Modele zwierzęce są często wykorzystywane do naśladowania poważnych uszkodzeń kości w badaniach biomedycznych. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, ustalenie ustabilizowanych zmian kostnych u myszy wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W tym artykule opisujemy prostą metodę ustalania i analizowania eksperymentalnych wad kości udowej u myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Prosty model ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chociaż kość ma niezwykłą zdolność do regeneracji, poważne urazy kości często skutkują uszkodzeniami, które nie goją się prawidłowo. W rzeczywistości jedna dziesiąta wszystkich złamań kości kończyn nie goi się całkowicie ze względu na zakres urazu, chorobę lub wiek pacjenta. Nasza zdolność do poprawy strategii regeneracji kości jest krytycznie zależna od zdolności do naśladowania poważnych urazów kości u zwierząt doświadczalnych, ale generowanie i stabilizacja dużych zmian kostnych jest technicznie trudne. W większości przypadków poważny uraz kości długiej jest naśladowany eksperymentalnie poprzez ustalenie defektu, który nie goi się w sposób naturalny. Osiąga się to poprzez całkowite usunięcie segmentu kostnego, który jest większy niż 1,5-krotność średnicy przekroju poprzecznego kości. Kość jest następnie stabilizowana za pomocą metalowego implantu, aby utrzymać prawidłową orientację krawędzi złamania i umożliwić mobilność.
Ze względu na ich mały rozmiar i kruchość ich długich kości, ustalenie takich zmian u myszy wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W związku z tym modele ubytków kości długich są ograniczone do szczurów i większych zwierząt. Niemniej jednak myszy dają znaczące korzyści badawcze, ponieważ mogą być genetycznie modyfikowane i hodowane jako szczepy o obniżonej odporności, które nie odrzucają ludzkich komórek i tkanek.
Tutaj demonstrujemy technikę, która ułatwia generowanie segmentalnego defektu w kości udowej myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i weterynaryjnego. Przy odrobinie wprawy wyprodukowanie urządzenia mocującego i implantacji chirurgicznej jest możliwe dla większości przeszkolonych lekarzy weterynarii i personelu badawczego na zwierzętach. Korzystając z przykładowych danych, udostępniamy również metodologie analizy ilościowej gojenia się kości dla modelu.
Wprowadzenie
Szacuje się, że połowa populacji USA dozna złamania do 65. roku życia1. W przypadku pacjentów, u których złamania leczono chirurgicznie, 500 000 procedur obejmuje zastosowanie przeszczepu kostnego2, a liczba ta prawdopodobnie wzrośnie wraz z postępującym starzeniem się społeczeństwa3. Choć kość jest jednym z niewielu organów zdolnych do całkowitego wygojenia bez powstawania blizn, zdarzają się przypadki, w których proces ten nie powodzi się3,4. W zależności od okoliczności i jakości leczenia od 2% do 30% złamań kości długich nie goi się prawidłowo, prowadząc do braku zrostu3,5. Mimo że definicja ta jest wciąż przedmiotem dyskusji, rzekomy staw (pseudoartroza) oraz urazy kostne o rozmiarze krytycznym lub brak zrostu odnosi się zazwyczaj do urazu, który nie goi się w naturalnym cyklu życia badanego obiektu6. W celach eksperymentalnych czas ten skraca się do średniego czasu wymaganego do całkowitego wygojenia urazu kości o przeciętnej wielkości. Zmiany kostne z brakiem zrostu występują z wielu powodów, jednak głównymi czynnikami są: ciężka trauma prowadząca do powstania szczeliny o rozmiarze krytycznym, infekcja, słaba angiogeneza, palenie tytoniu lub ograniczona zdolność do osteoregeneracji spowodowana chorobą lub wiekiem7. Nawet jeśli brak zrostu zostanie pomyślnie leczony, koszt jednej procedury może przekroczyć 60 000 USD, w zależności od rodzaju urazu i zastosowanych metod8.
W przypadkach o umiarkowanym nasileniu stosuje się autologiczne przeszczepy kostne. Strategia ta polega na pobraniu kości z miejsca dawcy i implantacji w miejscu urazu. Chociaż podejście to jest niezwykle skuteczne, objętość dostępnej kości pochodzącej od dawcy jest ograniczona, a procedura wymaga dodatkowej operacji, co u wielu pacjentów skutkuje uporczywym bólem9,10. Ponadto skuteczność autologicznego przeszczepu kostnego zależy od stanu zdrowia pacjenta. Substytuty kostne wykonane z materiałów syntetycznych lub przetworzonej kości zwłokowej są szeroko dostępne11-13, lecz posiadają istotne ograniczenia, w tym słabe właściwości adhezyjne komórek gospodarza, zmniejszoną osteokonduktywność oraz ryzyko odrzucenia immunologicznego14. Istnieje zatem pilna potrzeba opracowania technologii regeneracji kości, które byłyby bezpieczne, skuteczne i powszechnie dostępne.
