Artykuł metodologiczny

Zabieg chirurgiczny resekcji żebra myszy: model do naprawy kości długich na dużą skalę

DOI:

10.3791/52375

⸱

21 stycznia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Eli and Edythe Broad Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, Keck School of Medicine, University of Southern California

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wycięcie części kości z żebra myszy. Procedura została opracowana jako model do badania naprawy kości długich na dużą skalę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wprowadza badaczy do nowego modelu naprawy kości na dużą skalę z wykorzystaniem żebra myszy. Procedura szczegółowo opisuje: przygotowanie zwierzęcia do operacji, otwarcie ściany klatki piersiowej, odsłonięcie pożądanego żebra z otaczających mięśni międzyżebrowych, wycięcie pożądanego odcinka żebra bez wywoływania odmy opłucnowej i zamknięcie nacięć. W porównaniu z kośćmi szkieletu wyrostka robaczkowego, żebra są bardzo łatwo dostępne. Ponadto nie jest konieczny żaden stabilizator wewnętrzny ani zewnętrzny, ponieważ sąsiednie żebra zapewniają naturalne mocowanie. Zabieg odbywa się przy użyciu dostępnych na rynku materiałów, jest łatwy do nauczenia i dobrze tolerowany przez zwierzę. Zabieg można przeprowadzić z usunięciem otaczającej okostnej lub bez niej, dzięki czemu można ocenić wkład okostnej w naprawę. Wyniki wskazują, że jeśli okostna zostanie zachowana, solidna naprawa następuje w ciągu 1-2 miesięcy. Oczekujemy, że zastosowanie tego protokołu pobudzi badania nad naprawą żeber, a wyniki ułatwią opracowanie nowych sposobów stymulowania naprawy kości w innych miejscach na ciele.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniszczające urazy szkieletu, przewlekła choroba zwyrodnieniowa stawów i poważne problemy związane z chirurgią rekonstrukcyjną wpływają na produktywność ekonomiczną, dobrobyt rodziny i jakość życia. Podczas gdy małe pęknięcia i zmiany chorobowe mogą goić się dość dobrze, ludzie nie są w stanie naprawić dużych defektów i dlatego muszą polegać na procedurach rekonstrukcyjnych w celu przywrócenia struktury i funkcji. Rekonstrukcja może obejmować przeszczepy allogeniczne lub heterogeniczne, morelizowaną kość, wszczepione rusztowania lub osteogenezę dywersyjną. Niestety, nie tylko istnieją trwałe czynniki chorobowości związane z tymi zabiegami, ale pierwotna wytrzymałość naprawionej kości jest rzadko osiągana. W związku z tym potrzebne są nowe podejścia kliniczne.

Jednym ze sposobów na opracowanie innowacyjnych metod leczenia wad segmentowych jest badanie sytuacji, w których naprawa na dużą skalę zachodzi naturalnie. słyną z tego, że potrafią regenerować elementy szkieletowe, podczas gdy ssaki są uważane za ograniczone w tej zdolności. Jednak od początkuXX wieku opublikowano kilka doniesień o regeneracji ludzkiego żebra sugerujących, że ludzie mogą nie być tak ograniczeni1-4 . Obecnie zjawisko to jest najlepiej znane chirurgom plastycznym, którzy wykorzystują materiał żebrowy do rekonstrukcji szczęki, twarzy i uszu, ale nie jest ono szerzej doceniane5. Aby bardziej szczegółowo zbadać tę naprawę, opracowaliśmy model chirurgiczny za pomocą myszy. Korzystając z tego protokołu, naukowcy mogą zidentyfikować zaangażowane czynniki wrodzone i wykorzystać te informacje, aby ułatwić gojenie się szkieletu w innych lokalizacjach.

