Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Podsumowanie

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Streszczenie

Produkcja rekombinowanych białek błonowych do badań strukturalnych i funkcjonalnych pozostaje technicznie trudna ze względu na niski poziom ekspresji i nieodłączną niestabilność wielu białek błonowych po rozpuszczeniu w detergentach. Opisano protokół, który łączy klonowanie białek błonowych niezależne od ligacji jako fuzje GFP z ekspresją w Escherichia coli wykrywaną przez fluorescencję GFP. Umożliwia to konstruowanie i badanie przesiewowe ekspresji wielu białek/wariantów błonowych w celu zidentyfikowania kandydatów odpowiednich do dalszej inwestycji czasu i wysiłku. Reporter GFP jest używany w pierwotnym ekranie ekspresji poprzez wizualizację fluorescencji GFP po elektroforezie w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE). Białka błonowe, które wykazują zarówno wysoki poziom ekspresji, jak i minimalną degradację, na co wskazuje brak wolnego GFP, są wybierane do wtórnego badania przesiewowego. Konstrukty te są skalowane, a całkowita frakcja membranowa jest przygotowywana i rozpuszczana w czterech różnych detergentach. Po ultrawirowaniu w celu usunięcia materiału nierozpuszczalnego w detergentach, lizaty są analizowane za pomocą chromatografii wykluczającej z detekcji fluorescencji (FSEC). Monitorowanie profilu wykluczania wielkości za pomocą fluorescencji GFP dostarcza informacji na temat monodyspersyjności i integralności białek błonowych w różnych detergentach. Białko: kombinacje detergentów, które eluują się z symetrycznym pikiem z niewielką ilością wolnego GFP lub bez wolnego GFP i minimalną agregacją, są kandydatami do późniejszego oczyszczania. Korzystając z powyższej metodologii, przeanalizowano heterologiczną ekspresję białek SED (kształt, wydłużenie, podział i zarodnikowanie) w E. coli z 47 różnych gatunków bakterii. Białka te mają zazwyczaj dziesięć domen transbłonowych i są niezbędne do podziału komórek. Wyniki pokazują, że produkcja ortologów SED u E. coli była bardzo zmienna w odniesieniu do poziomów ekspresji i integralności białek fuzyjnych GFP. W eksperymencie zidentyfikowano podzbiór do dalszych badań.

Wprowadzenie

Oszacowano, że białka błonowe stanowią około 20-30% genów kodowanych we wszystkich sekwencjonowanych genomach ¹, w tym w genomie ludzkim ². Biorąc pod uwagę ich kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, na przykład w transporcie metabolitów, wytwarzaniu energii i jako cele leków, istnieje duże zainteresowanie określeniem ich trójwymiarowej struktury. Jednak w porównaniu z białkami rozpuszczalnymi, białka błonowe są bardzo niedostatecznie reprezentowane w Banku Danych o Białkach. W rzeczywistości z 99 624 uwolnionych struktur w PDB (http://www.rcsb.org/pdb/) tylko 471 (http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/) jest sklasyfikowanych jako białka błonowe. Odzwierciedla to trudności techniczne związane z pracą z białkami błonowymi, które naturalnie ulegają ekspresji na stosunkowo niskich poziomach; Rodopsyna jest jednym z nielicznych wyjątków^3,4. Nadmierna ekspresja wersji rekombinowanych w komórkach heterologicznych często powoduje nieprawidłowe fałdowanie i słabe ukierunkowanie na błonę, co ogranicza ogólny poziom produkcji. Wybór najlepszego detergentu do ekstrakcji i solubilizacji białka błonowego po ekspresji utrudnia późniejsze oczyszczanie i wymaga starannej optymalizacji.

Escherichia coli pozostaje najczęściej używanym gospodarzem ekspresji dla białek błonowych, stanowiąc 72% (http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/) struktur rozwiązanych do tej pory, które pochodzą prawie wyłącznie ze źródeł bakteryjnych. Wyizolowano specyficzne szczepy E. coli, C41(DE3) i C43(DE3), które nie prowadzą do nadmiernej ekspresji białek błonowych, a tym samym pozwalają uniknąć skutków toksyczności obserwowanych dla innych szczepów BL21^5,6. Dostrojenie poziomu ekspresji rekombinowanych białek błonowych wydaje się mieć kluczowe znaczenie dla optymalizacji poziomu produkcji^6,7.

