Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl

Podsumowanie

Proteoliposomy są używane do badania oczyszczonych kanałów i transporterów odtworzonych w dobrze zdefiniowanym środowisku biochemicznym. Zilustrowano eksperymentalną procedurę pomiaru wypływu, w którym pośredniczą te białka. Opisano etapy przygotowania proteoliposomów, wykonywania zapisów i analizy danych w celu ilościowego określenia właściwości funkcjonalnych odtworzonego białka.

Streszczenie

Ostatnie 15 lat charakteryzowało się eksplozją zdolności do nadekspresji i oczyszczania białek błonowych z organizmów prokariotycznych, jak również z eukariontów. Wzrost ten był w dużej mierze spowodowany udanym dążeniem do uzyskania informacji strukturalnych na temat białek błonowych. Jednak zdolność do funkcjonalnego badania tych białek nie rozwija się w tym samym tempie i często ogranicza się do testów jakościowych o ograniczonej wartości ilościowej, ograniczając w ten sposób mechanistyczne wglądy, które mogą dostarczyć. Opisano test do ilościowego zbadania aktywności transportowej odtworzonych kanałów lub transporterów Cl^. Test opiera się na pomiarze szybkości wypływu Cl^- z proteoliposomów po dodaniu jonoforu K⁺ walinomycyny w celu bocznikowania potencjału błonowego. Elektroda wrażliwa na jony służy do śledzenia w czasie wypływu jonów z proteoliposomów odtworzonych w pożądanym białku. Metoda ta doskonale nadaje się do badań mechanistycznych, ponieważ pozwala na ilościowe określenie kluczowych właściwości odtworzonego białka, takich jak jego jednostkowa szybkość transportu, frakcja białka aktywnego i masa cząsteczkowa jednostki funkcjonalnej. Test może być również wykorzystany do określenia wpływu związków małocząsteczkowych, które bezpośrednio hamują/aktywują odtworzone białko, a także do testowania modulacyjnego wpływu składu błony lub odczynników modyfikujących lipidy. Tam, gdzie było to możliwe, stwierdzono, że bezpośrednie porównanie wyników uzyskanych przy użyciu tej metody jest w dobrej zgodności z wynikami uzyskanymi przy użyciu metod elektrofizjologicznych. Technika ta została zilustrowana na przykładzie CLC-ec1, wymiennika CLC typu H⁺/Cl^-, jako systemu modelowego. Test wypływu może być wykorzystany do badania dowolnego kanału/transportera przewodzącego Cl i, przy minimalnych zmianach, może być dostosowany do badania dowolnego białka transportującego jony.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad zdolność do nadekspresji i oczyszczania białek transportujących błonę znacznie wzrosła: kanały jonowe, transportery pierwotne i wtórne są teraz rutynowo oczyszczane z heterologicznych systemów ekspresji, jak również z naturalnych źródeł. Stale opracowywane są nowe podejścia do monitorowania ekspresji, poprawy i ułatwienia ekstrakcji oraz zwiększenia stabilności tych białek ^1-5. Te przełomowe odkrycia technologiczne odegrały zasadniczą rolę w wywołaniu eksplozji informacji strukturalnych na poziomie atomowym białek błonowych, co z kolei poszerzyło naszą wiedzę na temat strukturalnych podstaw ich funkcji. W przeciwieństwie do tego, nasza zdolność do badania właściwości funkcjonalnych oczyszczonych białek nie rosła w tym samym tempie, tak że w niektórych przypadkach informacjom strukturalnym o wysokiej rozdzielczości towarzyszą jakościowe dane funkcjonalne, co ogranicza naszą zdolność do ilościowego testowania przewidywań opartych na strukturze. W związku z tym opracowanie ilościowych i uogólnionych testów funkcjonalnych jest kluczowym krokiem w kierunku wyjaśnienia mechanistycznych podstaw funkcji białek błonowych.