Istnieje wiele zalet korzystania z żeber jako modelu do badania naprawy szkieletu. Po pierwsze, otaczające żebra stanowią naturalny stabilizator (w porównaniu z resekcją kości udowej6,7). Zmniejsza to ryzyko zachorowalności na stabilizatory wewnętrzne i zewnętrzne oraz upraszcza zabieg chirurgiczny. Po drugie, cienkie warstwy mięśniowe ściany klatki piersiowej zapewniają łatwy dostęp i doskonałą widoczność, co sprawia, że test jest porównywalny z wygodą resekcji kalwarii8. Po trzecie, w przeciwieństwie do kalwarii, które tworzą się przez kostnienie śródbłoniaste, żebra tworzą się przez kostnienie śródchrzęstne i rosną na długość poprzez rozciągnięcie na płytkach wzrostowych znajdujących się na obu końcach trzonu centralnego. Dlatego naprawa żeber może być bardziej porównywalna z naprawą kości długich szkieletu wyrostka robaczkowego. Ponadto odkryliśmy, że w porównaniu z kością udową okostna żebra jest grubsza i można nią łatwiej manipulować. W związku z tym badacze, którzy chcą przetestować naprawę kości w celu zbadania okostnej lub przetestowania terapii komórkowych, środków farmakologicznych i / lub rusztowań tkankowych, mogą uznać ten model chirurgiczny za przydatny. Podsumowując, ten model resekcji żeber zapewnia kontekst, w którym można badać naturalną naprawę kości na dużą skalę u ssaków, ponieważ obecnie nie istnieje taki model w powszechnym użyciu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury są zgodne z protokołem dla zwierząt zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Południowej Kalifornii.

1. Przygotowanie do operacji

  1. Rozłóż niezbędne narzędzia i materiały chirurgiczne (wysterylizowane, pozycje 1 - 18 w wykazie materiałów) i ustaw mikroskop preparacyjny i transoświetlacz światłowodowy w okapie lub na stole zstępującym.
  2. Umieść dojrzałą płciowo mysz (20 - 30 g, w wieku 1-3 miesięcy) w komorze indukcyjnej z 4% izofluranem w celu wywołania znieczulenia.
  3. Potwierdź znieczulenie testem szczypania łapy i/lub ogona.
  4. Nałóż maść na oczy myszy, aby uniknąć wysuszenia oczu podczas zabiegu.
  5. Przesuń mysz na stolik mikroskopu. Umieść mysz w stożku nosowym węża konserwacyjnego i ustaw ją z boku. Zapewnij rozgrzewającą saszetkę przylegającą do zwierzęcia, aby pomóc utrzymać temperaturę ciała.
    UWAGA: Pozycja myszy zależy od osobistych preferencji i/lub ręczności chirurga., zarówno lewa, jak i prawa strona jest w porządku.
  6. Dostosuj izofluran do 2 - 3% w celu konserwacji i obserwuj częstość oddechów.
  7. Wstrzyknąć buprenorfinę (0,05 mg/kg) podskórnie (boczny bok nogi) w przypadku bólu pooperacyjnego za pomocą igły 25 G. Noga może drgać, co jest normalną reakcją.

2. Otwarcie Nacięcia

  1. Wykryj pożądane żebro za pomocą badania palpacyjnego i oczyść obszar włosów za pomocą golarki.
    UWAGA: Żebra 8-10 są zalecane, ponieważ żebra 1-7 są bliżej płuc, a 11-13 są znacznie krótsze. Liczenie żeber powinno rozpocząć się od najbardziej rostralnego żebra jako numeru 1.
  2. Przygotuj obszar za pomocą naprzemiennego wymazu z jodonu i izopropanolu (70%) (3x jest często zalecane przez protokoły stosowania na zwierzętach).
  3. Wytnij 2 cm nacięcie przez skórę, bezpośrednio nad i równolegle do pożądanego żebra za pomocą średniej wielkości nożyczek mikrochirurgicznych. Naciąć przez leżące poniżej warstwy mięśni i tłuszczu.
  4. Umieść wszystkie 3 warstwy (skórę, mięśnie, tłuszcz) w retraktorze, aby odsłonić obszar operacyjny, jednocześnie minimalizując rozmiar nacięcia.