W wielu przypadkach udana produkcja białek błonowych do określenia struktury wymagała oceny wielu wersji, w tym delecji amino- i karboksylowo-końcowych, wielu ortologów w celu wykorzystania naturalnej zmienności sekwencji i różnych białek fuzyjnych^6-8. Dlatego niezbędna jest metoda badania przesiewowego ekspresji wielu białek błonowych równolegle. Jednym z powszechnie stosowanych podejść jest fuzja białka z białkiem zielonej fluorescencji (GFP), co umożliwia śledzenie ekspresji bez konieczności oczyszczania białka. W ten sposób informacje o poziomie ekspresji, stabilności i zachowaniu w różnych detergentach można ocenić przy użyciu niewielkich ilości nieoczyszczonego materiału^9-12.

W tym artykule opisujemy uproszczony protokół klonowania i badania przesiewowego ekspresji białek błonowych u E. coli, wykorzystując fuzję do GFP jako raportowanie produkcji i późniejszą charakterystykę kompleksów detergent: białkowe (Rysunek 1).

Protokół

1. Budowa wektorów wyrażeń

1. Użyj klonowania infuzji PCR, aby skonstruować do 96 plazmidów ekspresyjnych równolegle przy użyciu wektorów pOPINE-3C-GFP i pOPIN-N-GFP, które dodają rozszczepialne fuzje C-końcowe lub N-końcowe GFP-His6 do sekwencji^{odpowiednio 13}.
   nuta: Wybór wektora jest podyktowany topologią białka, ponieważ GFP musi być wyrażony w cytozolu, a zatem dla białka z cytozolowym N-końcem i zewnątrzkomórkowym C-końcem użylibyśmy pOPIN-N-GFP, a dla zewnątrzkomórkowego N-końca i cytozolowego C-końca w użyjemy pOPINE-3C-GFP. Tam, gdzie oba końce są cytozolowe, użyjemy pOPINE-3C-GFP, chyba że istnieje funkcjonalny powód, aby nie oznaczać C-końca.
2. Amplifikować sekwencje DNA kodujące białka błonowe za pomocą starterów zawierających następujące pokazane rozszerzenia:
   pOPINE-3C-GFP (Starter do przodu — AGGAGATATACCATG; Starter odwrotny — CAGAACTTCCAGTTT) i pOPIN-N-GFP (Starter do przodu — AAGTTCTTTTTCAGGGCCCG; Reverse primer — ATGGTCTAGAAAGCTTTA).
3. Przeanalizuj reakcję PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Po otrzymaniu czystych produktów PCR dodać 5 U DpnI do każdego dołka (uzupełnić w 5 μl 1x buforu reakcyjnego DpnI). Oczyść produkty PCR za pomocą kulek magnetycznych w formacie 96-dołkowym.
   nuta: DpnI jest dodawany w celu usunięcia wektora szablonu; ten krok nie jest konieczny, jeśli genomowe DNA jest używane jako matryca.
4. Dodać 1 μl (100 ng) odpowiedniego wektora linearyzowanego do każdego dołka płytki PCR.
5. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać x μl oczyszczonej wkładki PCR do odpowiednich dołków płytki PCR. Upewnij się, że wszystkie produkty mieszczą się w zakresie 10-250 ng.
6. Dodać (9 x) μl wody do studzienki i przenieść całe 10 μl do probówki zawierającej suchy odczynnik fuzyjny. Pozostaw na 30 sekund.
7. Krótko wymieszać zawartość, pipetując w górę i w dół. Przenieś reakcje z powrotem na oryginalną płytkę PCR i zapieczętuj.
8. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 42 °C w termocyklerze.
9. Natychmiast po zakończeniu reakcji przenieść reakcje na lód i dodać 40 μl TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).
10. Zamroź od razu lub przekształć się w kompetentne komórki. Do przemiany należy użyć 3 μl rozcieńczonej reakcji na 50 μl podwielokrotności kompetentnych komórek E. coli o wysokiej kompetencji (> 5 x 10⁹ transformantów/μg).
11. Dodać 1 ml agaru LB uzupełnionego 50 μg/ml karbenicyliny na studzienkę 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (do klonowania należy przygotować studzienki na 2 x więcej konstruktów).
12. Po wyrośnięciu, Po wyroście z płytki 25 μl i 25 μl rozcieńczenia kultury 1:5 na agar zawierający 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych.
13. Rozłóż komórki, delikatnie przechylając płytkę.
14. Suszyć płytkę ze zdjętą pokrywką przez 10-15 minut w temperaturze 37 °C lub w okapie przepływowym w temperaturze pokojowej.
15. Założyć pokrywkę, obrócić płytkę do góry nogami i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
16. Wybierz dwie kolonie i przygotuj wektory w mini.
17. PCR weryfikuje konstrukty przy użyciu specyficznego dla konstruktu startera odwrotnego i startera do przodu specyficznego dla wektora (np. pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG).

