Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Podsumowanie

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Streszczenie

Połączenie nagrań z dwóch (lub więcej) synaptycznie sprzężonych neuronów (sparowanych nagrań) w ostrych preparatach do wycinków mózgu z jednoczesnym wewnątrzkomórkowym wypełnieniem biocytyną pozwala na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Dzięki tej metodzie możliwe jest zidentyfikowanie i scharakteryzowanie zarówno neuronów pre-, jak i postsynaptycznych na podstawie ich morfologii i wzorca reakcji elektrofizjologicznej. Sparowane nagrania pozwalają na badanie wzorców połączeń między tymi neuronami, a także właściwości zarówno chemicznej, jak i elektrycznej transmisji synaptycznej. W tym miejscu podajemy krok po kroku opis procedur wymaganych do uzyskania wiarygodnych sparowanych nagrań wraz z optymalnym przywróceniem morfologii neuronu. Opiszemy, w jaki sposób pary neuronów połączone synapsami chemicznymi lub połączeniami szczelinowymi są identyfikowane w preparatach do wycinków mózgu. Opiszemy, w jaki sposób neurony są rekonstruowane w celu uzyskania ich morfologii 3D domeny dendrytycznej i aksonalnej oraz jak identyfikowane i lokalizowane są kontakty synaptyczne. Omówimy również zastrzeżenia i ograniczenia techniki nagrywania w parach, w szczególności te związane z dendrytycznymi i aksonalnymi cięciami podczas przygotowywania wycinków mózgu, ponieważ mają one silny wpływ na oszacowania połączeń. Jednak ze względu na wszechstronność podejścia opartego na sparowanym zapisie, pozostanie ono cennym narzędziem w charakteryzowaniu różnych aspektów transmisji synaptycznej w zidentyfikowanych mikroobwodach neuronalnych w mózgu.

Wprowadzenie

Mikroobwody neuronalne między dwoma synaptycznie sprzężonymi neuronami są budulcem dużych sieci w mózgu i są podstawowymi jednostkami przetwarzania informacji synaptycznych. Warunkiem wstępnym do scharakteryzowania takich mikroobwodów neuronalnych jest poznanie morfologii i właściwości funkcjonalnych zarówno pre-, jak i postsynaptycznych neuronów partnerskich, rodzaju połączenia synaptycznego (połączeń) synaptycznych oraz ich struktury i mechanizmu funkcjonalnego. Jednak w wielu badaniach połączeń synaptycznych co najmniej jeden z neuronów w mikroukładzie nie jest dobrze scharakteryzowany. Wynika to ze stosunkowo mało specyficznych protokołów stymulacji, często stosowanych w badaniach nad łącznością synaptyczną. W związku z tym strukturalne i funkcjonalne właściwości neuronu presynaptycznego albo nie są zidentyfikowane wcale, albo są one ograniczone do niewielkiego stopnia (tj. ekspresja białek markerowych itp.). Sparowane zapisy w połączeniu z barwieniem wewnątrzkomórkowym za pomocą markerów, takich jak biocytyna, neurobiotyna lub barwniki fluorescencyjne, lepiej nadają się do badania małych mikroobwodów neuronalnych. Technika ta pozwala na jednoczesne badanie wielu parametrów strukturalnych i funkcjonalnych morfologicznie zidentyfikowanego połączenia synaptycznego.

Tak zwane 'unitarne' połączenia monosynaptyczne między dwoma neuronami zostały zbadane zarówno w korowych, jak i podkorowych obszarach mózgu^1-10 przy użyciu preparatów do ostrych plastrów. Początkowo w eksperymentach tych używano ostrych mikroelektrod; Później zastosowano nagrywanie patch clamp w celu uzyskania nagrań sygnałów synaptycznych o niższym poziomie szumów i lepszej rozdzielczości czasowej.