Tutaj opisujemy test wypływu, który może być użyty do ilościowego określenia kluczowych właściwości funkcjonalnych oczyszczonych i odtworzonych kanałów i transporterów Cl^-. Zasady leżące u podstaw testu można uogólnić na różne systemy transportowe, a także na białka nietransportujące jonów. Liposomy są odtwarzane za pomocą oczyszczonych ^{kanałów /} transporterów Cl w obecności ^{dużego gradientu} Cl (ryc. 1A, B). Wypływ Cl^- jest inicjowany przez dodanie jonoforu, aby umożliwić strumień przeciwjonowy, w naszym przypadku jonofor K⁺ walinomycynę, który bocznikuje napięcie ustalone przez gradient Cl^- i ustawia początkowy potencjał błony na potencjał równowagi K^+6,7. Bez jonoforu nie dochodzi do znaczącego wypływu netto Cl^-, ponieważ zapobiega mu wytwarzanie potencjału transbłonowego. Dane są ilościowo opisane za pomocą dwóch mierzalnych parametrów (rysunek 1C): τ, stałej czasowej Cl^- wypływu, oraz f₀, frakcji liposomów niezawierających aktywnego białka. Z τ i f₀ można wyprowadzić jednostkową szybkość transportu Cl^-, frakcję aktywnych białek i masę cząsteczkową kompleksu aktywnego ⁸. Technika ta została zilustrowana tutaj przy użyciu proteoliposomów odtworzonych za pomocą CLC-ec1, dobrze scharakteryzowanego wymiennika H⁺/Cl^- typu CLC o znanej budowie i funkcji. Test ten można łatwo uogólnić na kanały lub transportery o różnej selektywności jonowej lub których aktywność zależy od obecności napięcia i / lub ligandów. Ponadto test ten można wykorzystać do określenia, czy małe cząsteczki bezpośrednio wpływają na odtworzone białko, do ilościowego określenia działania tych związków oraz do tego, jak skład błonowy lub odczynniki modyfikujące lipidy wpływają na funkcję odtworzonych kanałów i transporterów.

Protokół

1. Preparat lipidowy

1. Porcję pożądanej ilości lipidów przelać do przezroczystej szklanej probówki. Użyj polarnego ekstraktu lipidowego E. coli, ale można użyć większości kompozycji lipidowych. Jeśli lipidy są w postaci proszku, należy je ponownie zawiesić w chloroformie do stężenia 20 mg/ml. Wysuszyć lipidy w temperaturze pokojowej pod gazem_N2, aż cały rozpuszczalnik odparuje.
2. Ponownie zawiesić lipidy w pentanie i ponownie wysuszyć go stałym strumieniem gazu_N2, aby usunąć resztki śladów chloroformu. Suszyć, aż cały rozpuszczalnik wyparuje. Podczas suszenia delikatnie obróć rurkę, tak aby lipid był rozprowadzany w jednolitym filmie pokrywającym dolną jedną trzecią probówki, a nie tworzył gęstą masę na dole.
3. Dodać bufor do rozpuszczenia zawierający detergent (300 mM KCl, 50 mM kwas cytrynowy, 25 mM K₂HPO₄, pH 4,5, 35 mM CHAPS) w celu rozpuszczenia lipidów. Na tym etapie użyj innych łagodnych detergentów, jeśli białko jest słabo tolerancyjne na CHAPS.
4. Ponownie zawiesić lipidy do klarowności za pomocą sonikatora do kąpieli wodnej. Zanurz rurkę w środku kąpieli sonikatora wodnego z maksymalną mocą w krótkich (30 sek-1 min) impulsach z krótkimi (30 sek-1 min) przerwami. Rozwiązanie powinno stać się jasne.
   UWAGA: Ostateczny stopień klarowności zależy od zastosowanego konkretnego składu lipidowego. Na tym etapie możliwe są również pewne różnice między partiami, nawet wśród nominalnie identycznych lipidów. Zamglenie resztkowe jest spowodowane rozpraszaniem światła przez duże cząstki w zawiesinie, które można usunąć przez odwirowanie.
5. Inkubować zawieszone lipidy w temperaturze pokojowej przez 20-60 minut.