Nasza zdolność do udoskonalania strategii regeneracji kości jest krytycznie zależna od możliwości odwzorowania poważnych urazów kostnych u zwierząt doświadczalnych, jednak tworzenie i stabilizacja dużych ubytków kostnych stanowią wyzwanie techniczne. W większości przypadków poważne urazy kości długich imituje się eksperymentalnie poprzez stworzenie defektu, który nie ulegnie naturalnemu zagojeniu. Choć może to być zależne od gatunku15, osiąga się to poprzez całkowite usunięcie segmentu kości, którego długość przekracza 1,5-krotność średnicy przekroju kości16. Następnie kość stabilizuje się za pomocą metalowego implantu, aby zachować właściwą orientację krawędzi złamania i umożliwić mobilność. Ze względu na niewielkie rozmiary i kruchość kości długich u myszy, tworzenie takich ubytków wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W związku z tym modele defektów kości długich ograniczają się do szczurów i większych zwierząt. Niemniej jednak myszy oferują istotne zalety badawcze, ponieważ mogą być modyfikowane genetycznie i hodowane jako szczepy z niedoborem odporności, które nie odrzucają ludzkich komórek i tkanek.
W zastosowaniach opartych na ludzkich komórkach myszy z niedoborem odporności są atrakcyjnym modelem badawczym, ponieważ są one dobrze scharakteryzowane fizjologicznie, łatwe w utrzymaniu, ekonomiczne oraz podlegają łatwej analizie radiologicznej i histologicznej. Kluczowe jest to, że myszy z niedoborem odporności nie odrzucają komórek z innych gatunków, w tym z gatunku ludzkiego. Ich niewielki rozmiar pozwala również na testowanie bardzo małych liczb komórek lub objętości rusztowań eksperymentalnych w zastosowaniach ortopedycznych. Opisano kilka mysich modeli ortopedycznych, które zapewniają różny stopień stabilności kości17,18. Systemy zapewniające bardzo wysoką stabilność, takie jak stabilizatory zewnętrzne i płyty blokowane, goją się głównie poprzez kostnienie błoniaste, choć zgłaszano również gojenie chrzęstno-kostne19. W przeciwieństwie do nich, systemy dopuszczające pewien stopień mikro- i/lub makroruchów, np. te wykorzystujące nieustabilizowane lub częściowo ustabilizowane gwoździe śródszpikowe, zazwyczaj goją się z przewagą kostnienia chrzęstnego20,21. Defekty z opóźnionym zrostem lub brakiem zrostu kości długich są szczególnie trudne do uzyskania u myszy ze względu na wymaganą dodatkową stabilizację. Jednakże opisano szereg podejść, w tym zastosowanie gwoździ śródszpikowych z gwoździem blokowanym, płyt blokowanych oraz stabilizatorów zewnętrznych22. Systemy te zazwyczaj działają dobrze, ale ze względu na ich skomplikowaną konstrukcję mogą być technicznie trudne w implantacji. Na przykład Garcia et al.23 opracowali elegancki system gwoździ blokowanych do zastosowania u myszy, jednak procedura ta wymaga nacięć w dwóch oddzielnych miejscach i rozległej modyfikacji kości udowej w celu dopasowania gwoździ. Procedury te były przeprowadzane pod mikroskopem dissectingowym.
W niniejszym opracowaniu opisujemy prosty gwóźdź śródszpikowy kości udowej z centralnym kołnierzem, zaprojektowany w celu zapobiegania zamykaniu się 3 mm ubytku kostnego oraz wyznaczenia pierwotnych krawędzi defektu. Chociaż gwóźdź nie był utrwalony do samej kości, precyzyjne dopasowanie średnicy gwoździa oraz rozwiercanie jamy szpiku zapewniają wystarczające zaklinowanie, aby zminimalizować ruchy skrętne (Rycina 1). Dzięki starannemu doborowi myszy inbredowych o tym samym wieku, płci i szczepie, wynikiem jest wysoce powtarzalny ubytek z przerostowym brakiem zrostu22, który można łatwo ocenić radiologicznie. Ponadto, po mikrotomografii komputerowej (µCT), można powtarzalnie zdefiniować obszary zainteresowania w celu pomiaru tworzenia kości de novo oraz parametrów histomorfologicznych. Gwoździe zostały opracowane prototypowo w naszym laboratorium przy użyciu ogólnodostępnych narzędzi.