Znaczącym postępem technicznym było użycie optyki IR-DIC (Differential Interference Contrasts)^11-14, techniki mikroskopowej, która znacznie poprawiła widoczność i identyfikację neuronów w wycinku mózgu, dzięki czemu możliwe stało się uzyskanie nagrań z wizualnie zidentyfikowanych połączeń synaptycznych^15-17. Ogólnie rzecz biorąc, nagrania w parach są wykonywane w preparatach do ostrych plastrów; Dostępnych jest tylko bardzo niewiele publikacji opisujących nagrania z neuronów połączonych synaptycznie in vivo^18-20.

Najważniejszą zaletą sparowanych zapisów jest fakt, że charakterystyka funkcjonalna może być połączona z analizą morfologiczną zarówno na poziomie mikroskopu światła, jak i elektronów (patrz np.^,7,16,21). Po przetworzeniu histochemicznym śledzona jest morfologia dendrytyczna i aksonalna pary neuronów połączonych synaptycznie. Następnie możliwe jest ilościowe określenie cech morfologicznych, takich jak długość, gęstość przestrzenna, orientacja, wzór rozgałęzień itp. Parametry te mogą następnie stanowić podstawę do obiektywnej klasyfikacji określonego połączenia synaptycznego. Ponadto, w przeciwieństwie do większości innych technik stosowanych do badania połączeń neuronalnych, sparowane nagrania pozwalają również na identyfikację kontaktów synaptycznych dla unitarnych połączeń synaptycznych. Można to zrobić bezpośrednio za pomocą kombinacji mikroskopii świetlnej i elektronowej^16,21-27 lub za pomocą obrazowania wapniowego^28,29 kolców dendrytycznych. Jednak w przypadku tego drugiego podejścia można badać tylko połączenia pobudzające, ale nie hamujące, ponieważ wymaga to napływu wapnia przez postsynaptyczne kanały receptorowe.

Oprócz szczegółowej analizy transmisji synaptycznej w zdefiniowanym mikroukładzie neuronalnym, nagrania par pozwalają również na badanie reguł plastyczności synaptycznej^30,31 lub - w połączeniu z zastosowaniem agonisty/antagonisty - modulacji transmisji synaptycznej przez neuroprzekaźniki, takie jak acetylocholina³² i adenozyna³³.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą UE o ochronie zwierząt, niemiecką ustawą o ochronie zwierząt (Tierschutzgesetz) oraz wytycznymi Federacji Europejskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych.

1. Przygotowanie do Elektrofizjologii

Zanim rozpoczniesz nagrywanie w parach, musi zostać zbudowany zestaw elektrofizjologiczny. Krótki zarys, w jaki sposób taka konfiguracja jest montowana, znajduje się poniżej:

1. Zainstaluj stół antywibracyjny, na którym zostanie umieszczony mikroskop, manipulatory i cały inny sprzęt.
   UWAGA: Wibracje lub jakikolwiek inny rodzaj ruchu musi być jak najmniejszy podczas nagrywania z połączeń synaptycznych, ponieważ wymaga to wymiany pipet (elektroda wyszukująca zastąpiona elektrodą rejestrującą).
2. Umieść klatkę Faradaya wokół stołu antywibracyjnego, aby zmniejszyć szum elektryczny. Podłącz wszystkie urządzenia wewnątrz klatki Faradaya do uziemienia elektrycznego.
3. Zainstaluj mikroskop z zmotoryzowaną osią ostrości, która jest oparta na zmotoryzowanym stole x-y na stole antywibracyjnym zgodnie z wytycznymi producenta. Pozwala to na niezawodne przeniesienie mikroskopu do neuronów, które nie znajdują się w tym samym polu widzenia, co w przypadku połączeń translaminarnych w korze nowej.
4. Zainstaluj kamerę wideo w porcie kamery mikroskopu i podłącz ją do ekranów analogowych i/lub cyfrowych, aby obserwować przygotowanie plastrów i ruch elektrod. Użyj kamery, którą można przełączać między powiększeniem o niskiej i dużej mocy, aby uzyskać odpowiednio obraz ogólny i zbliżeniowy pary komórek neuronalnych. Pomaga to również kontrolować ruch elektrod krosowych.
5. Zainstaluj stół z próbkami zawierający wkładkę do komory kąpieli (wywierconą we własnym zakresie z bloku pleksiglasu) do przygotowania wycinka mózgu. Ten stół z próbkami nie może być podłączony do mikroskopu, tj. musi być przymocowany do stołu powietrznego, a mikroskop powinien być pod nim zwrotny.
6. Zamontuj dwa (lub więcej w razie potrzeby) precyzyjne mikromanipulatory, które można przesuwać we wszystkich trzech wymiarach. Zainstaluj przedwzmacniacz patch-clamp na manipulatorach i podłącz je do głównego amplifier.
   UWAGA: W razie potrzeby można zainstalować dodatkowe manipulatory, np. dla więcej niż dwóch przedwzmacniaczy, elektrod do stymulacji zewnątrzkomórkowej, systemów dostarczania leków itp.
7. Umieść komorę kąpieli w stole na próbki. Zainstaluj wlot i wylot roztworu i podłącz je do systemu perfuzyjnego.
8. Za pomocą pompy perystaltycznej należy utrzymać perfuzję komory rejestracyjnej ze sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF; Tabela 1) przy stabilnym natężeniu przepływu 4 - 6 ml/min dla optymalnej żywotności plastrów.
   UWAGA: Nie należy znacznie przekraczać tego natężenia przepływu, ponieważ spowoduje to turbulencje w ASCF, a tym samym ruch plasterka.
9. Zamontuj uchwyty sondy temperatury i elektrody uziemiającej Ag/AgCl na stole do pobierania próbek. Jest to konieczne, aby sonda i elektroda mogły pobrać próbki kąpieli w komorze.
10. Aby uzyskać dobrą widoczność neuronów w preparacie plastrów, należy użyć oświetlenia w podczerwieni w mikroskopie. Zmniejsza to dyfrakcję światła, a tym samym rozmycie obrazu. Upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w interferencyjną optykę kontrastową, aby uzyskać wizualizację podobną do "3D". Pomoże to w łataniu neuronów i umożliwi celowanie w neurony głęboko w wycinku (60 μm lub głębiej).
11. Podczas eksperymentu trzymaj plastry mózgu w komorze eksperymentalnej ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym na dnie. Umieść "platynową harfę" na wierzchu plasterka, aby zapobiec unoszeniu się plasterków. Harfa platynowa wykonana jest ze spłaszczonego drutu platynowego w kształcie litery U z przyklejonymi do niego sznurkami nici dentystycznej.
12. Utrzymuj ACSF perfujący plasterek w temperaturze 32 - 35 °C, aby zapewnić optymalną kontrolę natlenienia i pH. Można to zrobić poprzez podgrzanie roztworu za pomocą urządzenia Peltiera zainstalowanego w pobliżu dopływu ACSF do komory kąpielowej.
    UWAGA: Używaj ultracienkich szkiełek nakrywkowych, aby nawet kondensatory mikroskopowe o dużej aperturze numerycznej i niewielkiej odległości roboczej mogły być skupione na próbce. Jest to konieczne do optymalnego oświetlenia plastru.
    Aby zapoznać się z obrazem i opisem konfiguracji elektrofizjologicznej zoptymalizowanej pod kątem sparowanych zapisów w przygotowaniu wycinka mózgu, patrz rysunek 4 w odnośniku ³⁴.