2. Transformacja szczepów E. coli Expression

Uwaga: Przed wykonaniem tego protokołu, kompetentne komórki E. coli są tworzone, porcjowane i przechowywane w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C, jak opisano wcześniej¹³. Ekspresja białek błonowych jest rutynowo badana przesiewowo w dwóch szczepach, Lemo21(DE3) i C41(DE3)pLysS. Aby ułatwić interpretację wyników, pomocne może być uwzględnienie kontroli pozytywnej, np. plazmidu wykazującego ekspresję GFP lub białka błonowego połączonego z GFP, o którym wiadomo, że ulega ekspresji, oraz kontroli ujemnej pustego wektora.

1. Rozmrozić porcjowaną E. coli na lodzie. Dodać 3 μl mini-przygotowanego plazmidu ekspresyjnego do każdej podwielokrotności kompetentnych komórek.
2. Inkubować mieszankę na lodzie przez 30 minut.
3. Szok termiczny ogniw przez 30 sekund w temperaturze 42 °C.
4. Pozwól komórkom zregenerować się na lodzie przez 2 minuty, a następnie dodaj 300 μl bulionu do każdej probówki.
5. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze statycznym o temperaturze 37 °C.
6. Przygotować agar LB na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, uzupełnionej 50 μg/ml karbenicyliny i 35 μg/ml chloramfenikolu. Dodać ramnozę do końcowego stężenia 0,25 mM do studzienek zawierających Lemo21 (DE3).
   nuta: Jeśli istnieje prawdopodobieństwo, że produkt jest toksyczny, studzienki zawierające pLysS C41(DE3) można uzupełnić 1% (w/v) glukozy.
7. Przenieść 30 μl komórek z mieszanki transformacyjnej na płytki agarowe LB. Rozprowadzić i osuszyć płytkę zgodnie z opisem w 1.13-1.15.

3. Przygotowanie kultur starterowych na noc

Uwaga: Zawsze przygotowuj kultury na noc dzień po transformacji, nigdy ze starej płytki transformacji.

1. Dodać 0,7 ml bulionu energetycznego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki głębokiej uzupełnionej 50 μg/ml karbenicyliny i 35 μg/ml chloramfenikolu. Dodać ramnozę do studzienek zawierających Lemo21 (DE3) do końcowego stężenia 0,25 mM. Opcjonalnie uzupełnij C41(DE3) pLysS o 1% (w/v) glukozy; Patrz wyżej (uwaga 2.6).
2. Wybierz jedną kolonię z płytek transformacyjnych przez noc do każdej studzienki. Uszczelnij blok uszczelką przepuszczającą gaz.
3. Wytrząsać blok z prędkością 250 obr./min w inkubatorze o dużym wyrzucie (np. orbita 25 mm) lub przy prędkości 600 obr./min w inkubatorze o małym wyrzucie (np. orbita 4,3 mm) w temperaturze 37 °C przez noc.