Rysunek 1: Zasada eksperymentu. Schematyczne podsumowanie modelu ubytku segmentowego. Centralny odcinek o długości 3 mm kości udowej myszy o długości 9-10 mm jest usuwany chirurgicznie (lewo). Chirurgiczna rurka ze stali o średnicy 19 G i długości 3 mm jest nasuwana na rurkę ze stali nierdzewnej o średnicy 22 G i długości 9 mm, a następnie mocowana klejem dokładnie w centrum (prawo). Powstały pin jest wprowadzany do kanałów szpikowych pozostałych części proksymalnej i dystalnej kości udowej, przy czym kołnierz 19 G zastępuje 3 mm segmentu kości (poniżej, centrum).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Niniejszy protokół został opracowany dla samic myszy nago (Nu/J) (18-25 g, 6 tygodni) pozyskanych z Jackson Laboratories. Ponieważ szczepy myszy różnią się nieznacznie pod względem anatomii i tempa wzrostu, zalecamy, aby proces wykonania pinów został zoptymalizowany pod kątem szczepu, płci i wieku biorców przed implantacją u żywych osobników. Jeśli szczepy są dokładnie dopasowane, pasowanie ciasne między pinem a jamą szpiku jest wysoce powtarzalne. Procedury dotyczące kwaterowania, diety i ogólnego chowu zwierząt wykraczają poza zakres niniejszego protokołu, jednak wszystkie myszy były utrzymywane zgodnie z Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition) oraz politykami instytucjonalnymi ustalonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Department of Comparative Medicine (DCM) w Scott and White Hospital.
1. Wytwarzanie pinów
Rysunek 2: Montaż pinu. (A) Fotografie stalowych rurek chirurgicznych na różnych etapach montażu oraz cylinder o średnicy 4 mm wycięty z arkusza Gelfoam o grubości 5 mm. (B) Po wypolerowaniu zmontowanego pinu (powyżej), cylinder Gelfoam jest przycinany, umieszczany na stalowym kołnierzu (środek), a następnie autoklawowany, co skutkuje otrzymaniem sterylnego pinu pokrytego wysuszonym Gelfoam. Poprawia to przyleganie komórek w miejscu urazu i utrzymuje kierunek gojenia (poniżej). (C) Wycięta kość udowa z zamontowanym pinem szpikowym. (D) Przykłady zestawów pinów o różnych grubościach i długościach, demonstrujące elastyczność tego podejścia. (E) Rekonstrukcja µCT defektu kości udowej stabilizowanego pinem, ilustrująca oddziaływanie pinu szpikowego z kością beleczkową w proksymalnym i dystalnym końcu kości udowej.
- Odetnij odcinek o długości 9 mm stalowej kaniuli hipodermicznej 22 G oraz odcinek o długości 3 mm kaniuli 19 G, używając tarczy tnącej do ciężkich zastosowań z wzmocnieniam z włókna szklanego o średnicy 23,8 mm zamontowanej na narzędziu rotacyjnym. Użyj małych szczypiec z cienkimi końcówkami, aby unieruchomić kaniulę (Rycina 2A, powyżej). Stosuj odpowiednią ochronę oczu i zachowaj ostrożność podczas obsługi narzędzia rotacyjnego.
- Nanieś niewielką ilość (około 10 µl) kleju cyjanoakrylowego na środek 9 mm trzpienia. Nasuń 3 mm kołnierz na 9 mm trzpień aż do środka i przekręć, aby równomiernie rozprowadzić klej między kołnierzem a trzpieniem. Zmierz wymiary za pomocą suwmiarki cyfrowej i porównaj z Rycina 1. Pozostaw do utwardzenia na co najmniej 15 hr (Rycina 2A, środek).
- Użyj tarczy ściernej o ziarnistości 220 do usunięcia zadziorów i nadmiaru kleju.
- Za pomocą narzędzia rotacyjnego wypoleruj pin, używając filcowej tarczy polerskiej.
- Wypłucz wodą dejonizowaną i osusz sprężonym powietrzem.
- Sprawdź trwałość konstrukcji, nakładając tępą igłę hipodermiczną 19 G na trzpień nowo wykonanego pinu i dociskając ją do kołnierza. Upewnij się, że kołnierz wytrzymuje obciążenie około 25 g.