2. Tworzenie proteoliposomów

UWAGA: Można zastosować kilka strategii, aby wprowadzić białko rozpuszczone detergentem do liposomów. W przypadku CLC-ec1 dializa działa dobrze i dlatego jest metodą z wyboru ^6,9,10.

1. Dodaj oczyszczone białko do pożądanego stosunku białka do lipidu (P/L) (wyrażonego w μg białka/mg lipidów). Wybór wskaźnika zysków i strat zależy od celu eksperymentu.
   1. Jeśli celem jest ocena aktywności białka będącego przedmiotem zainteresowania, rozpuść je przy wysokim wskaźniku P / L, aby zmaksymalizować sygnał, ponieważ każdy liposom zawiera wiele kopii białka. Aby określić ilościowo aktywność i/lub jednostkową szybkość transportu białka, należy rozpuścić w reżimie rozcieńczenia Poissona przy niskich wskaźnikach P/L, tak aby każdy pęcherzyk zawierał średnio 1 białko. Zobacz Krok 7 i Dyskusję, aby uzyskać bardziej szczegółową analizę tego, kiedy należy używać każdego reżimu.
2. Aby określić optymalne wartości P/L dla różnych schematów, należy przeprowadzić pełne miareczkowanie aktywności w funkcji stężenia białka ^8,11-13. Jednak dla każdego białka, dla którego znana jest masa cząsteczkowa (MW, wyrażona w kDa) jednostki aktywnej, następujące wartości P/L mogą być użyte jako wstępne przypuszczenia:
   
   
3. Załaduj mieszaninę białek i lipidów do wstępnie zwilżonej rurki dializacyjnej lub kasety. Umieścić przyrząd do dializy w zlewce zawierającej 500-1 000 razy większą objętość buforu do rozpuszczania lipidów (tj. 1 l buforu na 1 ml zawiesiny lipidów) pod delikatnym mieszaniem.
   1. Zmieniaj bufor 3-4 razy w odstępach >3 godziny. Przy każdej zmianie roztworu należy umyć kasetę/rurkę i zlewkę wodą destylowaną, a następnie napełnić zlewkę świeżym buforem do rozpuszczenia. Uwzględnij odstępy 1-2 O/N dla zmiany roztworu. Dokładna liczba i czas trwania zmian roztworu zależy od dokładnego stężenia lipidów i użytych detergentów.
4. Po zakończeniu ostatniego etapu wyjąć liposomy z naczynia do dializy, podzielić je na porcje w probówkach i błyskawicznie zamrozić w płynie_N2 lub zamrozić w temperaturze -80 °C.

3. Ustawienia nagrywania

UWAGA: Zestaw do nagrywania (Rysunek 2A) składa się z dwóch komór (cylindry płaskodenne, objętość ~3-4 ml), elektrody Cl^- (patrz poniżej), pH-metru z analogowym lub cyfrowym wyjściem elektrycznym, digitizera i komputera z odpowiednim oprogramowaniem do akwizycji.

1. Podłącz elektrodę Cl^- do pH-metru, wyjście pH-metru do digitizera, który jest podłączony do komputera. Umieść elektrodę odniesienia w jednej komorze, a przewód kodujący w drugiej (Rysunek 2B).
   UWAGA: Polaryzacja przewodów jest prawidłowa, jeśli_{ΔV Cal} (patrz kroki 6.4 i 7.2) jest dodatnie.
2. Umieść komory na mieszadle z mieszadłem w komorze rejestracyjnej (Rysunek 1B). Upewnij się, że mieszadło nie dotyka elektrody.
3. Połącz komory za pomocą mostka agarowego (rysunek 2B) (100 mM KCl i 2% agarozy). Przechowuj mostki agarowe w 100 mM KCl.

4. Przygotowanie elektrody Cl^-

1. Weź starą i - być może - niedziałającą elektrodę pH. Rozbij szklaną powłokę, aby całkowicie odsłonić srebrne druty.
2. Ostrożnie usuń powłokę ze srebrnych drutów za pomocą ostrza skalpela. Oczyść przewody za pomocą dużej ilości_H2Oi EtOH.
3. Umieścić w nasyconym roztworze FeCl₃ (lub wybielaczu), aż druty pokryją się jednolitą ciemną powłoką AgCl.