4. Wzrost i indukcja kultur

1. Dodać 3 ml bulionu energetycznego uzupełnionego 50 μg/ml karbenicyliny i 35 μg/ml chloramfenikolu do każdej studzienki 24-dołkowej płytki głębinowej. Dodać L-ramnozę (i glukozę) zgodnie z opisem w punkcie 3.1. Użyć 3 ml kultury, aby umożliwić zbiór w dwóch egzemplarzach i umożliwić pewne odparowanie wody przez uszczelkę przepuszczającą gaz.
2. Ustawić kultury ekspresyjne, dodając 150 μl nocnych kultur Lemo21 (DE3) lub C41(DE3) pLysS do każdej studzienki z 24-dołkowych bloków głębokich.
3. Potrząsaj blokami w temperaturze 37 °C, aż średnia średnica zewnętrzna przy 595 nm wyniesie ~0,5 przez płytkę.
4. Wywołać ekspresję poprzez dodanie IPTG do kultur do końcowego stężenia 1,0 mM IPTG.
5. Hodować kultury przez noc (18-20 godzin) z wytrząsaniem w temperaturze 20 °C.

5. Analiza ekspresji za pomocą fluorescencji w żelu

1. Zbierz w dwóch egzemplarzach. Przenieść 1 ml kultury z każdej studzienki do kwadratowego dołka o stożkowym dnie, 96-dołkowym bloku studni głębinowych.
   nuta: Zebrać w dwóch egzemplarzach w przypadku pęknięcia bloku lub w celu umożliwienia przetestowania alternatywnego detergentu, jeśli jest to pożądane.
2. Uszczelnić bloki i zebrać komórki przez odwirowanie przy 6 000 x g przez 10 minut.
3. Odwróć blok i zdekantuj pożywkę. Delikatnie postukaj blokiem o ręcznik papierowy, aby spuścić pozostałe media.
4. Uszczelnij płytki i przechowuj w temperaturze -80 °C przez co najmniej 20 minut. Opcjonalnie pozostaw eksperyment w tym miejscu, a blok przetworzony w dogodnym dla siebie czasie.
5. Rozmrażaj granulki przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
6. Użyj pipety wielokanałowej lub wytrząsarki orbitalnej (1 000 obr./min przez 10 min) w temperaturze 4 °C, aby całkowicie zawiesić komórki w 200 μl buforu do lizy (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl 10 mM Imidazol 1% v/v Tween 20, dostosować pH do 8,0 za pomocą NaOH).
7. Dodać 20 μl roztworu DLPI (20 μl DNaseI (4 000 jednostek/ml), 20 mg lizozymu i 20 μl koktajlu inhibitorów proteazy w końcowej objętości 2 ml wody). Inkubować przez 10 minut z wytrząsaniem (~1 000 obr./min) w temperaturze 4 °C.
8. Dodać 25 μl 10% n-dodecylu β-D-maltozydu (DDM).
9. Inkubować przez 60 minut z wytrząsaniem (~1 000 obr./min) w temperaturze 4 °C.
10. Odwirować blok studzienki głębinowej przy 6 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
11. Przenieść 10 μl oczyszczonego lizatu na płytkę do mikromiareczkowania i dodać 10 μl żelowego buforu ładującego SDS PAGE (100 mM Tris, pH 6,8, 4% w/v SDS, 0,2% w/v błękitu bromofenolowego, 10% v/v β-merkaptoetanolu i 20% v/v glicerolu). ostrożność! NIE GOTUJ PRÓBKI.
12. Załadować 10 μl próbki z kroku 5.11/studzienka na żel(e) SDS PAGE i uruchomić pod napięciem 100-120 V (stałe napięcie) w chłodnym pomieszczeniu, aż czoło barwnika osiągnie dno (2-2,5 godziny).
13. Umieścić żel na imagerze (np. z filtrem światła niebieskiego do wykrywania białek fuzyjnych GFP). Czas naświetlania jest tak dobrany, aby zapewnić, że najjaśniejsze pasma nie są nasycone.

6. Zwiększanie skali hodowli komórkowych

1. Przekształć podwielokrotność kompetentnej E. coli, jak opisano w sekcji 2.
2. Zebrać rodzinę posadczą do 10 ml bulionu energetycznego (uzupełnionego zgodnie z opisem w sekcji 3) i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Rozcieńczyć 5 ml nocnej kultury w 500 ml bulionu.
4. Rosnąć z wytrząsaniem przy 250 obr./min w temperaturze 37 °C, aż średnica zewnętrzna przy 595 nm wyniesie ~0,5.
5. Wywołać ekspresję przez dodanie IPTG do końcowego stężenia 1,0 mM.
6. Rosnąć przez noc z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min w temperaturze 20 °C.
7. Zbierać komórki przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 15 minut.
8. Odrzucić supernatant. Granulki komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.