3. Wycinanie żebra

  1. Przeciąć mięśnie międzyżebrowe leżące nad żądaną częścią żebra za pomocą skalpela o średnicy 5,0 mm. Umieść to nacięcie około 5 mm proksymalnie do stawu chrzęstno-żebrnego, ponieważ jest to miejsce, w którym żebro nie jest tak mocno zakrzywione. Ostrożnie oddziel mięsień od kości za pomocą kleszczyków z cienką końcówką.
  2. Aby wykonać resekcję przy zachowaniu okostnej u zwierzęcia, przeciąć okostną wzdłuż żebra skalpelem o średnicy 5,0 mm. Ostrożnie oddziel okostną od leżącej pod nią kości z boku za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Postępuj ostrożnie, ponieważ okostna jest bardzo delikatna i ma galaretowatą konsystencję.
  3. Następnie wykonaj przekrój poprzeczny przez kość na jednym końcu za pomocą drobnych mikronożyczek. W razie potrzeby zmierz resekcję za pomocą siatki celowniczej w mikroskopie lub miernika typu linijka. Następnie ostrożnie wyjmij kość z okostnej i odetnij drugi koniec.
    UWAGA: Postępuj ostrożnie. Jest to najdelikatniejszy krok, ponieważ podciągnięcie się bez wycinania żebra poniżej spowoduje rozerwanie błony opłucnowej i spowoduje odmę opłucnową. Jeśli błona opłucnowa zostanie rozerwana, będzie to łatwo widoczne, ponieważ wnętrze klatki piersiowej stanie się widoczne.
  4. Jeśli krwawienie wystąpi w wyniku przecięcia kości, uciskaj odcięty koniec wacikiem z bawełnianą końcówką przez 4 - 5 sekund, aby zatrzymać krwawienie.
    UWAGA: W rzadkich przypadkach, gdy krwawienie utrzymuje się, może być konieczne przerwanie i eutanazja zwierzęcia, ponieważ znaczna utrata krwi zagrozi wyzdrowieniu (bez wymiany płynów maksymalna objętość krwi, którą można bezpiecznie utracić, wynosi 10% całkowitej objętości krwi lub 7,7 - 8 μl/g). W przypadku myszy o wadze 25 g odpowiada to około 180 - 200 μl9).
  5. Natychmiast umieść usunięte żebro w 4% PFA do przyszłej analizy.
    UWAGA: Jeśli ma być przeprowadzona resekcja zarówno kości, jak i okostnej, należy pominąć nacięcie i oddzielenie okostnej (krok 3.2). Ponieważ okostna jest bardzo mocno przymocowana do błony opłucnej, postępuj ostrożnie, odciągając żebro od błony opłucnej kleszczami, aby uniknąć rozerwania.

4. Zamykanie nacięcia

  1. Zszyj mięśnie międzyżebrowe nad górną częścią pozostałej tulei okostnej za pomocą szwów 9-0 (zwykle wystarczają 2 szwy). Umieść szwy bezpośrednio nad odciętymi końcami żebra, aby działały jako wskaźniki lokalizacji operacji.
  2. Wyjmij zwijacz. Zszyj leżące nad nim mięśnie i tłuszcz za pomocą szwów 9-0 (zwykle wystarczają 3 - 4 szwy). U myszy ze szczególnie grubymi warstwami mięśni i/lub tłuszczu należy zszyć każdą warstwę osobno (np. 1 warstwę szwów dla warstwy mięśniowej i 1 warstwę szwów dla warstwy tłuszczowej).
  3. Zamknij skórę szwami 7-0 (zwykle wystarcza 4-5 szwów).
  4. Zabezpiecz nacięcie klejem do szwów, ściskając krawędzie dużymi kleszkami.
  5. Powoli odzwyczaj mysz od izofluranu, najpierw dostosowując się do 1% na kilka minut, a następnie wyłącz.
  6. Umieść mysz pod lampą grzewczą i pozostaw do odzyskania przytomności, 5 - 10 min. Po odzyskaniu przytomności i przez cały okres gojenia mysz powinna normalnie się poruszać i poruszać oraz nie wykazywać żadnych oznak niepokoju.

