Tutaj prezentujemy protokół, jak określić ilość i rozkład metali w próbce za pomocą synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej. Skupiamy się na komórkach przylegających i opisujemy metodę chemicznego utrwalania w celu przygotowania tej próbki. Następnie opisujemy, jak zamontować i zobrazować próbkę za pomocą synchrotronowego promieniowania rentgenowskiego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie komórek adherentnych do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej metodą utrwalania chemicznego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie fluorescencji rentgenowskiej pozwala nam nieniszcząco mierzyć rozkład przestrzenny i koncentrację wielu pierwiastków jednocześnie na dużych lub małych obszarach próbki. Znalazł zastosowanie w wielu dziedzinach nauki, w tym w materiałoznawstwie, naukach o Ziemi, badaniu dzieł dziedzictwa kulturowego oraz w biologii chemicznej. Na przykład w przypadku biologii chemicznej wizualizacja rozmieszczenia metali w komórkach pozwala nam badać zarówno naturalnie występujące w komórkach jony metali, jak i egzogennie wprowadzone metale, takie jak leki i nanocząstki. Ze względu na w pełni uwodniony charakter prawie wszystkich próbek biologicznych, krioutrwalanie, po którym następuje obrazowanie w temperaturze kriogenicznej, stanowi idealną dostępną obecnie metodę obrazowania. Jednak w okolicznościach, w których taka kombinacja nie jest łatwo dostępna lub praktyczna, chemiczne wiązanie na bazie aldehydu pozostaje użyteczne, a czasem nieuniknione. W artykule tym opisano jak najbardziej szczegółowo przygotowanie przylegających komórek ssaków przez chemiczne utrwalanie do obrazowania fluorescencyjnego promieniowaniem rentgenowskim.
Wprowadzenie
Obrazowanie fluorescencyjne rentgenowskie pozwala na przestrzenne określenie zarówno tożsamości, jak i ilości pierwiastków obecnych w próbce. Padające promienie rentgenowskie o energii wybranej jako większa niż energia wiązania elektronów najcięższego pierwiastka będącego przedmiotem zainteresowania, pokonują energię wiązania elektronów powłoki wewnętrznej z jądrem1. W ten sposób powstaje "" w powłoce elektronowej. Gdy elektrony o wyższej energii opadają do tych, emitowane są fluorescencyjne promieniowanie rentgenowskie, którego długość fali zależy od separacji energetycznej tych orbitali. Ponieważ odstępy energetyczne orbitali są charakterystyczne dla dane....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie instrumentów, substratów, pożywek hodowlanych i potraw
- Obsługa okien z azotku krzemu (Si,3, N, 4).
- Kapsułkę należy lekko otworzyć, ściskając jeden koniec zawierający okienko w taki sposób, aby nie ściskać samego okienka, jednocześnie obracając drugi koniec kapsułki drugą ręką.
- Sprawdź parę odwróconych pęsety z cienką końcówką pod mikroskopem stereoskopowym, aby upewnić się, że na końcówce nie ma kleju, szczelin ani zagięć. W przeciwnym razie szyby mogą zostać wybite pęsetą lub odlecieć z nich podczas kolejnych kroków.
- Wyjmij okienko z kapsułki, ostrożnie chwytając ramę okna pęsetą, je....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zdolność obrazowania fluorescencją rentgenowską do dostarczania informacji o próbkach biologicznych zależy od przygotowania tych próbek w taki sposób, aby były one odporne na uszkodzenia radiacyjne w czasie trwania eksperymentu, a jednocześnie zachowały swoje cechy chemiczne i strukturalne. Analizując wynik obrazowania próbki przygotowanej zgodnie z powyższym opisem, można zauważyć zróżnicowanie obecnych pierwiastków — co wskazuje, że fiksacja pozwoliła zachować te aspekty komórki (Rysunek 1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obrazowanie fluorescencyjne rentgenowskie jest przydatne w wielu dziedzinach, w tym w naukach o Ziemi, materiałoznawstwie i biologii chemicznej26-34. Postępy w synchrotronowym promieniowaniu rentgenowskim i jego ogniskowaniu pozwoliły na uzyskanie wiązek o bardzo wysokiej intensywności. Obecnie istnieją skoncentrowane wiązki promieniowania rentgenowskiego wystarczające do wzbudzenia metali endogennych w komórkach, wytwarzające sygnał, który można zmierzyć za pomocą obecnie dostępnej technologii krzemowych dete.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Stefanowi Vogtowi za pomoc w dopasowaniu reprezentatywnych danych pokazanych w tym artykule oraz za pomocne dyskusje. Autorzy dziękują również Chrisowi Jacobsenowi za jego wsparcie dla Q. J.
Użycie Zaawansowanego Źródła Fotonów, linii badawczych 2-ID-E i 8-BM-B, w Argonne National Laboratory było wspierane przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych, w ramach Kontraktu Nr. DE-AC02-06CH11357.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Okna z azotku krzemu | Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, Wielka Brytania | SiRN-5.0-200-2.0-200. Sortuj według rozmiaru. Rozmiar membrany: 1,5 mm x 1,5 mm. Grubość: 200 Nm. Rozmiar ramy: 5 mm x 5 mm. Grubość ramy: 200 &mikro;m. | Alternatywne źródło: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA. |
| Pęseta odwrotna | Mikroskopia elektronowa Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Bezpłatny: 800-523-5874, Faks: 215-412-8450 | 78520-5X | EMS 5X, NC – Ultra cienkie pęsety |
| Gumowa mata siatkowa | Mikroskopia elektronowa Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Bezpłatny: 800-523-5874, Faks: 215-412-8450 | 71170 | Okrągła mata siatkowa |
| Kwas octowy | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Faks: 800-325-5052 | 338826 | stężony kwas octowy klasy metali śladowych |
| RURY | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Faks: 800-325-5052 | P6757 | stały bufor PIPES |
| Roztwór podstawowy formaldehydu | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Bezpłatny: 800-523-5874, Faks: 215-412-8450 | RT 17113 | 10 x 10 ml ampułki z 20% wodnym roztworem paraformaldehydu |
Bibliografia
- Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
- Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
- Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 6....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