7. Przygotowanie membran

1. Rozmrozić komórki (jeśli to konieczne) w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w 1x PBS pH 7,5 w objętości 5 ml na gram osadu komórkowego; W razie potrzeby zwiększać objętość, aż lepkość zmniejszy się do rzadkiej konsystencji. Dodać MgCl₂ do końcowego stężenia 1 mM, DNAzę I do końcowego stężenia 10 μg/ml i jedną paczkowaną tabletkę inhibitora proteazy na 20 g osadu komórkowego. Rozbij komórki za pomocą schłodzonego rozdzielacza komórek pod ciśnieniem 30 kpsi.
2. Nieuszkodzone komórki i zanieczyszczenia osadzać w masie 30 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do probówki do ultrawirówki.
3. Zebrać całkowitą frakcję membranową, odkręcając supernatant w ultrawirówce o sile 200 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
4. Odrzucić supernatant.
5. Ponownie zawiesić osad membranowy w lodowato zimnym 10 ml PBS o pH 7,5 za pomocą homogenizatora komórkowego. Dla każdego detergentu wymagane jest 1 ml zawieszonych membran. Opcjonalnie na tym etapie zawiesinę membranową należy błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

8. Solubilizacja i analiza frakcji membranowej

1. Rozmrozić frakcję membranową (jeśli to konieczne) i dla każdego detergentu, który ma być użyty do rozpuszczania, podamy 900 μl zawiesiny membranowej do probówki do mikrowirówki polialomerowej o pojemności 1,5 ml.
2. Dodać 100 μl każdego świeżo przygotowanego detergentu (10% w/v roztwory DDM, DM, Cymal-6 i LDAO) do końcowego stężenia 1% do podanej probówki o pojemności 1,5 ml. W celu rozpuszczania eukariotycznych białek błonowych do detergentów można dodać hemibursztynian cholesterolu (0,2% stężenia końcowego).
3. Inkubować mieszaniny w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę z łagodnym mieszaniem.
4. Frakcję nierozpuszczalną w detergencie osadnić za pomocą ultrawirówki stołowej, upewniając się, że probówki są co najmniej do połowy wypełnione, w temperaturze 150 000 g w temperaturze 4 °C przez 45 minut i zachowując supernatant.
   nuta: Skuteczność solubilizacji detergentu można oszacować za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych, mierząc fluorescencję GFP rozpuszczonych membran z frakcją nierozpuszczalną w detergencie zawieszoną w tej samej objętości PBS.
5. Przeanalizuj monodyspersyjność różnych kompleksów białek błonowych detergentu: za pomocą chromatografii wykluczającej z wykrywaniem fluorescencji (FSEC).
6. W przypadku analizy FSEC należy zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość o szerokim zakresie frakcjonowania, np. od 5 000 do 5 000 000 masy cząsteczkowej, z buforem roboczym (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min. Należy użyć tego buforu dla wszystkich próbek, tj. nie jest on zmieniany dla każdego badanego detergentu.
7. Wstrzyknąć 100 μl rozpuszczonych membran do kolumny z natężeniem przepływu 0,3 ml/min. Monitorować profil elucji za pomocą optyki fluorescencyjnej (wzbudzenie przy 488 nm i emisja przy 512 nm). Jeśli wbudowany monitor fluorescencji nie jest dostępny, zbierz frakcje i odczytaj fluorescencję w czytniku płytek.
8. Importuj dane dotyczące objętości elucji i intensywności fluorescencji do arkusza kalkulacyjnego w celu wyświetlenia graficznego.
9. Przeanalizować pozostały rozpuszczony materiał membranowy za pomocą fluorescencji w żelu, jak opisano w sekcji 5.

Wyniki

Rodzina białek SEDS (kształt, wydłużenie, podział i sporulacja) jest niezbędna do podziału komórek bakteryjnych. Te integralne białka zazwyczaj mają dziesięć domen transbłonowych z końcami aminowymi i karboksylowymi wewnątrz komórki. Aby zilustrować opisany powyżej protokół, 47 ortologów SED sklonowano do wektora pOPINE-3C-eGFP. Badanie przesiewowe ekspresji konstruktów na małą skalę przeprowadzono w dwóch szczepach E.coli, Lemo21(DE3) hodowanym w obecności 0,25 mM ramnozy w celu zablokowania nieszczelnej ekspresji i C41(DE3) pLysS, które są rutynowo stosowane do ekspresji białek błonowych^5-8.

