jest to medium zamrażające RPMI 1640. Zawiesić osad z taką ilością pożywki do zamrażania, że w wyniku zawiesiny będzie miała około 5 x 10⁷ komórek/ml. Liczba komórek dostępnych do zamrożenia będzie się różnić.
4. Dozować 1 ml porcji zawiesiny komórkowej do 2 ml krioprobówek i umieścić krioprobówki w pojemniku do zamrażania. Umieścić pojemnik do zamrażania z krioprobówkami w zamrażarce w temperaturze -80 °C w celu przechowywania O/N, a następnie wyjąć krioprobówki i przenieść do przechowywania w zamrażarce kriogenicznej w temperaturze od -150 °C do -190 °C.
5. Wyjąć krioprobówkę z magazynu kriogenicznego i szybko ją rozmrozić, delikatnie mieszając, w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
6. Natychmiast przenieś rozmrożone PBMC w krioprobówce do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 10 ml RPMI 1640 kompletnej pożywki (4 °C) zawierającej 10% FBS, 1% Pen/Strep i 1% L-glutaminy. Zawartość rozmrożonej krioprobówki należy przenieść tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać maksymalną żywotność komórek¹⁵.
7. Odwirować PBMC przy 400 x g przez 10 minut.
8. Zawiesić osad za pomocą 5 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 i policzyć komórki.
9. Zmierz żywotność komórek za pomocą ustalonych metod, takich jak metoda wykluczania błękitu trypanowego. Generalnie żywotność komórek tą metodą wynosi około 90 - 95%. PBMC są teraz gotowe do użycia w eksperymentach.

4. Determinacja śmierci komórki

UWAGA: Podane tutaj rozcieńczenia służą do celów tego badania. Rozcieńczenia można odpowiednio zmienić.

1. Rozcieńczyć WS-CM lub nikotynę w 96-dołkowej płytce za pomocą kompletnego podłoża RPMI do całkowitej objętości 100 μl/dołek, jak wskazano poniżej.
2. Rozcieńczyć WS-CM do następujących stężeń: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 i 5 μg/ml jednostek ekwitotynowych nikotyny (w oparciu o zawartość nikotyny w WS-CM)¹².
3. Rozcieńczyć nikotynę w pożywce RPMI do następujących stężeń: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 i 3000 μg/ml. UWAGA: Nikotyna jest bardzo toksyczna i niebezpieczna dla środowiska.
4. Dodać 100 μl PBMC zawieszonych w kompletnym pożywce RPMI do każdej studzienki w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/studzienkę. Całkowita objętość komórek plus WS-CM lub nikotyna wyniesie 200 μl/studzienkę.
5. Na potrzeby tego opracowania przygotuj dwa zestawy płytek jak wyżej. Przykryć płytki i inkubować jedną płytkę przez 24 godziny, a jedną płytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . W razie potrzeby dostosuj punkty czasowe.
6. Przemyć komórki w temperaturze pokojowej przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty, zasysanie supernatantu, wirowanie dna płytki z płytką pokrytą, a na koniec ponowne zawieszenie komórek za pomocą 200 μl lodowatego buforu i powtórzyć etap płukania jeszcze raz.
7. Dodać 95 μl buforu do pracy, a następnie 5 μl 7-aminoaktynomycyny D (7AAD) do każdego dołka, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl/basenik. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
8. Dodać 100 μl działającego buforu do probówek zbiorczych. Przenieść całą objętość zawiesiny komórek z każdej studzienki płytki do probówek zbiorczych i pobrać próbki na cytometrze przepływowym.
9. Określ procent komórek 7AAD-dodatnich za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.

5. Oznaczanie EC₅₀

1. Wartości EC₅₀ WS-CM i nikotyny są określane przez barwienie PBMC z dodatnim wynikiem 7AAD.
2. Wartość EC₅₀ definiuje się jako stężenie, przy którym 50% komórek nie było już zdolnych do życia w 24-godzinnym teście, a wartości są wyrażone jako μg jednostek ekwitotynowych/ml.
3. Na potrzeby tego badania wartości EC₅₀ określono na 1,56 μg/ml i 1,650 μg/ml odpowiednio dla WS-CM i nikotyny.