2. Przygotowanie plastra mózgu

1. Zwierzę, od którego ma zostać pobrana tkanka mózgowa, należy delikatnie znieczulić izofluranem (stężenie końcowe <0,1%).
   UWAGA: Można również stosować inne środki znieczulające. Stosowanie środka znieczulającego powinno być zgodne z zaleceniami i zasadami odpowiedniego komitetu ds. zwierząt. Zawsze upewnij się, że zwierzę nie jest podrażnione ani zestresowane po dodaniu środka znieczulającego.
2. Odetnij głowę zwierzęcia, otwórz czaszkę i usuń mózg tak szybko, jak to możliwe, stosując procedurę opisaną w Refs. ^{Lokal mieszkalny 34,35}.
3. Przenieść mózg do schłodzonego (4 °C) sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego napowietrzonego mieszaniną gazu karbogenicznego o stężeniu 95%_O2 i 5%_CO2.
4. Wyizoluj obszar mózgu, który powinien być badany.
   UWAGA: Parametry pozwalające uzyskać optymalne zachowanie i minimalne skrócenie dendrytów i aksonów neuronów pre- i postsynaptycznych powinny być określone z wyprzedzeniem dla każdego badanego połączenia neuronalnego i etapu rozwoju. W optymalnie wypreparowanym wycinku mózgu akson neuronu presynaptycznego nie musi być równoległy do powierzchni wycinka. Powinny raczej wskazywać na plastry pod płytkim kątem. Dotyczy dendrytu wierzchołkowego postsynaptycznych neuronów piramidowych; Należy to sprawdzić pod mikroskopem świetlnym. Jest to szczególnie ważne w przypadku nielokalnych lub translaminarnych połączeń synaptycznych, tj. gdy somaty pre- i postsynaptyczne są oddalone od siebie o więcej niż 200 μm, a prawdopodobieństwo obcięcia dendrytycznego i aksonalnego może być znacznie wyższe niż w przypadku połączeń lokalnych.
5. Przenieś mózg do komory mikrotomu. Na podstawie wyników badań empirycznych stosuje się różne roztwory do zewnątrzkomórkowego krojenia w zależności od wieku zwierzęcia (patrz tabele 2 i 3; pomocne informacje można również znaleźć pod "http://www.brainslicemethods.com/").
6. Przytnij mózg, aż obszar docelowy będzie widoczny.
7. Aby uzyskać plastry o dobrej widoczności komórek, należy pokroić plastry mózgu o grubości 300 - 400 μm, jeśli zwierzę jest dojrzałe (>3 tygodnie). Jeśli zwierzę jest niedojrzałe (od^{1 do 2 tygodnia po} urodzeniu w przypadku myszy i szczurów), plastry można pokroić do grubości ~600 - 800 μm bez znacznego pogorszenia widoczności komórek.
   UWAGA: Poprawi to stabilność "niedojrzałych" warstw i zmniejszy liczbę możliwych obcięć odległych zabezpieczeń dendrytycznych i aksonalnych.
8. Przenieść plastry z komory mikrotomowej do komory inkubacyjnej wypełnionej roztworem do krojenia napowietrzonym mieszaniną 95%_O2 i 5% CO_{2 .} Przechowywać plastry w komorze inkubacyjnej przez co najmniej 30 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej lub ~30 °C, w zależności od rodzaju eksperymentu.

3. Zapis sparowanego patch-clampa i napełnianie biocytyną

W zależności od typu połączenia synaptycznego stosuje się trzy różne podejścia do znajdowania neuronów sprzężonych synaptycznie. Jeśli prawdopodobieństwo połączenia jest niskie (czego można się spodziewać w przypadku większości połączeń pobudzających), postępuj w następujący sposób:

1. Połączenia neuronalne o niskiej łączności
   1. Napełnić pipety z plastrami roztworem wewnętrznym o składzie wymienionym w Tabeli 4. W przypadku wszystkich zapisów w konfiguracji całokomórkowej dodać biocytynę w stężeniach od 3 do 5 mg/ml do roztworu wewnętrznego (pipety), aby uzyskać dobre wyniki barwienia neuronów pre- i postsynaptycznych. Pozwól biocytynie dyfundować do komórki przez co najmniej 15 - 30 minut (w zależności od wielkości neuronu).
      UWAGA: Nie należy dodawać biocytyny do roztworu używanego w pipetach "poszukiwawczych" wymienionych poniżej.
   2. Załataj domniemany neuron postsynaptyczny w trybie całej komórki. Używaj pipet z długim i smukłym trzonkiem. Ułatwia to manewrowanie pipetą pod obiektywem i zmniejsza artefakty ruchu, które mogą wystąpić po wprowadzeniu elektrody do plastrów.
   3. Następnie należy załatać potencjalny neuron presynaptyczny w konfiguracji przyłączonej do komórki za pomocą "poszukiwawczej" pipety do łatania o rezystancji 8-10 MΩ i małej średnicy końcówki. Za pomocą tych pipet ustal "luźny" plaster przyczepiony do komórek. Napełnij pipetę "poszukiwawczą" roztworem wewnętrznym, w którym K⁺ jest zastąpiony przez Na⁺ (Tabela 5), aby nie depolaryzować neuronów podczas poszukiwania komórki presynaptycznej.
      UWAGA: Rezystancja "luźnego" uszczelnienia nie mieści się w zakresie GΩ, ale zwykle wynosi około 30 - 300 MΩ.
   4. Utrzymuj potencjał membrany pod "luźnym" uszczelnieniem na poziomie około -30 do -60 mV w obecnym trybie cęgowania. Następnie zastosuj duże impulsy prądowe (0,2 - 2 nA), aby wywołać potencjał czynnościowy w potencjalnej komórce presynaptycznej. Obserwuj ten potencjał czynnościowy jako mały kłosek na odpowiedzi napięciowej.
   5. Ustaw częstotliwość stymulacji na 0,1 Hz, aby zapobiec wyczerpaniu odpowiedzi postsynaptycznej. Używaj niższych częstotliwości stymulacji w przypadku, gdy tkanka mózgowa jest bardzo niedojrzała lub połączenie synaptyczne nie jest zbyt niezawodne.
   6. W przypadku, gdy neuron "postsynaptyczny" nie reaguje na stymulację badanego neuronu "presynaptycznego", należy załatać nowy neuron w trybie "luźnego" uszczelnienia. Nie należy wymieniać elektrody krosowej "poszukiwawczej", dopóki ustalona jest uszczelka o rezystancji >30 MΩ. Przetestuj w ten sposób do 30 potencjalnie presynaptycznych neuronów.
      UWAGA: Aby zapobiec uszkodzeniu neuronu podczas procedury wyszukiwania za pomocą luźnego zacisku krosowego, do pipety poszukiwawczej należy przynosić tylko delikatne ssanie, a nie do pipety z łatą na całe komórki.
   7. Jeśli stymulacja w trybie "luźnego" uszczelnienia powoduje powstanie EPSP/IPSP z opóźnieniem <5 ms w neuronie postsynaptycznym, należy usunąć pipetę "poszukiwawczą" z neuronu presynaptycznego.
   8. Zastąp pipetę z plastrem "poszukiwawczym" elektrodą wypełnioną zwykłym roztworem wewnętrznym zawierającym biocytynę. Upewnij się, że ta pipeta krosowa do nagrywania ma rezystancję 4 - 8 MΩ; Im większy rozmiar SOMA, tym niższa może być rezystancja elektrody.