Lizaty indukowanych kultur rozpuszczone w detergentach były analizowane za pomocą elektroforezy poliakrylamidowej SDS. Wykorzystanie fluorescencji w żelu do wizualizacji ekspresji białek fuzyjnych GFP wykazało, że między dwoma szczepami wyprodukowano 38 z 47 konstruktów SED. Co ciekawe, istniały różnice między tymi dwoma szczepami ekspresji. Spośród 38 eksprymowanych konstruktów, tylko 18 zostało wytworzonych w obu szczepach, 14 tylko w Lemo21(DE3) i 6 tylko w C41(DE3) pLysS. Ogólnie rzecz biorąc, wskaźnik sukcesu dla Lemo21(DE3) w porównaniu do C41(DE3) pLysS był wyższy (38 vs 24). Jednak obserwacja, że niektóre białka wydają się być specyficzne dla szczepu, oznacza, że badania przesiewowe w obu przypadkach są przydatne.

Dane reprezentatywne dla 24 z 47 konstrukcji SEDs są pokazane na rysunku 1. Intensywność prążków wskazuje na poziom ekspresji, np. białko fuzyjne w studzience C4 na rysunku 1A i 1B jest dobrze wyrażone w obu szczepach, jednak dodatkowe pasma o niższej masie cząsteczkowej sugerują, że białko jest częściowo zdegradowane. Na wielu pasach ruchu znajduje się pasmo, które wielkością odpowiada samej GFP. Jakościową ocenę integralności białka można przeprowadzić, przyglądając się intensywności białka fuzyjnego w stosunku do wolnej GFP; Na przykład. G4 i H4 są całkowicie rozkładane na wolne GFP w C41 (DE3) pLysS (Figura 1B), podczas gdy w Lemo21 (DE3) znajduje się pewne nienaruszone białko (Figura 1A). Dla 14 z 38 białek ulegających ekspresji intensywność wolnego pasma GFP jest podobna do intensywności białka fuzyjnego, dla 21 intensywność wolnego pasma GFP jest większa niż białka fuzyjnego, a mniejszość białek fuzyjnych (wyrażona 3/38), np. F6 i G6 na rysunku 1A mają stosunkowo mało wolnego GFP w porównaniu z białkiem fuzyjnym.

Dwa z konstruktów, które wykazywały dobrą ekspresję w pierwotnym badaniu przesiewowym: B5 (pasma o wysokiej intensywności dla wolnego GFP i białek fuzyjnych) i G6 (mało wolnego GFP) zostały wyrażone, a całkowita frakcja błonowa została przygotowana z 500 ml hodowli komórkowej. Zawieszone błony podzielono na podwielokrotności i przeanalizowano za pomocą chromatografii wykluczającej z wykrywaniem fluorescencji (FSEC). Profile FSEC przedstawiono odpowiednio na rysunkach 2A i 2B i pokazują, że oba białka SED zachowują się inaczej w czterech badanych detergentach. W jednym przypadku (ryc. 2A: próbka B5) białko dało tylko symetryczny pik z niewielką agregacją w DDM, który byłby zatem detergentem z wyboru do późniejszego oczyszczania. Natomiast inne białko fuzyjne (ryc. 2B: próbka G6) miało podobny profil we wszystkich badanych detergentach.

Rycina 1: Diagram przepływu pracy do badania przesiewowego ekspresji białka błonowego u E. coli przy użyciu reportera GFP.

Ryc. 2: Pierwszorzędowe badanie przesiewowe ekspresji białek błonowych przy użyciu fluorescencji w żelu. Lizaty detergentów komórek E. coli analizowano za pomocą SDS-PAGE, a żele obrazowano przy użyciu oświetlenia Blue Epi i filtra 530/28. Wyniki przedstawiono dla 24 konstruktów (oznaczonych jako A4-H6 na podstawie ich położenia w 96-dołkowej płytce). Wskazano pozycje prążków dla wolnych białek fuzyjnych GFP i GFP. (A) Białka ulegające ekspresji w Lemo21(DE3). (B) Białka ulegające ekspresji w C41(DE3) pLysS.