6. Wydzielane cytokiny

UWAGA: Podane tutaj rozcieńczenia służą do celów tego badania. Rozcieńczenia można odpowiednio dostosować.

1. Rozcieńczyć WS-CM w 96-dołkowej płytce za pomocą kompletnej pożywki RPMI do całkowitej objętości 100 μl/studzienkę przy stężeniu 0,3, 1,56, 3 i 5 μg/ml jednostek ekwitonikotyny.
2. Rozcieńczyć nikotynę do stężeń: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 i 3000 μg/ml. UWAGA: Nikotyna jest bardzo toksyczna i niebezpieczna dla środowiska.
3. Dodać 100 μl PBMC zawieszonych w kompletnym pożywce RPMI do każdej studzienki w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/studzienkę. Całkowita objętość komórek plus WS-CM lub nikotyna wyniesie 200 μl/studzienkę.
4. Przykryć płytkę i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
5. Umyć komórki w temperaturze pokojowej przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty, zasysanie supernatantu, wirowanie dna płytki z płytką pokrytą, a na koniec zawieszenie komórek z 200 μl lodowatego buforu i powtórzenie etapu przemywania jeszcze raz.
6. Dodać 200 μl kompletnego podłoża RPMI i powtórzyć etap prania jeszcze raz.
7. Do każdego dołka dodać 200 μl pożywki o stężeniu 10 μg/ml LPS.
8. Przykryć płytkę i inkubować przez 4 godziny, 24 godziny, 48 godzin lub 72 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . W razie potrzeby dostosuj czasy inkubacji.
9. Odwirować płytkę o masie 300 × g przez 3 minuty.
10. Pobrać 175 μl supernatantu z każdej studzienki i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C w celu przeprowadzenia testów w krokach 7 i 8.

7. Test cytometryczny z matrycą kulek

1. Rozmrozić supernatanty komórkowe przygotowane z kroku 6.10 i użyć w teście CBA. Wykonaj test cytometrycznej matrycy kulkowej (CBA) zgodnie z instrukcjami producenta.

8. Test ELISA IL-8

1. Rozmrozić supernatanty komórkowe z kroku 6.10 i użyć w teście IL-8 ELISA. Wykonaj test ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.

9. Barwienie wewnątrzkomórkowe i cytometria przepływowa

UWAGA: Podane tutaj rozcieńczenia służą do celów tego badania. Rozcieńczenia można odpowiednio dostosować.

1. Rozcieńczyć WS-CM w 96-dołkowej płytce za pomocą kompletnej pożywki RPMI do całkowitej objętości 100 μl/studzienkę przy stężeniu 0,3, 1,56, 3 i 5 μg/ml jednostek ekwitonikotyny.
2. Na tej samej płytce rozcieńczyć nikotynę do następujących stężeń: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 i 4000 μg/ml. UWAGA: Nikotyna jest bardzo toksyczna i niebezpieczna dla środowiska.
3. Dodać 100 μl PBMC zawieszonych w kompletnym pożywce RPMI o stężeniu 1 ×^{10 6} komórek/basenik. Całkowita objętość komórek plus WS-CM lub nikotyna wyniesie 200 μl/studzienkę.
4. Przykryć płytkę i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
5. Przemyć komórki w temperaturze pokojowej przez odwirowanie w temperaturze 300 × g przez 3 minuty, zasysanie supernatantu, wirowanie dna płytki z płytką pokrytą, a na koniec ponowne zawieszenie komórek za pomocą 200 μl lodowatego buforu i powtórzyć etap mycia jeszcze raz.
6. Dodać 200 μl kompletnego podłoża RPMI na płytkę i powtórzyć etap mycia jeszcze raz.
7. Przygotować stężenia robocze 2 μl/ml GolgiPlug i 10 μg/ml LPS przy użyciu kompletnego podłoża RPMI i dodać 200 μl do każdej studzienki.
8. Inkubować płytkę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
9. Pod koniec kroku 9.8 przemyć komórki buforem (4 °C) i wirować w temperaturze 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
10. Dodać 100 μl Cytofix do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
11. Umyj komórki 3 razy, jak opisano w kroku 9.9, za pomocą 1x Permwash (4 °C) w temperaturze 300 x g przez 3 minuty w 4 °C.
12. Dodaj 45 μl 1x Cytoperm do każdej studzienki, a następnie 5 μl każdego z następujących przeciwciał do każdej studzienki: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
13. Przemyć komórki dwa razy, jak opisano w kroku 9.9, 1x Permwash (4 °C) i jeden raz z buforem (4 °C) przy 300 x g przez 3 minuty w 4 °C.
14. Zawiesić komórki za pomocą 200 μl 2% paraformaldehydu (4 °C). Przenieś komórki do probówek o średnicy 12 × 75 mm i przeanalizuj próbki na cytometrze przepływowym. UWAGA: Paraformaldehyd jest, silnie toksyczny i stanowi zagrożenie dla zdrowia.