5. Odzyskiwanie i analiza

  1. Należy zapewnić leczenie bólu pooperacyjnego, w tym podawanie buprenorfiny w postaci żelatyny w dawce 0,5 mg/kg mc. co 12 godzin przez 48 godzin. Podawanie doustne nie wymaga krępowania zwierzęcia, co może powodować ból w okolicy klatki piersiowej.
  2. Trzymaj mysz w klatce ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody w okresie gojenia. Po wyschnięciu nacięcia samice zwierząt mogą być trzymane razem, podczas gdy samce muszą pozostać odizolowane, aby zapobiec walkom.
  3. Po okresie gojenia należy postępować zgodnie z zatwierdzoną procedurą eutanazji. Zdejmij klatkę piersiową w celu zamocowania i analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta zazwyczaj szybko regenerują się po tym zabiegu, nacięcie goi się prawidłowo, a zwierzęta wykazują normalne zachowanie. Procedura wykorzystuje materiały dostępne w handlu i po przećwiczeniu może zostać wykonana w czasie krótszym niż 1 hr. Przed wykorzystaniem tej procedury do generowania danych eksperymentalnych ważne jest przeanalizowanie miejsca resekcji w punkcie czasowym dzień 0, aby ustalić, czy w strefie resekcji nie pozostały duże fragmenty kości. Jednym ze sposobów oceny prawidłowości zabiegu jest wykona...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kiedy po raz pierwszy uczysz się tego protokołu, określenie, gdzie zlokalizować początkowe nacięcie, może być trudne. Jednak praktyka na uśpionych myszach pomaga chirurgowi nauczyć się, gdzie umieścić początkowe nacięcie i odsłonić pożądane żebro do wycięcia. Praca na zwłokach poprawia również umiejętności motoryczne wymagane do usunięcia części żebrowej z okostną lub bez. Ponadto ktoś, kto jest nowy w tej procedurze, może uznać manipulowanie cienkimi narzędziami i cienkimi szwami za trudne. Podczas wiązania nadmierne po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Mariani za krytyczną lekturę manuskryptu. Naszymi źródłami finansowania były: stypendium badawcze Baxter Medical Scholar (dla M.K.S.), stypendium licencjackie USC oraz stypendia rektora, dziekana Joan M. Schaeffer i Rose Hills Fellowships (dla M.K.S.). Dziękujemy również o stypendium CIRM BRIDGES za pośrednictwem Pasadena City College (do T.T.T.). oraz Fundusz Badań i Innowacji Jamesa H. Zumberge'a, Inicjatywa Medycyny Regeneracyjnej USC oraz NIAMS NIH pod numerem nagrody R21AR064462 (dla F.V.M).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Średniej wielkości nożyczki do mikropreparacji (Vannas-Tü Nożyczki sprężynowe bingen 5 mm)Fine Science Tools15003-08
Drobne nożyczki do mikropreparacji (Nożyczki sprężynowe Vannas - krawędź tnąca 2 mm)Sharp Science Tools15000-04zakrzywiona końcówka jest korzystna
Mikro-skalpel 5,0 mmFine Science Tools10315-12można zastąpić inne drobne skalpele
Kleszcze Dumont 55Narzędzia do nauki o nauce11295-51
Zwijacz Regulacja Fine Science Tools17004-05jest wygodna
Uchwyty na mikroigłyFine Science Tools12060-01
9.0 nylonowe szwy (Ethilon), najlepiej stożkoweEthicon2819G lub podobnestożkowe miejsce, ale cięcie wsteczne jest również dobre
Szwy prolenowe 7.0 (Prolene)Ethicon8700H lub podobne6-0 mogą być również używane, końcówka igły może się różnić
Duże kleszcze (Adson Forceps)Fine Science Tools11006-12inne marki są w porządku