Rycina 3: Wtórne badanie przesiewowe ekspresji białek błonowych przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości wykrytej przez fluorescencję (FSEC). Całkowite frakcje błonowe ekstrahowano w czterech różnych detergentach, a rozpuszczone białka błonowe analizowano za pomocą chromatografii wykluczania wielkości przy użyciu systemu FPLC sprzężonego z detektorem fluorescencyjnym. Profile FSEC dla (A) białka błonowego B5 i (B) białka błonowego G6. Wskazuje się położenie pików odpowiadających białkom zagregowanym, rozpuszczonemu białku fuzyjnemu GFP i wolnemu GFP. Testowane detergenty są wskazane poniżej profili.

Dyskusja

W protokole opisanym w tym artykule klonowanie niezależne od ligacji do wektora reporterowego GFP jest połączone z detekcją fluorescencyjną w celu szybkiego badania przesiewowego względnej ekspresji wielu białek błonowych w E. coli. Wektory można wykonać w ciągu czterech dni roboczych, a podstawowe badanie przesiewowe ekspresji zajmuje kolejny tydzień. Fluorescencja w żelu lizatów detergentowych całych komórek służy do klasyfikowania trafień ekspresji w celu dalszej analizy na wtórnym ekranie. Przedstawione pierwotne badanie przesiewowe nie wymaga żadnego specjalistycznego sprzętu poza inkubatorem z wytrząsarką odpowiednim do hodowli komórek w blokach studni głębinowych. Wszystkie inne czynności związane z cieczami z użyciem 96-dołkowych płytek SBS można wykonywać za pomocą pipet wielokanałowych. Protokół może być łatwo zmodyfikowany w celu uwzględnienia innych szczepów E. coli hodowanych w innych warunkach ekspresji (np. w niższej temperaturze). W przypadku LEMO21(DE3) miareczkowanie poziomu ramnozy (od 0 do 2,0 mM) dodanego w celu modulacji szybkości transkrypcji może zwiększyć poziom ekspresji niektórych białek błonowych⁷ . Detergenty inne niż DDM mogą być używane do ekstrakcji w pierwotnym sicie, chociaż ostrzejsze detergenty mogą rozpuszczać białka z ciał inkluzyjnych, a tym samym dawać fałszywie dodatnie wyniki. Oczywiście, im bardziej skomplikowany staje się początkowy ekran, tym bardziej czasochłonny jest eksperyment.

Badanie wtórne polega na przygotowaniu całkowitej frakcji błonowej z trafień ekspresji zidentyfikowanych na ekranie pierwotnym. Jest to kluczowy krok, ponieważ potwierdzi lokalizację białek fuzyjnych w błonie komórek E. coli . Późniejsza ekstrakcja białka fuzyjnego GFP w różnych detergentach jest monitorowana za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość z wykrywaniem fluorescencji rozpuszczonego materiału w celu oceny monodyspersyjności kompleksów detergent-białko. Jest to kolejny krytyczny krok, ponieważ identyfikuje najbardziej odpowiedni detergent do rozpuszczania białka błonowego do dalszego przetwarzania. Doświadczenie pokazuje jednak, że dalsza optymalizacja doboru detergentów może być nadal wymagana podczas oczyszczania i krystalizacji. Dowody na jednolite zachowanie w różnych detergentach, w tym w tych o stosunkowo małym rozmiarze miceli (np. LDAO), wydają się być dobrym wskaźnikiem skłonności do tworzenia dobrze dyfrakujących kryształów, przynajmniej w przypadku prokariotycznych białek^błonowych14. Pod tym względem profil pokazany dla białka błonowego na rysunku 2B wydaje się bardzo korzystny.