10. Test zabijania K562

UWAGA: Komórki K562 powinny być hodowane w kulturze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ z kompletną pożywką RPMI, aż osiągną 80% konfluencji przed testem.

1. Przygotować 5 mM roztwór podstawowy estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE), dodając do fiolki 18 μl DMSO.
2. Rozcieńczyć WS-CM lub nikotynę w 96-dołkowej płytce za pomocą kompletnej pożywki RPMI do całkowitej objętości 100 μl/studzienkę, aby osiągnąć pożądane jednostki ekwitozyny lub stężenia nikotyny dla każdej studzienki. UWAGA: Nikotyna jest bardzo toksyczna i niebezpieczna dla środowiska.
3. Dodać 100 μl PBMC do kompletnej pożywki RPMI o stężeniu 1,5 x 10⁶ komórek/dołek. Całkowita objętość komórek z WS-CM lub nikotyną wyniesie 200 μl/studzienkę.
4. Przykryć płytkę i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
5. Przemyć komórki K562 dodając 10 ml DPBS i odwirować przy 400 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
6. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml DPBS i policzyć komórki K562.
7. Przygotować roztwór roboczy CFSE, dodając 1 μl roztworu podstawowego CFSE do 1 ml DPBS.
8. Dodać 1 ml roztworu roboczego CFSE do 1 ml zawiesiny komórek K562 zawierającej 1-2 x^10,7 komórek. Wirować i inkubować dokładnie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
9. Natychmiast dodaj 200 μl FBS. Wirować i inkubować dokładnie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
10. Dodać 10 ml kompletnej pożywki RPMI i odwirować probówkę o sile 400 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
11. Usunąć supernatant RPMI, rozbić osad i ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 ml kompletnej pożywki RPMI i policzyć komórki K562 znakowane CFSE.
12. Przemyć PBMC przez odwirowanie płytki o sile 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant przez dekantację cieczy. Załóż pokrywę i przekręć spód płyty. Dodać 200 μl pożywki RPMI complete i powtórzyć etap prania jeszcze raz.
13. Dodać komórki K562 znakowane CFSE w stosunku 1:15 (100 000 K562s: 1,5 x 10⁶ PBMC) do każdej studzienki próbki na płytce PBMC i dalej inkubować przez 5 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
14. Przemyć mieszaninę komórek przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant odrzucając płyn. Załóż pokrywę i przekręć spód talerza.
15. Dodać 200 μl bieżącego buforu i powtórzyć etap płukania opisany w kroku 10.14 jeszcze raz.
16. Dodać 95 μl buforu bieżącego, a następnie 5 μl 7AAD do każdego dołka, aby uzyskać całkowitą objętość 100 μl/studzienkę. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
17. Dodać 100 μl buforu do każdej studzienki i przenieść całą objętość zawiesiny komórek z każdej studzienki płytki do probówek zbiorczych i pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego.
18. Określ procent komórek 7AAD-dodatnich i CFSE za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.

