Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

12.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52383

⸱

10 marca 2015

 ,  , 
1The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research, 2The Department of Medical Biology, University of Melbourne, 3Olivia Newton-John Cancer Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Streszczenie

Modele zwierzęce nieswoistego zapalenia jelit (IBD) i raka jelita grubego (CRC) dostarczyły znaczącego wglądu w wewnętrzne i zewnętrzne mechanizmy komórek, które przyczyniają się do wystąpienia i progresji chorób jelitowych. Identyfikacja nowych cząsteczek, które sprzyjają tym patologiom, doprowadziła do lawiny działań skoncentrowanych na opracowaniu potencjalnych nowych terapii hamujących ich funkcję. W rezultacie, różne przedkliniczne modele myszy z nienaruszonym układem odpornościowym i mikrośrodowiskiem zrębu są obecnie intensywnie stosowane. W tym miejscu opisujemy trzy protokoły eksperymentalne w celu przetestowania skuteczności nowych terapii w modelach przedklinicznych (1) ostrego uszkodzenia błony śluzowej, (2) przewlekłego zapalenia jelita grubego i/lub raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelita grubego oraz (3) sporadycznego raka jelita grubego. Przedstawiamy również procedury seryjnych badań endoskopowych, które można wykorzystać do udokumentowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza i monitorowania stanu zdrowia poszczególnych myszy. Protokoły te stanowią uzupełniające się platformy eksperymentalne do testowania skuteczności związków terapeutycznych, które okazały się dobrze tolerowane przez myszy.

Wprowadzenie

Rak jelita grubego (CRC) jestczwartą najczęstszą przyczyną nowotworów złośliwych na świecie1. Pomimo znacznego postępu w naszym zrozumieniu rodzinnych podstaw tej choroby, predyspozycje genetyczne przyczyniają się tylko do ~20% przypadków CRC2. Pozostałą część przypisuje się licznym czynnikom zewnętrznym i środowiskowym, w tym przewlekłemu zapaleniu. U ludzi związek między przewlekłym stanem zapalnym a rakiem jelita grubego jest widoczny u pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego (UC), którzy mają większe ryzyko zachorowania na raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelita grubego (CAC), w zależności od czasu trwania, rozległości i ciężkości choroby zapalnej3-5. W związku z tym opracowywane są nowe terapie mające na celu kontrolowanie odpowiedzi immunologicznej i związanej z nią produkcji czynników stymulujących wzrost przez mikrośrodowisko guza zapalnego6-8. Istnieje coraz większe zapotrzebowanie na odpowiednie przedkliniczne modele zwierzęce w celu scharakteryzowania skuteczności terapeutycznej tych leków przeciwko rozwojowi i postępowi choroby.

Modele mysie jednoznacznie wykazały, że mikrośrodowisko zapalne przyczynia się do progresji CRC, nawet przy braku jawnego stanu zapalnego9,10. Modele te obejmują zastosowanie polisacharydowego siarczanu dekstranu sodu (DSS), dostarczanego do wody pitnej myszy, do modelowania uszkodzeń nabłonka oraz ostrej i przewlekłej choroby zapalnej jelit (IBD)11,12. Chociaż mechanizm, za pomocą którego DSS indukuje uszkodzenie błony śluzowej i zapalenie jelita grubego, nie jest w pełni zrozumiały, niektóre badania sugerują, że DSS hamuje aktywność odwrotnej transkryptazy komórkowej i rybonukleazy w komórkach lub sprzyja tworzeniu kompleksów nanolipidowych, które łączą się z błoną okrężnicy, prowadząc do uszkodzenia nabłonka13,14. Modyfikacje standardowego modelu DSS dostarczyły również istotnych informacji na temat mechanizmów, za pomocą których komórki nabłonka okrężnicy utrzymują homeostazę tkanek i regulują odpowiedź immunologiczną błony śluzowej15.