- Wypłucz pin w sterylnym, filtrowanym roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (Rycina 2B, góra). Upewnij się, że trzpień pinu ściśle pasuje do jamy szpikowej kości udowej, a kołnierz przylega do krawędzi przeciętej kości (Rycina 2C). Opracuj prototypy różnych konfiguracji w zależności od konkretnych celów badania i biorcy (Rycina 2D). Upewnij się, że końce pinu wnikają w kość gąbczastą diafizy, aby zmaksymalizować stabilizację i poprawić dopasowanie ciasne (Rycina 2E).
UWAGA: Zaleca się sprawdzenie dopasowania na preparatach kostnych przed implantacją u żywych myszy (np. Rycina 2C). - Użyj wykrojnika do biopsji o średnicy 4 mm, aby wyciąć cylinder z arkusza chirurgicznej gąbki żelatynowej o grubości 5 mm. Za pomocą skalpela przytnij cylinder do długości 3 mm i przejdź igłą hipodermiczną 20 G wzdłuż długości cylindra, aby stworzyć otwór (Rycina 2A, poniżej).
UWAGA: Stwierdziliśmy, że umieszczenie rusztowania żelatynowego lub kolagenowego w miejscu defektu poprawia retencję komórek i indukuje wzrost podłużny wzdłuż osi kości. - Nasuń cylinder z pianki żelatynowej na pin i wyrównaj z kołnierzem (Rycina 2B, środek), a następnie wysterylizuj w autoklawie w cyklu suchym w temperaturze 120 °C przy ciśnieniu 15 psi. Pianka żelatynowa wyschnie i ściemnieje (Rycina 2B, poniżej).
2. Technika chirurgiczna
UWAGA: Poniższa procedura została opracowana zgodnie ze wszystkimi wytycznymi określonymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8.ta edycja). Prosimy o przestrzeganie wszystkich dodatkowych zasad ustanowionych przez lokalną komisję IACUC i upewnienie się, że przed przystąpieniem do kolejnych sekcji opracowano protokół wykorzystania zwierząt zatwierdzony przez IACUC (lub odpowiedni ekwiwalent).
Rycina 3: Instrumenty chirurgiczne. (A) Zestaw chirurgiczny. Mikrowiertarka (1), tarcza tnąca (2), szew wchłanialny (3), szew zewnętrzny (4), ostrza skalpela (5), rękojeść skalpela (6), sterylne piny szpikowe owinięte w folię (7), głębokościomierz szpikowy wykonany z rurki hipodermicznej (8), pęseta precyzyjna (9), pęseta z ząbkami szczurzymi (10), tępe igły do rozwiercania (11), igłochwyty (12), małe kleszczyki hemostatyczne (13), nożyczki precyzyjne (14), periostotom (15), zmodyfikowana pęseta Kerna (16). (B): Modyfikacje wymagane do wykonania uchwytów kostnych typu Kern dla myszy.
- Wybierz salę zabiegową lub czyste laboratorium z zamykanymi drzwiami i bez ruchu przechodniów. Zdezynfekuj odpowiednią powierzchnię roboczą za pomocą klinicznego środka czyszczącego na bazie czwartorzędowych soli amoniowych.
- Nosząc jednorazowe sterylne rękawiczki i fartuch, przygotuj na zdezynfekowanej powierzchni roboczej pole sterylne o wymiarach około 60 x 90 cm2, używając autoklawowanych obłożeń materiałowych.
UWAGA: Zaleca się, aby asystent usuwał opakowania zewnętrzne i podawał sterylne materiały badaczowi przygotowującemu pole sterylne. - Umieść na obłożeniu zdezynfekowaną matę grzewczą podłączoną do recyrkulatora ciepłej wody i przykryj ją sterylnymi jednorazowymi obłożeniami. Rozgrzej sterylizator do koralików do temperatury roboczej (250-265 °C; proces ten trwa do 30 min).
- Na polu sterylnym rozłóż zestaw chirurgiczny (Rysunek 3A) w sposób zapewniający wygodny dostęp do wszystkich elementów. Przygotuj również sterylną gazę bawełnianą (2 x 2 cale2), sterylne patyczki higieniczne, sterylną stalową miskę (500 ml) zawierającą sterylną sól fizjologiczną (0,9% w/v) oraz aplikatory chirurgicznego środka dezynfekującego z chlorheksydyną i alkoholem izopropylowym.
- Obok pola sterylnego przygotuj aparat do znieczulania małych zwierząt z komorą indukcyjną i zestawem maski nosowej, zgodnie z wytycznymi weterynaryjnymi i instrukcją obsługi. Jako gaz zasilający zastosuj tlen klasy klinicznej oraz izofluran, USP.