   9. Załataj neuron presynaptyczny i zapisz w trybie cęgowym całej komórki. Wywołaj potencjały czynnościowe przez wstrzyknięcie prądu do neuronów presynaptycznych i zarejestruj odpowiedź postsynaptyczną. Przechowuj dane na komputerze w celu późniejszej analizy w trybie off-line.
2. Połączenia neuronalne o wysokiej łączności
   UWAGA: W przypadku mikroukładów neuronalnych o wysokim współczynniku połączeń (> 30%) należy zastosować inną procedurę, aby znaleźć połączenia synaptyczne. Ta procedura jest opisana poniżej i jest często stosowana w hamujących połączeniach synaptycznych, które mają średnio wyższy współczynnik połączeń niż połączenia pobudzające³⁶. Nie należy go używać, gdy współczynnik łączności spadnie poniżej tej wartości.
   1. Załataj neuron presynaptyczny bezpośrednio w trybie całej komórki. Następnie załataj potencjalny neuron postsynaptyczny, również w trybie całej komórki. Oba ogniwa powinny znajdować się pod kontrolą cęgów prądowych. Wywołaj potencjał czynnościowy w komórce presynaptycznej. Monitoruj potencjalny neuron postsynaptyczny pod kątem potencjału postsynaptycznego.
   2. W przypadku, gdy neuron nie wykazuje odpowiedzi na stymulację presynaptyczną, załataj nowy neuron w trybie całej komórki za pomocą elektrody łatkowej wypełnionej zwykłym roztworem wewnętrznym. Jeśli połączenie zostanie znalezione, nie wymieniaj pipety z plastrem, ale kontynuuj nagrywanie. Następnie postępuj jak w kroku 3.1.9.
3. Połączenia neuronalne za pośrednictwem połączeń szczelinowych
   UWAGA: Aby wyszukać połączenia elektryczne (rozłączenie-szczelina), należy skorzystać z poniższej procedury, która jest zmodyfikowaną wersją procedury używanej w przypadku połączeń o niskim prawdopodobieństwie.
   1. Łataj neuron postsynaptyczny w konfiguracji klamry łatki dla całej komórki.
   2. Następnie należy załatać przypuszczalny neuron presynaptyczny w konfiguracji luźnego uszczelnienia (niska rezystancja uszczelnienia 30 - 300 MΩ) za pomocą "poszukiwawczej" pipety do łatki o rezystancji 7 - 10 MΩ. Pipeta ta powinna być wypełniona zmodyfikowanym roztworem wewnętrznym o wysokiej zawartości Na⁺ w celu stymulacji luźnym uszczelnieniem.
   3. Wstrzykiwać hiperpolaryzacyjne impulsy prądu o długości 100 - 300 ms przez "luźną" uszczelkę; potencjał sterowania pipetą powinien być ustawiony na około -60 do -70 mV. Obserwuj połączenie ze złączem szczelinowym, jeśli ta stymulacja powoduje niewielką odpowiedź hiperpolaryzacyjną w neuronach "postsynaptycznych".
   4. Ponownie załatać neuron "presynaptyczny" w trybie całej komórki i postępować zgodnie z powyższym opisem.
      UWAGA: Aby zapewnić dobre barwienie wyrostków aksonalnych i dendrytycznych, należy skorzystać z poniższego protokołu. Protokół ten jest opisany pokrótce tutaj, jednak szczegółowy protokół przetwarzania histochemicznego stosowanego w naszym laboratorium znajduje się w Ref. ³⁷.