Dootrzewnowe podawanie Azoksymetanu (AOM) samodzielnie lub w połączeniu z DSS, dostarcza modelu do badania wzajemnych zależności między mutacjami somatycznymi w błonie śluzowej nabłonka a mikrośrodowiskiem zapalnym i zrębowym16,17. OZUŚ jest metabolitem rakotwórczej 1,2-dimetylohydrazyny (DMH), który nie powoduje bezpośrednio mutacji DNA. Zamiast tego OZUŚ jest hydrolizowany do metyloazoksymetanolu (MAM) przez izoformę cytochromu CYP2E1 w wątrobie, gdzie MAM jest sprzężony z kwasem glukuronowym, a następnie transportowany do jelita przez wydzielinę żółciową18. Uważa się, że bakteryjna β-glukuronidaza przyczynia się do degradacji MAM, co prowadzi do alkilacji DNA i akumulacji mutacji w komórkach nabłonka19. Większość nowotworów okrężnicy wywołanych przez OZUŚ zawiera mutacje typu missense w genie kodującym β-kateninę, co czyni białko odpornym na degradację proteasomalną, co powoduje nieprawidłową aktywację kanonicznego szlaku sygnałowego Wnt20. Kiedy aktywność OZUŚ jest połączona z uszkodzeniem błony śluzowej wywołanym przez DSS, wynikająca z tego reakcja gojenia się ran tworzy mikrośrodowisko, które sprzyja wzrostowi i rozszerzaniu się zmutagenizowanego nabłonka. W odmianie tego modelu, powtarzające się podawanie samej OZUŚ przez okres kilku tygodni może być wykorzystane do modelowania sporadycznego raka jelita grubego, przy braku zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS10,17. Te dwa uzupełniające się modele zapewniają warunki eksperymentalne do badania odpowiednio CAC i sporadycznego CRC, z których oba są związane z prozapalnym mikrośrodowiskiem guza10.

Zastosowanie seryjnej endoskopii u myszy zostało zapoczątkowane przez Beckera i współpracowników21 i umożliwia podłużne monitorowanie zapalenia jelita grubego i progresji guza. W tym miejscu przedstawiamy trzy protokoły przedkliniczne oparte na uszkodzeniu błony śluzowej wywołanym przez DSS i/lub indukcji guza za pośrednictwem OZUŚ w celu powtarzalnego wywołania określonych patologii okrężnicy. Pierwszy protokół opisuje indukowanie ostrego uszkodzenia błony śluzowej w odpowiedzi na podanie DSS w celu wywołania wielu cech histopatologicznych związanych z IBD. Drugi protokół opiera się na trzech kolejnych cyklach podawania DSS w celu naśladowania zaostrzeń stanu zapalnego powszechnie obserwowanych u pacjentów z IBD i może być przeprowadzany w połączeniu z mutacjami wywołanymi przez OZUŚ. Ostateczny protokół opiera się na sporadycznych mutacjach nabłonka wywołanych przez OZUŚ. Dla każdego z tych protokołów rozszerzamy odpowiednie standardowe procedury o metody interwencji profilaktycznej i terapeutycznej, które opracowaliśmy w celu monitorowania skuteczności nowych leków.

Protokół

Komisja etyki zwierząt w Instytucie Badań Medycznych Waltera i Elizy Hall zatwierdziła każdą z procedur opisanych w tych protokołach.

1. Przygotowanie myszy doświadczalnych

  1. Skomponuj kohorty eksperymentalne składające się z co najmniej 4 dopasowanych płciowo 6-8-tygodniowych myszy C57BL/6 (M. musculus), które są hodowane i trzymane w tym samym pomieszczeniu dla zwierząt wolnych od specyficznych patogenów (SPF) i zaopatrzone w autoklawowaną żywność i wodę. Wykorzystanie samic myszy pozwoli na wspólne trzymanie myszy z różnych linii, ograniczy liczbę pudełek i zmniejszy różnice między klatkami.
  2. Upewnij się, że myszy mają co najmniej 6 tygodni, aby umożliwić procedury endoskopowe z użyciem osłonki endoskopowej o średnicy 3,0 mm.
  3. Używaj myszy o tym samym tle genetycznym i, jeśli to możliwe, z klatek przechowywanych na tym samym stojaku, aby zmniejszyć różnice związane z mikroflorą jelitową. Różnice w mikroflorze między obiektami dla zwierząt powinny być brane pod uwagę przy określaniu odpowiednich myszy kontrolnych i genotypów dla każdego doświadczenia22.
  4. Oznacz myszy za pomocą wycinków z uszu/palców u nóg, tatuaży lub podobnych, aby umożliwić łatwą identyfikację.
  5. Zważ myszy w dniu 0, aby określić wyjściowe masy eksperymentalne.
  6. Wykonaj endoskopię (patrz punkt 5) myszy w dniu 0, aby zarejestrować wyjściowe fenotypy okrężnicy.