Rysunek 4: Procedura chirurgiczna. (A-C) Dostęp i odsłonięcie kości udowej. (D-E) Uniesienie i cięcia. (F-K) Rewerowanie i dobór rozmiaru kanałów szpikowych.
Rycina 5: Procedura chirurgiczna. (A-B) Instalacja pinu. (C-D) Zamknięcie. (E) Typowy obraz prawidłowo umieszczonego pinu 24 h po operacji.
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej systemu anestezjologicznego i ustaw przepływ na 2 L min⁻¹.-1 O2 or stężenie izofluranu do 3% (v/v).
- Upewnij się, że mysz straciła przytomność w ciągu 1 minuty; w razie potrzeby zwiększ stężenie do 4% (v/v). Wyjmij mysz, umieść ją na sterylnym polu z podkładką grzewczą pod spodem i załóż stożek nosowy. Przekieruj przepływ gazu do stożka, zmniejsz stężenie izofluranu do 2,5%, odczekaj kolejne 20 sekund i sprawdź, czy osiągnięto odpowiednią płaszczyznę chirurgiczną, zgodnie z polityką instytucji. Zazwyczaj brak odruchu kończyny tylnej po delikatnym ściśnięciu jest wystarczający do stwierdzenia odpowiedniego poziomu znieczulenia.
- Przez cały czas trwania procesu asystent powinien monitorować prawidłowy, głęboki oddech oraz różowy kolor kończyn i okolic pyska, aby zapewnić odpowiedni poziom natlenienia podczas utraty przytomności. W razie potrzeby należy dostosować znieczulenie zgodnie z wytycznymi weterynaryjnymi i polityką instytucji. Na oczy należy nałożyć sterylną maść nawilżającą do sztucznych łez (15% (v/v) oleju mineralnego, 83% (v/v) białej wazeliny).
- Połóż mysz na boku na nowym jednorazowym podkładzie, tak aby kończyna tylna była skierowana ku górze. W razie potrzeby usuń sierść za pomocą maszynki elektrycznej lub kremu do depilacji. Przetrzyj miejsce zabiegu sterylną solą fizjologiczną i usuń podkład wraz z nadmiarem sierści. Nałóż na mysz nowy podkład z otworem, tak aby zakrył wszystkie części ciała z wyjątkiem całej kończyny tylnej (Rysunek 4A) zachowując jednocześnie widoczność pyska i łapy, aby monitorować zabarwienie tkanek oraz oddychanie.
- Zlokalizuj końce bliższy i dalszy kości udowej i wykonaj nacięcie skóry o długości 5–10 mm wzdłuż osi podłużnej (Rycina 4B). Oddziel warstwę skóry od powięzi skalpelem nr 15, odsłaniając dostęp boczny do kości udowej poprzez mięsień dwugłowy uda i mięsień obszerny bocznyZlokalizuj miejsce styku przegród obu mięśni (jest to linia białej tkanki widoczna na tle różowego zabarwienia mięśnia). Za pomocą skalpela ostrożnie przeprowadź preparację wzdłuż granicy międzymięśniowej, aż do momentu odsłonięcia kości udowej (Rysunek 4B).
- Poszerzyć nacięcie za pomocą tępego elewatora okostnowego w celu odsłonięcia całej diafizy (Rycina 4C). Za pomocą elewatora należy dodatkowo odsłonić środkową dwie trzecie kości udowej, dbając o zachowanie tylnego pęczka naczyniowo-nerwowego po stronie przyśrodkowej (Rysunek 4D). Delikatnie zeskrobać skalpelem tkankę miękką z kości, a następnie osuszyć sterylnym patyczkiem watnym lub odpowiednikiem.
- W razie potrzeby zlokalizuj środek kości udowej za pomocą suwmiarki i zaznacz go za pomocą sterylnego skalpela lub markera, a następnie wyznacz punkty 1,5 mm proksymalnie i dystalnie od środka. Delikatnie chwyć kość udową za pomocą pęsety z cienkimi końcami, wykonanej wcześniej w stylu Kern, aby zapobiec nadmiernemu naciskowi na kość.
UWAGA: Dokładne wymiary dla modyfikacji podano w Rysunek 3BZaleca się przetestowanie pęsety na utylizowanym okazie przed użyciem, aby upewnić się, że kość nie ulegnie złamaniu pod naciskiem wymaganym do unieruchomienia podczas cięcia. - Używając precyzyjnej wiertarki wyposażonej w precyzyjną tarczę tnącą powlekaną diamentem (średnica 8 mm x szerokość 0,1 mm), wykonaj pierwsze cięcie, pozostawiając w miejscu uniesienie (elevator), aby chronić tkanki znajdujące się poniżej (Rycina 4E). Podniesienie odciętej kości udowej do 45° trzymając mocno koniec trzonu, wykonaj drugie cięcie, usuwając segment o długości 3 mm.