Maść do oczu z lubrykantem (Akwa Tears)Akorn17478-062-35
Klej do szwów (GLUture Miejscowy klej tkankowy)Abbot32046-01ma doskonały czas pracy
GolarkaWahl9918-6171 lub podobna
Lampa zaciskowaZoo MedLF-5
Żarówka na podczerwień, 75WZoo MedRS-75
RC2 System znieczulenia gryzoniVetEquip 922100
IsoFlo (Isoflurane)Abbot05260-05
Buprenorfina (Buprenex)Reckitt Benckiser12496-0757-1
BetadinePurdue Frederick67618015017
Żelatyna smakowa,galaretkaB000E1FYL0przygotowana w postaci twardej, do konsystencji "jigglers"
malinowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Philip, S. J., Kumar, R. J., Menon, K. V. Morphological study of rib regeneration following costectomy in adolescent idiopathic scoliosis. Eur Spine J. 14 (8), 772-776 (2005).
  2. Munro, I. R., Guyuron, B. Split-rib cranioplasty. Ann Plast Surg. 7 (5), 341-346 (1981).
  3. Taggard, D. A., Menezes, A. H. Successful use of rib grafts for cranioplasty in children. Pediatric neurosurgery. 34 (3), 149-155 (2001).
  4. Head, J. R. Prevention of Regeneration fo the Ribs: A problem in thoracic surgery. Archives of Surgery. 14 (6), 1215-1221 (1927).
  5. Kawanabe, Y., Nagata, S. A new method of costal cartilage harvest for total auricular reconstruction: part I. Avoidance and prevention of intraoperative and postoperative complications and problems. Plastic and reconstructive surgery. 117 (6), 2011-2018 (2006).
  6. Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 21 (4), 685-690 (2003).
  7. Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40, Suppl 4. S103-S109 (2009).
  8. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and reconstructive surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  9. Ask the Vet. JAX NOTES. 499, Available from: http://jaxmice.jax.org/jaxnotes/archive/499c.html (2005).
  10. Flecknell, P. A., Roughan, J. V., Stewart, R. Use of oral buprenorphine ('buprenorphine jello') for postoperative analgesia in rats--a clinical trial. Laboratory animals. 33 (2), 169-174 (1999).
  11. Rigueur, D., Lyons, K. M. Whole-mount skeletal staining. Methods in molecular biology. 1130, 113-121 (2014).
  12. Evans, D. J. Contribution of somitic cells to the avian ribs. Developmental biology. 256 (1), 114-126 (2003).
  13. Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130 (17), 4123-4133 (2003).
  14. Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society. 23 (6), 1300-1307 (2005).
  15. Zilberman, Y., Gafni, Y., Pelled, G., Gazit, Z., Gazit, D. Bioluminescent imaging in bone. Methods in molecular biology. 455, 261-272 (2008).
  16. Pelled, G., Gazit, D. Imaging using osteocalcin-luciferase. Journal of musculoskeletal. 4 (4), 362-363 (2004).
  17. Elefteriou, F., Yang, X. Genetic mouse models for bone studies--strengths and limitations. Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).
  18. Srour, M. K., et al. Natural large-scale regeneration of rib cartilage in a mouse. J. Bone Miner. , (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Resekcja ebra u myszymodel naprawy ko cizachowanie okostnejwyci cie ebranaprawa szkieletumi sie mi dzy ebrowychirurgia klatki piersiowejregeneracja ko cianaliza histologiczna

Powiązane artykuły