2. Badanie przedkliniczne w modelu uszkodzenia nabłonka i ostrego zapalenia jelita grubego

  1. Przygotować roztwór środka terapeutycznego, który ma być badany. W przypadku leków podawanych przez zgłębnik doustny (p.o.) należy przygotować roztwory do maksymalnej objętości 100 μl. W przypadku leków podawanych we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.) należy przygotować roztwory do maksymalnej objętości 200 μl.
    UWAGA: Wielokrotne podawanie leków i.p. lub p.o. przez dłuższy czas może spowodować zmianę zachowania myszy. Zmieniaj miejsce wstrzyknięcia i.p., aby uniknąć długotrwałego dyskomfortu. Do podawania p.o. podaj myszom autoklawowane nasiona słonecznika jako "smakołyk", aby zminimalizować niekorzystne skojarzenia z procedurą zgłębnika.
  2. W dniu 1 należy podać interesujący nas środek terapeutyczny (przygotowany w kroku 2.1) i odpowiednie kontrole nośnika. W podanym przykładzie (ryc. 6A) 5 μg rekombinowanego ludzkiego (rh) białka iInterleukiny (IL)-11 rozpuszczono w 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i podano ip.
  3. Należy określić czas i częstotliwość podawania, która będzie zależała od profilu farmakokinetycznego ustalonego dla badanego odczynnika terapeutycznego. Rycina 1 przedstawia leczenie profilaktyczne z wykorzystaniem zastrzyków dożylnych dwa razy dziennie w trakcie trwania eksperymentu.
  4. Monitoruj, w tym konsystencję stolca i obecność krwi, i waż każdą mysz codziennie. W dniach leczenia ważenie powinno zbiegać się z podawaniem leku terapeutycznego, aby zminimalizować stres u myszy spowodowany wielokrotnym obchodzeniem się z nim.
  5. W dniu 3 przygotuj 2,5% (2,5 g/100 ml) roztwór DSS w wodzie pitnej rutynowo dostarczanej myszom przez placówkę dla zwierząt. Do eksperymentu wymagane jest około 5 ml/mysz/dzień roztworu DSS. Zużycie wody DSS może ulec zmianie, jeśli temperatura otoczenia w obiekcie dla zwierząt ulega wahaniom.
    UWAGA: DSS jest substancją drażniącą i należy obchodzić się z nią zgodnie z instrukcjami MSDS.
  6. Dostarczaj myszom świeży DSS ad libitum w butelkach z czystą wodą przez 5 kolejnych dni. Wieczorem w dniu 5 podaj normalną wodę pitną oprócz rozgniecionych granulek pokarmu i odżywki białkowej podawanej na małych szalkach Petriego (100 g granulek pokarmowych / 10 g koktajlu białkowego / 10 ml wody). Zapobiega to odwodnieniu i pomaga zminimalizować poważną utratę wagi.
  7. Poddaj myszy eutanazji przez zatrucie CO2 i zbierz tkanki do późniejszej analizy histologicznej rankiem 8 dnia lub gdy myszy doświadczają utraty wagi ≥15% przez więcej niż trzy kolejne dni, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
    UWAGA: Dostosuj dawkę DSS w zakresie 1-4% (w/v) w zależności od mikroflory obiektu dla zwierząt i partii DSS. Przeprowadzanie rutynowych testów partii w celu ustalenia odpowiedniej dawki DSS i obejścia różnic między partiami. Odpowiednie dawkowanie powinno być oparte na utracie masy ciała (nie większej niż 15% pierwotnej masy) i potwierdzonym histopatologii zapalenia jelita grubego.