UWAGA: Na tym etapie zaleca się stosowanie ochrony twarzy. - Przy unieruchomieniu kości za pomocą pincety, należy ostrożnie rozwiercić jamy szpikowe obu końców, używając tępego igły hipodermicznej 23 G. Wykorzystując gotowy wzornik głębokości wykonany z odcinka kaniuli 22 G umieszczonej w kaniuli 19 G (Rycina 3A, ipunkt 8), oceń głębokość rozwierconego kanału szpikowego i upewnij się, że wynosi ona 3 mm (Rycina 4F-K). Jeśli jama szpiku stawia opór zgłębnikowi 22 G, należy ponownie ją rozszerzyć tępą igłą hipodermiczną 22 G.
- Ostrożnie wprowadź gwoźdź śródszpikowy do bliższej, a następnie dalszej jamę szpikową, aby przywrócić kości udowej jej pierwotną długość i utworzyć stabilną szczelinę o szerokości 3 mm (Rycina 5A, B). W razie potrzeby należy zastosować niewielki nacisk manualny, aby uzyskać dobre pasowanie ciasne pręta z kością korową uda. Należy upewnić się, że pin ściśle przylega do jam szpikowych po obu stronach, a krawędzie przeciętej kości znajdują się na poziomie kołnierza. W przypadku wystąpienia szczeliny należy ponownie rozszerzyć kanał za pomocą tępej igły 22 G.
- Przywrócić położenie mięśnia i tkanki obwodowej nad pinu i zamknąć szwem ciągłym wchłanialnym 5-0 (Rycina 5C). Zamknąć nacięcie skóry, stosując 5–7 szwów nylonowych 5-0 wiązanych węzłem kwadratowym, a następnie uszczelnić klejem chirurgicznym (Rysunek 5D).
3. Procedury pooperacyjne
- Po zamknięciu nacięcia skóry przerwać podawanie znieczulenia, pozostawiając jednak przepływ O2 aż do momentu, gdy mysz zacznie się poruszać; powinno to zająć mniej niż 1 min. Jeśli mysz pozostaje nieruchoma po 5 min podawania O2, należy postąpić zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi interwencji weterynaryjnej.
- Gdy mysz zacznie się poruszać, delikatnie przenieść ją do klatki, najlepiej zawierającej suchą, autoklawowaną ściółkę.
- W każdej klatce umieścić gniazdo typu igloo, w którym mysz będzie mogła się schronić, co ograniczy jej aktywność. Sprawdzić, czy mysz odzyskuje sprawność kończyn tylnych 5-10 min po odzyskaniu przytomności.
- Przeprowadzać codzienny monitoring pooperacyjny zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi. Przez pierwsze 5-7 dni dostarczać żelowaną wodę oraz pokarm na dnie klatki; podawać leki przeciwbólowe i monitorować stan pooperacyjny zgodnie z zatwierdzonymi procedurami instytucjonalnymi.
UWAGA: Podajemy 0,05-0,1 mg kg-1 buprenorfiny24 w 0,25 ml soli fizjologicznej podskórnie, dwa razy dziennie przez pierwsze 3 dni, a następnie w przypadku, gdy mysz nie odzyska pełnej sprawności.
- Po pierwszych 24 h rekonwalescencji wykonać obrazowanie rentgenowskie żywego zwierzęcia w znieczuleniu, aby zweryfikować położenie pinu (Rysunek 4E). W przypadku przemieszczenia pinu rozważyć natychmiastową operację korekcyjną.
- W 7. dobie po operacji usunąć szwy w znieczuleniu i przenieść zwierzęta do grup zgodnie z instytucjonalnymi zasadami chowu zwierząt.
- Po 2-5 tygodniach przeprowadzić humanitarną eutanazję zwierząt zgodnie z metodami zatwierdzonymi przez American Veterinary Medical Association25.