Wyniki

Wyniki zostały przedstawione jako średnia ± błąd standardowy średniej (cztery próbki dawców). Test t studenta między próbkami kontrolnymi poddanymi działaniu substancji i niepoddanymi działaniu substancji przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Excel, a także porównania testu t dla wszystkich zabiegów z odpowiadającymi im kontrolami. Na istotność statystyczną wskazywano: *, P < 0,05; **, P < 0,005; , P < 0,0005.

Aby zmierzyć efekt ekspozycji na WS-CM i nikotynę, PBMC były traktowane...

Dyskusja

My i inni wykazaliśmy wcześniej, że leczenie PBMC TPP hamuje kilka reakcji, w tym ekspresję i wydzielanie cytokin oraz środki funkcjonalne, takie jak zabijanie komórek docelowych¹⁴. Metody eksperymentalne opisane w poprzedniej pracy wymagają dłuższych okresów inkubacji i były skromne pod względem^{wielkości 14}. Biorąc pod uwagę potencjalne zastosowania tego atrakcyjnego modelu ex vivo do badań podstawowych i stosowanych, zbadaliśmy, czy którykolwiek z parametrów testowych w tych wieloetapowyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki 12 x 75 mm	BD Falcon	352058
Probówki stożkowe 15 ml	Corning	430790
Mikroprobówki 2 ml	Axygen	MCT-150-C-S
3R4F papierosy referencyjne	Univ. of Kentucky, College of Agriculture	3R4F
Probówki stożkowe 50 ml	Corning	430828
butelka	500 mlCorning	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
96-dołkowa płaska płyta dolna	Termo Nunc	439454
96-dołkowe okrągłe płytki denne	BD Falcon	353077
Kaptur do hodowli komórkowych	Thermo Scientific	1300 Series A2
Eppendorf	58110R
CFSE	Sondy molekularne Life Technologies	C34554
Probówki klastrowe	Corning	4401	Szkodliwy po połknięciu, rakotwórczy
Cytofix/Cytoperm (Permwash)	BD Biosciences	555028	Łatwopalny
DMSO (dimetylosulfotlenek )	Sigma-Aldrich	D8418
DPBS	Lonza	17-512F
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
FCAP Array	BD Biosciences	652099	Software analizuje dane CBA
Jednostka filtrująca	Nalgene	156-4020
Cytometr przepływowy	BD Biosciences	FACS Canto II	8 kolorów, przy Ex 405 i Em 785.
Cytometr przepływowy	BD Biosciences	FACS Calibur	4 kolory w Ex 495 i Em 785.
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej	Tree Star	FlowJo
Pojemnik do zamrażania	Nalgene	5100-0001	Zawiera DMSO, drażniący
GogliPlug	BD Biosciences	555029	Rakotwórczy, drażniący,
H2SO4	Sigma-Aldrich	339741
Zestaw	ludzkich cytokin zapalnychBD Nauki biologiczne	551811
IFN-γ V-500 Przeciwciało	BD Horizon	561980	Działacz uczulający na skórę
IL-8 Zestaw ELISA Systemy	R i D	Bufor izolacyjny DY208
	Isolymph, CTL Scientific Corp.	1114868	Łatwopalna ciecz, drażniąca
Alkohol izopropylowy	Sigma-Aldrich	W292907
L-Glutamina	Gibco Life Technologies	25030-081
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
MIP1-α Przeciwciało PE	BD Pharmingen	554730	Ostra toksyczność, doustnie
Monensin	Sigma-Aldrich	M5273
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Nikotyna	Sigma-Aldrich	N3876	Ostra toksyczność, zagrożenie dla środowiska
Parafilm	Bemis	" M"
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Łatwopalny, drażniący skórę
Pióro/paciorkowiec	Gibco Life Technologies	15140-122
RPMI 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Bufor do biegania	MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech	130-091-221
Th1/Th2 CBA Kit	BD Biosciences	551809
TNF-&alfa; Przeciwciało Alexa Fluor 488	BioLegend	502915
Pipeta transferowa	Fisher Scientific	13-711-20
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503