3. Badanie przedkliniczne w modelu przewlekłego zapalenia jelita grubego lub raka związanego z zapaleniem jelita grubego

  1. W przypadku modelu przewlekłego zapalenia jelita grubego zacznij od kroku 3.7.
  2. W przypadku modelu raka związanego z zapaleniem jelita grubego (CAC), w dniu 1 należy wstrzyknąć każdej myszy 10 mg/kg (w/w) azoksymetanu (AOM, 250 μl, i.p.).
    UWAGA: OZUŚ jest substancją rakotwórczą i należy postępować z nią zgodnie z instrukcjami MSDS.
  3. Roztwory podstawowe AOM przygotowuje się w postaci podwielokrotności 10 mg/ml i przechowuje w temperaturze -20 °C. W dniu wstrzyknięcia roztwór podstawowy AOM rozmraża się i rozcieńcza do 1 mg/ml w PBS. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania roztworu podstawowego AOM.
  4. Dawkę OZUŚ można regulować w zakresie 8-12 mg/kg mc. Wymagane jest rutynowe badanie partii w celu ustalenia odpowiedniej dawki AOM w celu uniknięcia toksyczności dla myszy wynikającej ze zmienności między partiami.
  5. W dniach 1-7 po podaniu OZUŚ masa ciała będzie stabilna i z tego powodu można pominąć monitorowanie masy ciała w dniach 1-7, aby uniknąć kontaktu ze zwierzętami, które będą wydalać metabolity cytotoksyczne z kałem.
  6. W dniu 7 należy zmienić całą ściółkę zgodnie z procedurami cytotoksycznymi. Po zakończeniu zmiany ściółki zwierzęta nie wymagają już procedur obchodzenia się z lekami cytotoksycznymi, ponieważ nie będą już wydalać metabolitów cytotoksycznych.
  7. W dniu 8 należy przygotować 2,5% (2,5 g/100 ml) roztwór DSS (zgodnie z opisem w kroku 2.5) i podać myszom ad libitum.
  8. Waż myszy codziennie przez cały czas trwania eksperymentu i monitoruj oznaki choroby, w tym potarganą sierść, garbienie się, krwawe stolce i ograniczony ruch.
  9. W dniu 13 usuń roztwór DSS i zapewnij myszom normalną wodę pitną do 28 dnia. Dni 8-28 stanowią jeden "cykl" protokołu przewlekłego zapalenia jelita grubego/CAC.
  10. W dniach 13-28, kiedy myszom podaje się normalną wodę pitną, podaj im rozgniecione granulki pokarmu i suplement białkowy podawany na małych szalkach Petriego (100 g granulek pokarmu / 10 g koktajlu białkowego / 10 ml wody). Zapobiega to odwodnieniu i pomaga zminimalizować poważną utratę wagi.
    UWAGA: Suplementy białkowe w zacierze nie powinny być podawane, gdy myszy otrzymują wodę pitną zawierającą DSS, aby zapewnić stałe spożycie DSS.
  11. W 20 dniu należy wykonać drugie badanie endoskopowe w celu monitorowania stanu zdrowia poszczególnych myszy (patrz punkt 5).
  12. W dniu 29 powtórz cykl DSS (cykl 2: 2,5% (w/v) DSS dostarczone w dniach 29-33 i normalna woda pitna w dniach 34-50).
  13. W 40 dniu należy wykonać trzecie badanie endoskopowe w celu monitorowania stanu zdrowia poszczególnych myszy i określenia obciążenia guzem (patrz punkt 5).
  14. Jeśli w 40. dniu nie widać żadnych guzów w endoskopii, rozpocznij trzeci cykl DSS w dniach 50-72 (cykl 3: 2,5% (w/v) DSS zapewnione w dniach 50-55 i normalna woda pitna w dniach 56-72). Ogólnie rzecz biorąc, guzy są widoczne do 40 dnia i dlatego można pominąć trzeci cykl DSS.
  15. Gdy guzy staną się widoczne w badaniu endoskopowym, przypisz każdej myszy endoskopową ocenę guza (patrz sekcja 5) i przypisz poszczególne myszy do kohort o podobnym wyjściowym obciążeniu guza
    16. .
  16. W 42. dniu (lub gdy widoczne są guzy) należy podać związek terapeutyczny lub odpowiednią kontrolę nośnika (patrz punkt 2.2). Czas podawania dawek będzie zależał od profilu farmakokinetycznego leku. Podano przykład leczenia interwencyjnego wstrzykiwanego doi.p. trzy razy w tygodniu myszom z ustalonymi guzami (ryc. 2).
  17. Wykonuj badania endoskopowe raz w tygodniu przez cały czas trwania leczenia w celu monitorowania obciążenia guza. Ogólnie rzecz biorąc, 4 tygodnie leczenia wystarczą, aby zaobserwować obiektywną odpowiedź na leczenie. Po zaprzestaniu leczenia kohortę myszy można również monitorować za pomocą endoskopii pod kątem nawrotu guza.
  18. Poddaj myszy eutanazji przez zatrucie CO2 i zbierz tkanki do analizy biochemicznej i / lub histologicznej rano w dniu 72 lub gdy myszy doświadczają utraty masy ciała ≥15% przez więcej niż trzy kolejne dni, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.