5. Przygotowanie pęcherzyków jednopłytkowych

1. W noc poprzedzającą eksperymenty spęczniać 1 g kulek Sephadex G-50 w 15 ml zewnętrznego buforu (1 mM KCl, 150 mM K₂SO₄, 25 mM kwasu cytrynowego, pH 4,5) delikatnie wstrząsając (nie mieszać) przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej przed użyciem. Każdy eksperyment wymaga ~3 ml spęczniałych koralików. Utrzymuj spęczniałe kulki w temperaturze 4 °C najwyżej przez kilka dni.
2. Podczas gdy liposomy rozmrażają się w temperaturze pokojowej, wlej do każdej kolumny ~3 ml spęczniałych kulek G-50. Pozwól im wyschnąć przez przepływ grawitacyjny w temperaturze pokojowej; Zwykle zajmuje to 1-2 minuty.
3. Przygotuj pęcherzyki jednowarstwowe, wytłaczając proteoliposomy 11 razy przez mini-ekstruder przy użyciu odcięcia teflonowego o długości 0,4 m.
4. Umieść kolumnę w plastikowej rurce z okrągłym dnem. Zakręć kolumnami, aby usunąć nadmiar roztworu. Wirować przez 20-30 sekund przy 1 400 x g w wirówce klinicznej.
5. Odrzucić przepływ, umieścić kolumnę w szklanej probówce o wymiarach 13 x 100 mm i dodać 100 μl wytłaczanych pęcherzyków do kolumny. Wirować kolumnę przez 1 minutę przy 500 x g w wirówce klinicznej.
6. Zbierz ~200 μl przepływu, który zostanie dodany do komory rejestrującej w kroku 6.5.

6. Pomiar wypływu

1. Umieścić 2 ml 100 mM KCl w komorze odniesienia (mielonej) i 1,8 ml buforu zewnętrznego (1 mM KCl, 150 mM K₂SO₄, 25 mM kwas cytrynowy, pH 4,5) do komory zapisu. Niewielka nierównowaga osmotyczna między roztworami wewnętrznymi i zewnętrznymi nie ma wpływu
2. Uruchom program akwizycyjny. Pozwól, aby linia bazowa się zrównoważyła, może to potrwać kilka minut.
3. Gdy sygnał osiągnie stabilną linię bazową (liposomy są gotowe, a kolumny wyschną), rozpocznij nagrywanie (Rysunek 3A).
4. Dodać 15 μl roztworu KCl o stężeniu 10 mM, aby skalibrować system (rysunek 2A).
5. Dodaj liposomy. Niewielki skok może być widoczny z powodu niepełnego usunięcia zewnętrznego Cl^- z proteoliposomów (ryc. 3A). Poczekaj, aż linia bazowa się ustabilizuje.
6. Dodać walinomycynę (1 μl w stężeniu 1 mg/ml w EtOH), aby zainicjować wypływ (ryc. 3A).
7. Pozwól wypływowi płynąć w czasie, aż osiągnie stabilizację (Rysunek 3A).
8. Dodać 40 μl 1,5 M β-oktyloglukozydu (β-OG) przygotowanego w buforze zewnętrznym, aby rozpuścić wszystkie liposomy (ryc. 3A). Zakończ nagrywanie.