4. Przetwarzanie histochemiczne

1. Przenieś wycinek mózgu z parą synaptycznie sprzężonych neuronów do fiolki zawierającej 4% paraformaldehydu rozpuszczonego w 0,1 M buforze fosforanowym i utrwalaj wycinek przez 24 godziny. W przypadku mikroskopii elektronowej utrwalić plasterek za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego i 1% paraformaldehydu.
2. Następnego dnia przenieś plastry do normalnego buforu fosforanowego niezawierającego utrwalacza. Plastry myć buforem fosforanowym 6 - 8 razy po 10 - 15 minut, aby usunąć nadmiar utrwalacza.
3. Inkubować plastry przez 20 minut w 3% roztworze H₂O_{2 w} 0,1 M buforze fosforanowym, aby zminimalizować endogenną reakcję peroksydazy. Obserwuj silne tworzenie się pęcherzyków. Kontynuuj reakcję, aż nie będą już wytwarzane pęcherzyki. Następnie opłucz plastry w 0,1 M buforze fosforanowym 6 - 8 razy (po 10 minut), aby usunąć resztki_H2O2.
4. Reakcje immunocytochemiczne i chromogenne
   Wizualizacja neuronów wypełnionych biocytyną opiera się na reakcji peroksydazy chrzanowej i biotynylowanej streptawidyną, katalizowanej diaminobenzydyną; W ten sposób powstaje ciemny osad, który wytwarza wyraźną plamę o wysokiej rozdzielczości przestrzennej. W reakcji chromogennej stosuje się następujące procedury:
   1. Przygotuj roztwór ABC zgodnie z protokołem producenta. Dodać do 14,55 ml buforu fosforanowego uzupełnionego 150 μl 10% Triton X100 (Tabela 6; tylko do mikroskopii świetlnej) i trzymać roztwór przez około 30 minut w ciemności. Przed użyciem inkubować plastry w tym roztworze O/N.
   2. Inkubować plastry w roztworze ABC na wytrząsarce przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i w ciemności. Następnie przechowuj plastry O/N w temperaturze 4 °C w lodówce. Następnego ranka inkubuj plastry w RT przez dodatkową godzinę.
   3. Następnie opłucz plastry co najmniej cztery razy przez 10 minut każdy w buforze fosforanowym. Następnie inkubować na wytrząsarce przez około 30 minut w ciemności w 2 ml roztworu 3-3'-diaminobenzydyny o intensywności niklu (Tabela 7). Zachowaj szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z diaminobenzydyną i używaj tylko pod wyciągiem; Jest niezwykle rakotwórczy nawet w bardzo niskich stężeniach.
   4. Dodać 6,5 μl 3% H₂O₂ do roztworu zawierającego diaminobenzydynę. Monitoruj reakcję chromogenną pod mikroskopem świetlnym, aż brązowo-czarne neurony będą wyraźnie widoczne. Następnie należy natychmiast przerwać reakcję, kilkakrotnie myjąc plastry w buforze fosforanowym.
   5. Zamontuj plastry z barwionymi neuronami na adhezyjnych, pokrytych silanem Histobondach lub żelatynizowanych szkiełkach do standardowych obiektów.
   6. Szkiełka należy przechowywać w wilgotnej komorze o wilgotności co najmniej 80% O/N. Następnego dnia pozostaw plastry do wyschnięcia na powietrzu przez kolejne 10 minut. Przed zatopieniem przenieś szkiełka w roztworach o rosnącym stężeniu etanolu (20 - 100%) w celu ich odwodnienia.
      UWAGA: Proces odwadniania powinien być powolny, w przeciwnym razie mogą wystąpić zniekształcenia w procesach dendrytycznych i aksonalnych³⁷. W przypadku wyboru alternatywnej metody zatapiania, np. z użyciem Moviol na bazie glicerolu, odwodnienie nie jest wymagane; Jednak może to spowodować niejednorodną kompresję wycinka, a tym samym zniekształconą morfologię neuronów.
   7. Na koniec inkubuj przez 10 minut w ksylolu, zanurz plastry w hydrofobowym podłożu do mikroskopii świetlnej i umieść na wierzchu ultracienkie szkiełka nakrywkowe. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 20 minut w temperaturze pokojowej.