4. Badanie przedkliniczne w modelu sporadycznego raka jelita grubego

  1. W dniu 1. wstrzyknąć każdej myszy i.p. 10 mg/kg mc. OZUS (patrz krok 3.2). Dawkę OZUŚ można regulować w zakresie 8-12 mg/kg mc. Wymagane jest rutynowe badanie partii w celu ustalenia odpowiedniej dawki AOM w celu uniknięcia toksyczności dla myszy wynikającej ze zmienności między partiami.
  2. Powtarzać wstrzyknięcie pierwszego dnia każdego tygodnia przez kolejne 5 tygodni (Rysunek 3). Z myszami należy obchodzić się zgodnie z cytotoksycznymi procedurami bezpieczeństwa przez całe 6 tygodni.
  3. Zważ każdą mysz w dniu wstrzyknięcia AOM, aby zminimalizować stres myszy spowodowany wielokrotnym obchodzeniem się z myszami.
    UWAGA: OZUŚ jest substancją rakotwórczą i należy postępować z nią zgodnie z instrukcjami MSDS.
  4. Ze wszystkimi zwierzętami należy obchodzić się zgodnie z procedurami bezpieczeństwa cytotoksycznego przez 6 tygodni od wstrzyknięć dożylnej OZUŚ wymaganych zgodnie z niniejszym protokołem.
  5. W 8. tygodniu należy wykonać badanie endoskopowe w celu monitorowania pojawiających się guzów (patrz punkt 5). Badanie endoskopowe należy wykonywać co dwa tygodnie, aż do momentu uwidocznienia się guzów. Ogólnie rzecz biorąc, u zwierząt C57Bl/6 typu dzikiego guz zaczynają rozwijać się guzy po około 40 tygodniach od pierwszego podania AOM.
  6. Gdy guzy staną się widoczne w badaniu endoskopowym, przypisz każdej myszy endoskopową ocenę guza (patrz sekcja 5) i przypisz poszczególne myszy do kohorty o podobnym obciążeniu guzem przed rozpoczęciem leczenia terapeutycznego.
  7. W 40. tygodniu (lub gdy guzy są widoczne po raz pierwszy), podaj związek terapeutyczny lub odpowiednią kontrolę nośnika.
  8. Czas podawania dawek będzie zależał od profilu farmakokinetycznego leku (patrz krok 2.1). Podano przykład leczenia interwencyjnego wstrzykiwanego i.p. 3 razy w tygodniu myszom z ustalonymi nowotworami (ryc. 3).
  9. Wykonuj badanie endoskopowe co tydzień przez cały okres leczenia terapeutycznego w celu monitorowania obciążenia guza. Ogólnie rzecz biorąc, 4 tygodnie leczenia terapeutycznego są wystarczające do uzyskania obiektywnej odpowiedzi na leczenie. Po zaprzestaniu leczenia kohortę myszy można również monitorować za pomocą endoskopii pod kątem nawrotu guza.
  10. Poddaj myszy eutanazji przez zatrucie CO2 i zbierz tkanki do analizy biochemicznej i / lub histologicznej okrężnicy i guzów w 45. tygodniu lub po 4 tygodniach terapii.