7. Analiza danych

1. Wyeksportuj plik śledzenia w formacie ascii lub tekstowym i zaimportuj go do wybranego programu analitycznego.
2. Zmierz napięcie w następujących punktach (Rysunek 3A):
   Na początku nagrania (V₀);
   Po dodaniu impulsu kalibracyjnego (_{V cal});
   Po dodaniu liposomów (_lipo V);
   Na końcu wypływu (_płetwa V);
   Po dodaniu detergentu (V_tot);
   Ułóż napięcie tak, aby V₀=0.
3. Użyj równania Nernsta-Planka, aby określić eksperymentalną wartość przez pomiar
   
   Gdzie Vol_Cal jest objętością impulsu kalibracyjnego w μl, 1,800 jest objętością komory na początku doświadczenia wyrażoną w μl, [Cl]_cal/in to stężenia Cl^- impulsu kalibracyjnego i buforu zewnętrznego w mM, a ΔV_cal jest skokiem w mV mierzonym po impulsie kalibracyjnym.
   UWAGA: To empiryczne określenie α służy trzem celom: zapewnia, że system reaguje prawidłowo, oferuje miarę spójności odpowiedzi instrumentu między eksperymentami, a także sprawdza, czy nie popełniono błędów podczas tworzenia roztworu.
4. Oblicza się stężenia Cl po każdym etapie w następujący sposób:
   
   
   
   Współczynnik 3/400 wynika z rozcieńczenia impulsu kalibracyjnego o pojemności 15 μl do objętości końcowej 2 000 μl.
5. Oblicz zmiany w [Cl] na każdym etapie, ΔCl_{lipo/fin/tot.}
6. Konwertuj V(t) w Cl(t) z
   
   Bezpośrednio określ wartości [Cl] w punktach krytycznych i porównaj je z obliczonymi wartościami w ramach kontroli wewnętrznej.
7. Znormalizuj ślad tak, aby Cl_rel^lipo=0 i Cl_rel^tot=1
   
8. Dopasuj przebieg czasu wypływu do następującego równania:
   
   Gdzie L jest szybkością wycieku Cl^-, którą określa się doświadczalnie przez pomiar wypływu Cl^- z liposomów bezbiałkowych przygotowanych w tych samych warunkach, a τ jest stałą czasową procesu.
9. Oblicz v, prędkość początkowa:
   
   Gdzie_płetwa ΔCl jest wyrażona w milimolach, a V oznacza objętość komory w μl.
10. Oblicz szybkość transportu/konduktancję
    
    Gdzie p jest P/L, MW jest masą cząsteczkową kompleksu aktywnego wyrażoną w kDa

Wyniki

Opisujemy szczegółowy i solidny protokół pomiaru transportu Cl^- za pośrednictwem oczyszczonego CLC-ec1, prokariotycznego wymiennika H⁺/Cl^- typu CLC, odtworzonego w liposomach. Schematyczne przedstawienie eksperymentu pokazano na rysunku 3. Proteoliposomy odtworzone oczyszczonym CLC-ec1 i zawierające wysoki wewnętrzny Cl^- zanurza się w roztworze kąpieli zawierającym niską zawartość Cl^-. W tych warunkach wypływ netto Cl^- jest zapobiegany prz...

Dyskusja

Opisaliśmy szczegółowy protokół pomiaru transportu Cl^- , w którym pośredniczą oczyszczone kanały selektywne aniony lub transportery odtworzone w liposomach. Przykładem był prokariotyczny wymiennik H⁺/Cl^- CLC-ec1. Metodologię tę można jednak łatwo dostosować do badania kanałów bramkowanych ligandami ^12,13,15, napięciem ^11,12 lub o różnej selektywności anionowej ^15,16 poprzez zastąpienie elektrody Ag:AgCl elektrodą odpowiednią dla rozważanego jonu. Elektrody...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Stacjonarny	Thermo Scientific
Orion Research Model 701A Cyfrowy miernik			Można je znaleźć w serwisie Ebay.
Niedziałająca sonda			Każda sonda pH-metru ze srebrnymi drutami będzie działać. Powłokę szklaną/plastikową należy usunąć, a przewody oczyścić.
Rejestrator danych DI-710	Instrumenty
Oprogramowanie do akwizycji WinDAQ	Instrumenty
Pierce Jednorazowe kolumny plastikowe, przepływ grawitacyjny, 2ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
Probówki hodowlane KIMAX, jednorazowe, szkło borokrzemianowe	Kimble Chase	73500-13100
Zestaw wytłaczarki z uchwytem/blokiem grzewczym	Avanti Polar Lipids Inc.	Komputer 610000