5. Rekonstrukcja neuronów i lokalizacja kontaktów synaptycznych

1. Zbadaj szkiełka z neuronami znakowanymi biocytyną pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w obiektyw zanurzeniowy 60X/100X i kondensor z dużą aperturą numeryczną dla optymalnej rozdzielczości przestrzennej. Upewnij się, że bulony aksonalne i kolce dendrytyczne są wyraźnie widoczne.
2. Śledź neurony lub pary neuronów sprzężonych synaptycznie za pomocą komercyjnego systemu śledzenia neuronów (patrz Tabela określonych materiałów/sprzętu) w celu uzyskania rekonstrukcji neuronów 3D. Przeprowadzaj śledzenie ręcznie pod stałą kontrolą wzrokową, aby wykryć nawet małe zabezpieczenia aksonalne lub dendrytyczne. W przypadku sparowanych nagrań z neuronów sprzężonych synaptycznie ręczne śledzenie jest nadal metodą z wyboru, ponieważ przypisanie np. profilu aksonalnego neuronowi pre- lub postsynaptycznemu wymaga znacznego doświadczenia w rekonstrukcji.
3. W razie potrzeby policz bulony aksonalne i/lub kolce dendrytyczne. Ponieważ kolce, a nawet podtypy kręgosłupa i bulony aksonalne mogą wykazywać specyficzny rozkład i gęstość w odniesieniu np. do warstwy lub obszaru kory mózgowej, może to pomóc w scharakteryzowaniu typów komórek neuronalnych.
4. W przypadku par neuronów sprzężonych synaptycznie sprawdź aksony presynaptyczne i dendryty postsynaptyczne pod kątem bliskich przystawek przy najwyższym dostępnym powiększeniu. Obserwuj atak aksonalny i postsynaptyczny dendrytyczny kręgosłup lub trzon znajduje się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, co można uznać za domniemany kontakt synaptyczny. Zaznacz ten kontakt w rekonstrukcji.
5. Skoryguj rekonstrukcje neuronów pod kątem skurczu we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych w odpowiedniej sekcji programu śledzenia.
   UWAGA: Podczas utrwalania, obróbki histochemicznej i odwodnienia dochodzi do znacznego odkształcenia mechanicznego i skurczu; Wpłynie to na pomiary długości aksonów i dendrytów oraz poważnie zniekształci ich układ przestrzenny. Współczynniki korekcji skurczu dla medium do zatapiania wynoszą ~1,1 dla kierunków x i y oraz ~2,1 dla kierunku z³⁷.
6. Do ilościowej analizy morfologicznej należy użyć programu do analizy danych dla neurofizjologii (patrz Tabela Specyficznych Materiałów/Sprzętu).

Wyniki

Sparowane nagrania są metodą z wyboru do dogłębnej charakterystyki morfologicznie zidentyfikowanych jedno- lub dwukierunkowych połączeń synaptycznych, jak również połączeń szczelinowych (elektrycznych) (Rysunek 1). Przykład sparowanego nagrania w warstwie 4 somatosensorycznej kory beczkowej pokazano na rysunku 1A. Można scharakteryzować zarówno jednokierunkowe pobudzające, jak i hamujące połączenia synaptyczne (ryc. 1B, C). Ponadto sparowane nagrania pozwalają na nagrywa...

Dyskusja

Sparowane zapisy z synaptycznie sprzężonych neuronów pobudzających i/lub hamujących są bardzo wszechstronnym podejściem do badania mikroobwodów neuronalnych. Takie podejście pozwala nie tylko oszacować łączność synaptyczną między typami neuronów, ale także pozwala określić funkcjonalne cechy połączenia i morfologię neuronów pre- i postsynaptycznych. Co więcej, agonista i/lub antagonista mogą być łatwo aplikowani na neurony w preparatach w plastrach. Pozwala to na badanie wpływu neuromodulatorów na właściwości przekaźnict...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wzmacniacz	HEKA	EPC 10 USB Triple	z 2 - 3 przedwzmacniaczami
Mikroskop	Olympus	BX51WI	z 2 portami kamery, obiektywem 4X i obiektywem 40X zanurzonym w wodzie
Kamera	TILL Photonics	VX55	CCD na podczerwień
Stacja robocza	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	z zmotoryzowanym stolikiem x-y i zmotoryzowaną osią ostrości do mikroskopu
Mikromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5	x-y-z manipulatory do 2 - 3 przedwzmacniaczy
Klatka Faradaya	Luigs & Neumann
Stół antywibracyjny	Newport Spectra-Physics
Patchmaster	HEKA
Microtome	Microm International	HM650V
Ściągacz do mikropipet	HEKA	Sutter P-97
System Neurolucida	Microbrightfield		z oprogramowaniem Neurolucida i Neuroexplorer