5. Badania endoskopowe

  1. Sprzęt endoskopowy powinien być zmontowany zgodnie ze standardowymi procedurami16.
  2. Wysterylizuj i wyczyść sondę endoskopową 70% etanolem lub smarem antybakteryjnym.
  3. Filmy można nagrywać za pomocą laptopa lub komputera stacjonarnego i standardowego oprogramowania multimedialnego, takiego jak iMovie. Standardowy monitor komputerowy, a nie monitor klasy medycznej, jest wystarczający do wizualizacji okrężnicy podczas procedury endoskopii (ryc. 4).
  4. Znieczulenie grup 5-6 myszy jednocześnie w komorze z 3% izofluranem w 100%O2 z szybkością 0,2-0,4 L/min. Gdy myszy zostaną znieczulone, co potwierdza się uszczypnięciem palca u nogi; Stężenie izofluranu należy zmienić na 0,5-2% w celu konserwacji.
  5. Wyjmij pojedynczą mysz z komory i umieść ją brzuszną stroną do góry, z głową zabezpieczoną w stożku nosowym. Należy monitorować pełne znieczulenie, a tylne nogi wyregulować tak, aby były rozciągnięte za myszką.
  6. Umieść maść weterynaryjną na oczach myszy, aby zapobiec wysuszeniu.
  7. Przytrzymaj ogon myszy w miejscu, w którym styka się z dolnym grzbietem, aby wyraźnie odsłonić odbyt. Włóż sztywną osłonę endoskopu do zlewki z wodą i wyreguluj przepływ powietrza, aby umożliwić uwalnianie jednego małego pęcherzyka na raz.
  8. Przepływ powietrza pozwoli na nadmuchanie jelita grubego. Jeśli przepływ powietrza jest zbyt silny, powietrze zostanie wpompowane do żołądka myszy. Nie jest wymagane żadne dodatkowe smarowanie.
  9. Ostrożnie włóż sztywną osłonę endoskopu do odbytnicy. Ogólnie rzecz biorąc, endoskop można wprowadzić do 3 cm, w którym to momencie okrężnica u myszy zakrzywia się i nie jest dostępna dla sztywnego endoskopu.
  10. Częstą trudnością podczas zabiegów endoskopowych jest zablokowanie dostępu do światła jelita grubego z powodu kału. Unikaj tego, delikatnie masując brzuch myszy przed zabiegiem, aby zachęcić do wypróżnienia, lub ostrożnie manewrując endoskopem wokół kału podczas zabiegu. Może również wystąpić perystaltyka jelit grubych, podczas której endoskop powinien być trzymany w pozycji do momentu rozluźnienia mięśni jelita grubego.
  11. Rozpocznij nagrywanie wideo na dowolnym etapie procedury endoskopowej. Ocena choroby może być rejestrowana przez doświadczonego asystenta podczas zabiegu lub w późniejszym czasie z plików wideo.
  12. Po badaniu endoskopowym wróć myszy do klatki i monitoruj je podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Zwierzęta są na ogół przytomne i ruchliwe w ciągu 2 minut po usunięciu stożka nosowego podającego izofluran.
  13. Upewnij się, że te procedury są wykonywane przez doświadczonego naukowca. Każdy zabieg endoskopowy trwa około 2 minut na mysz.

6. Punktacja choroby

  1. Aby monitorować zapalenie jelita grubego, należy nagrać filmy wideo dla mysiego endoskopowego wskaźnika nasilenia zapalenia jelita grubego (MEICS)16, który dokumentuje zmiany w (i) grubości ściany jelita grubego wskazywanej przezroczystością, (ii) konsystencji stolca, (iii) integralności i obecności naczyń krwionośnych, (iv) owrzodzeń i obszarów regeneracji, które objawiają się w sposób ziarnisty, (v) krwawienia wskazywanego przez złogi fibryny (ryc. 5a).
  2. Aby monitorować obciążenie guza, oceniaj filmy pod kątem częstości występowania i wielkości guza. Wielkość guza zależy od średnicy światła okrężnicy zajmowanego przez guz16 (ryc. 5b). Powszechne jest stosowanie zarówno parametrów oceny zapalenia jelita grubego, jak i guza dla jednej myszy. Za pomocą endoskopii można monitorować poszczególne guzy i stan błony śluzowej okrężnicy w czasie, zapewniając odczyt dla sukcesu nowych terapii u jednego zwierzęcia.
  3. (Opcjonalnie) Z filmów można wyodrębnić nieruchome obrazy w celu wygenerowania reprezentatywnych danych (Rysunek 6).