Główną zaletą stosowania reportera GFP jest to, że zapewnia on szybki odczyt ekspresji w nieoczyszczonych próbkach. Wadą jest to, że białko fuzyjne GFP musi zostać usunięte podczas oczyszczania białka w celu krystalizacji. W przypadku zastosowanych tutaj wektorów, miejsce proteazy 3C rinowirusa umożliwia rozszczepienie GFP. Alternatywnie, łatwo jest ponownie sklonować białka kandydujące, zidentyfikowane na ekranie, do wektorów, które dodają tylko znacznik polihistydyny lub innego powinowactwa w celu późniejszego oczyszczenia. Zakłada się, że fuzja z GFP nie jest konieczna do wyrażenia. Główną alternatywą dla stosowania fuzji do GFP do wykrywania ekspresji białek błonowych i solubilizacji jest dodanie tylko znacznika histydyny. Jednak takie podejście zazwyczaj wymaga rozpoczęcia od frakcji membranowej¹⁵ , co w przypadku oceny wielu wariantów stałoby się bardzo czasochłonne.

Podsumowując, głównym celem protokołu opisanego w tym artykule jest umożliwienie szybkiej oceny dużej liczby wariantów sekwencji białek błonowych pod względem ekspresji i solubilizacji detergentów oraz nadania im priorytetu w celu głębszej analizy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pOPIN-N-GFP	addgene (www.addgene.org)
pOPINE-3C-GFP	addgene (www.addgene.org)
C41(DE3)pLysS	Lucigen (http://lucigen.com/)	60444-1
LEMO21(DE3)	New England Biolabs	C2528H
System klonowania In-Fusion HD EcoDry, 96 Rxns	Clontech/Takara	639688
Rosół mocy	Wymiary molekularne (http://www.moleculardimensions.com/)	MD12-106-1
Tabletki inhibitora proteazy	Roche	11697498001
cOmplete, Mini, bez EDTA; Koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11836170001
Monohydrat L-ramnozy	Sigma-Aldrich	83650
Koktajl inhibitorów proteazy	Sigma-Aldrich	P8849
DNAse 1	Sigma-Aldrich	DN25
Lizozym	Sigma-Aldrich	L7651
Hemibursztynian cholesterolu	Sigma-Aldrich	C6512
CYMAL-6 (6-Cykloheksylo-1-Heksyl-β-D-Maltozyd)	Anatrace	C326
DDM (n-Dodecyl β-maltozyd)	Generon	D97002
DM (n-decyl β-maltozyd)	Generon	D99003
LDAO (N,N-dimetylo-n-dodecylamina N-tlenek)	Generon	D71111
E1 ClipTip Eq384 8  Kanały 1-30 i mikro; l	Thermo Scientific
Pipeta Rainin Pipet-Lite XLS 6-kanałowa 100-1 200 &mikro; l LTS Spacer	Anachem	LA6-300XLS
Pipeta Rainin Lekka XLS + 8-kanałowa 2-20 i mikro; l Pipeta LTS	Anachem	L8-20XLSPLUS
Pipet-Lite XLS 8-kanałowa 100-1,200 i mikro; l Końcówka	LTS Anachem	L8-1200XLS
bloki głębinowe V z dnem	Porvair sciences	360115
BenchMark Fluorescencyjne białko Standard	Life Technologies	LC5928
NuPAGE Novex 10% żele białkowe Bis-Tris Midi, 26 dołków	Life Technologies	WG1203BOX
XCell4 SureLock Midi-Cell	Life Technologies	WR0100
Vibramax 100	Heidolph	544-21200-00
Przystawka do rolek napinających	Heidolph	549-81000-00
ptima L-100 Ultrawirówka z wirnikiem 45-Ti	Beckman Coulter	393253
ultrawirówka Optima Max-XP z wirnikiem TLA-55	Beckman Coulter	393315
Wirówka stojąca, Avanti J-26S XPI z JA-17 i wirniki JS-5.3	Beckman Coulter	B14535
Prominence UFLC z RF-20A Detektor fluorescencji	Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL rozmiar kolumny wykluczającej	GE Healthcare	17-5172-01
SSI5R-HS SHEL LAB Inkubator z wytrząsaniem modeli podłogowych, 5 stóp sześciennych (144  L), 30-850 obr./min	Shel Lab	SSI5R-HS
Innova44R Inkubator	New Brunswick /Eppendorf	Innova44R
TS Series 0,75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1  PH (40 kpsi)	Systemy stałe	PL083016
monohydrat L-ramnozy	Sigma	83650