UWAGA: Dożylne wstrzyknięcie dostępnego w handlu koktajlu eutanazyjnego na bazie barbituranów jest skuteczne i humanitarne, jednak należy przestrzegać lokalnych wytycznych instytucjonalnych dotyczących eutanazji. - Ostrożnie wypreparować kończynę tylną, odsłaniając proksymalną część kości udowej i miednicę od strony przyśrodkowej. Delikatnie nacisnąć staw do wewnątrz od strony bocznej kończyny, oddzielając głowę kości udowej od acetabulum (panewki stawu biodrowego) za pomocą skalpela. Odciąć pozostałe mięśnie i skórę ostrym skalpelem lub mikronożyczkami, uwalniając całą kończynę z miednicy. Za pomocą ostrych kleszczy typu rongeur lub ciężkich nożyczek odciąć dolną część kończyny tylnej (goleniu/strzałce) około 5 mm poniżej stawu kolanowego.
UWAGA: Zaleca się, aby wszystkie próbki były przechowywane w identyczny sposób przed analizą. - Usunąć skórę, pozostawiając mięśnie w miejscu. Utrawić tkankę w 10% buforowanej formalinie z dodatkiem 10 mM CaCl2 przez 1 tydzień, a następnie przechowywać w soli fizjologicznej z dodatkiem 10 mM CaCl2 do 1 miesiąca przed obrazowaniem. Utrwalanie i przechowywanie należy prowadzić w temperaturze 4 °C. Alternatywnie można skanować próbki natychmiast, bez utrwalania.
4. Analiza preparatów
UWAGA: Gojenie kości można oceniać za pomocą wielu różnych metodologii, które wykraczają poza zakres niniejszego protokołu. Poniżej przedstawiono metodę, którą z sukcesem zastosowaliśmy przy użyciu mikrotomografii komputerowej (µCT) preparatów. Zaleca się, aby następujące parametry zostały początkowo przetestowane, a następnie zoptymalizowane pod kątem konkretnych potrzeb projektu.
- Owiń preparat cienką warstwą folii uszczelniającej i umieść go pionowo w komorze instrumentu. Upewnij się, że kość udowa jest prostopadła do stolika z próbką przez cały czas trwania skanowania. Ustaw parametry skanowania w następujący sposób: voltage = 29 kV, current = 661 µA, power = 19 W, image pixel size (μm) = 21.00; 360 degree rotation = yes; frame averaging = on (5); rotation step (deg) = 1.00, random movement = on. Zapisz obrazy jako pliki JPEG w jednym folderze docelowym dla każdego skanowania (np. Rysunek 6A).
UWAGA: Skanowanie powinno zakończyć się w ciągu 57 min. - Użyj oprogramowania do rekonstrukcji, aby wygenerować obrazy osiowe na podstawie następujących parametrów: smoothing = on (4), misalignment compensation = on, ring artifact reduction = on (5), beam-hardening correction (40%), CS rotation (deg) = 0.00. Ustaw zakres wyjściowy od 2 000 do 15 000 jednostek Hounsfielda. Zapisz obrazy jako pliki JPEG w jednym folderze docelowym dla każdego skanowania.
- Korzystając z obrazów osiowych i oprogramowania analitycznego, zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI), wyznaczając najpierw krawędzie proksymalną i dystalną pierwotnego defektu. Zrób to, wybierając przekroje obejmujące wyłącznie kołnierz. Ponieważ kołnierz jest grubszy niż gwoźdź śródszpikowy, przekroje te są łatwe do zdefiniowania (Rysunek 6B, lewo). Wyklucz kołnierz z obliczeń, rysując wokół niego strefę wykluczenia (z marginesem 100 µm), a następnie przenieś tę strefę na każdy z przekrojów w ROI (Rysunek 6B, prawo).
UWAGA: Polarne momenty bezwładności, rekonstrukcje 3D oraz obliczenia, takie jak objętość nowej kości (Rysunek 6C, D), można łatwo uzyskać za pomocą oprogramowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Myszy zazwyczaj odzyskują przytomność i ruchomość kończyn tylnych od 5 do 10 minut po wycofaniu znieczulenia. W ciągu pierwszych 5 dni zaleca się trzymanie myszy indywidualnie oraz wprowadzenie wzbogacenia środowiskowego, aby zapobiec nadmiernemu obciążeniu kończyny. W tym celu gniazda typu igloo ograniczają potrzebę budowania gniazda i sprzyjają odpoczynkowi. Zaobserwowaliśmy również, że podawanie pokarmu i hydrożelu bezpośrednio na dno klatki zmniejsza prawdopodobieństwo przemieszczenia się pinów. W okresie 5 dni leki ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu opisujemy prostą metodę generowania krytycznej wielkości stabilizowanego szpilkowo ubytku mysiej kości udowej przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i weterynaryjnego. Chociaż montaż szpilek i sam zabieg chirurgiczny wymaga praktyki, leży w zakresie możliwości dobrze wyszkolonego naukowca zajmującego się badaniami biomedycznymi lub weterynarza.
Szpilka jest umieszczana w kanale szpikowym bez dodatkowego mocowania, dzięki czemu procedura jest technicznie bardziej wykona...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy personelowi i weterynarzom z Oddziału Medycyny Porównawczej Szpitala Scott & White, Temple, Texas, za ich nieocenione rady i pomoc podczas rozwoju tej techniki. Praca ta została częściowo sfinansowana przez The Institute for Regenerative Medicine Program Funds, grant Scott & White RGP #90172, NIH 2P40RR017447-07 i NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Dziękujemy dr Suzanne Zeitouni za korektę manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw pinów | |||
| Narzędzie obrotowe Dremel | 8220 | lub równoważne | |
| Wytrzymałe koło do cięcia | Dremel | 420 | |
| Rurki chirurgiczne 19 G | Małe części (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0,889 mm |
| Rurka chirurgiczna 21 G | Małe części (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0,82 mm, ID 0,635 mm |
| Rurka chirurgiczna 22 G | Małe części (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0,719 mm, ID 0,502 mm |
| Rurka chirurgiczna 23 G | Małe części (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0,643 mm, średnica wewnętrzna 0,444 mm |
| Klej cyjanoakrylowy | Loctite | 1365882 | |
| Ściernica | Dremel | 413 | |
| Gumowy trzpień polerski | Dremel | 462 | |
| Filcowa tarcza polerska | Dremel | 414 | |
| Gąbka żelatynowa | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Nóż do biopsji stempla | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/pooperacyjny | |||
| Ciepła podkładka i pompa cyrkulacyjna | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Zasięg czwartorzędowy spray | Steris | 1429-77 | |
| Sterylizator koralików | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| System anestezjologiczny | VetEquip Inc | 901806 lub 901807/901809 | |
| Izofluoran znieczulający | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Chirurgiczny środek dezynfekujący | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Narzędzia chirurgiczne | Narzędzia do nauki pięknej | różne | polecają Niemiecka |
| ochrona twarzy | Splash Shield | 4505 | |
| Akumulatorowa wiertarka szybkoobrotowa | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamentowa tarcza tnąca | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Szwy wchłanialne | Covidien | UM-213 | |
| Szwy zewnętrzne | Ethicon | 668G | lub odpowiednik |
| Vetbond | 3M | 1469SB | lub równoważny |
| Żel nawilżający | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Żel dietetyczny | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorfina | Reckitt i Benckser | 12496-0757-01 | substancja kontrolowana |
| Igloo myszy | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Koktajl eutanazyjny | Euthasol/Virbac | 710101 | substancja |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | lub równoważny |
| Jednostka Micro-CT i oprogramowanie | Bruker | Skyscan1174 | lub równoważne |
| Folia uszczelniająca/Parafilm M | VWR lub Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Źródła ogólne są odpowiednie dla wszystkich innych przedmiotów, takich jak gause, zasłony, odzież ochronna, sprzęt do pielęgnacji zwierząt. | |||
Bibliografia
- Brinker, M. R., O'Connor, D. P. The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population. J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).
- Cheung, C. The future of bone healing. Clin Podiatr Med Surg. 22, 631-641 (2005).
- Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).
- Tzioupis, C., Giannoudis, P. V. Prevalence of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S3-S9 (2007).
- Marsh, D. Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion. Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).
- Spicer, P. P., et al. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).
- Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture. J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).
- Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The health economics of the treatment of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).
- Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review. Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).
- Boer, H. H. The history of bone grafts. Clin Orthop Relat Res. , 292-298 (1988).
- Aro, H. T., Aho, A. J. Clinical use of bone allografts. Ann Med. 25, 403-412 (1993).
- Burstein, F. D. Bone substitutes. Cleft Palate Craniofac. J. 37, 1-4 (2000).
- Kao, S. T., Scott, D. D. A review of bone substitutes. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 19, 513-521 (2007).
- Boden, S. D. Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute. Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials). J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).
- Key, J. The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures. J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration). J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49, 591-599 (2011).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J Surg Res. 147, 84-91 (2008).
- Flecknell, P. A. The relief of pain in laboratory animals. Lab Anim. 18, 147-160 (1984).
- Guidelines on the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).
- Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Bagi, C. M., et al. The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone. 38, 136-144 (2006).
- Hadjiargyrou, M., et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).
- Clough, B. H., et al. Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins. J Bone Miner Res. , (2014).
- Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).
- Jepsen, K. J., et al. Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing. J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).
- Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).
- Jee, W. S., Yao, W. Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