Wyniki

Utratę masy ciała stosuje się jako standardowy parametr monitorowania choroby związanej z zapaleniem jelita grubego, co rutynowo służy do oceny ogólnego stanu zdrowia myszy. Zwierzęta zazwyczaj utrzymują masę ciała podczas podawania wody zawierającej DSS i zaczynają chudnąć dopiero po powrocie do normalnej wody pitnej. Dopuszczalne parametry utraty masy ciała powinny zostać ustalone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej komisji etyki ds. zwierząt. Aby zapobiec odwodnieniu związanemu z przedłużającą się biegunką, oprócz normalnej wody pitnej należy rutynowo podawać papkę (rozgniecione granulaty pokarmowe zmieszane z wodą pitną) uzupełnioną o shake białkowy.

Jako alternatywną metodę znieczulenia, w przypadku braku sprzętu do izofluranu, można zastosować ketaminę/ksylazynę lub podobne środki. Ze względu na sztywną budowę endoskopu, procedury te umożliwiają wizualizację jedynie najbardziej dystalnych 3 cm jelita grubego myszy. W zależności od potrzeb eksperymentu dostępne są nowsze endoskopy o dodatkowych możliwościach (w tym elastyczność i fluorescencja). Jednakże, ponieważ szkodliwe efekty DSS ograniczają się głównie do dystalnej części jelita grubego myszy, przy łagodniejszej patologii w części środkowej, sztywny endoskop nie utrudnia monitorowania stanu błony śluzowej poszczególnych myszy. Choć opisujemy protokół profilaktycznego leczenia ostrego zapalenia jelita grubego indukowanego DSS, można go łatwo zmodyfikować w celu przetestowania strategii leczenia interwencyjnego. Skuteczność leku opracowanego w celu złagodzenia uszkodzeń nabłonka i zapalenia jelita grubego może być monitorowana podłużnie u poszczególnych myszy i ilościowo określona na podstawie opisanych parametrów oceny (Rysunek 5). Jest to korzystne w porównaniu z tradycyjnymi projektami eksperymentalnymi, które wymagają uśmiercania myszy w określonych punktach czasowych protokołu eksperymentalnego i nie pozwalają na charakteryzację odpowiedzi choroby na leczenie w czasie.

Badania kliniczne na ludziach wykazały znaczną zmienność w reakcji różnych guzów u pojedynczego pacjenta na zastosowane leczenie. Opisane tutaj procedury umożliwiają monitorowanie całkowitego obciążenia nowotworowego, a także odpowiedzi poszczególnych guzów na leczenie w przebiegu eksperymentu. Należy wziąć pod uwagę, że protokoły interwencyjne przedstawione dla modeli nowotworowych nie uwzględniają wpływu terapii na inicjację guza. W celu uzyskania takich informacji wymagane są protokoły profilaktyczne, w których leczenie jest podawane przed momentem, gdy guzy stają się widoczne w badaniu endoskopowym. Przedstawione tutaj protokoły dostarczają informacji o efektach terapeutycznych w odniesieniu do progresji (mierzonej rozmiarem guza) poszczególnych zmian nowotworowych. Regresja guza może być również wskazywana przez zmniejszenie liczby widocznych guzów.

Schemat harmonogramu terapii i indukcji z przebiegiem leczenia DSS, endoskopią i trendem obciążenia chorobą.
Rysunek 1: Monitorowanie skuteczności profilaktycznej terapii leczniczej w modelu ostrego uszkodzenia okrężnicy. Protokół eksperymentalny (a) trwa 8 dni od rozpoczęcia do zakończenia. Środki terapeutyczne są podawane (b) od 1. dnia w przypadku leczenia profilaktycznego. DSS jest podawany w wodzie pitnej (c) od 3. dnia protokołu eksperymentalnego. Endoskopię przeprowadza się (d) w celu monitorowania postępu choroby u zwierząt. Sugerowane punkty czasowe obejmują 0. dzień (nieleczone) i 2. dzień (monitorowanie stanu zdrowia), 5. oraz 8. dzień (w celu określenia obciążenia chorobą). Eksperyment zostaje zakończony (e) rano 8. dnia. U myszy typu dzikiego (f) postęp choroby zwiększa się w czasie.

Oś czasu progresji choroby; terapia, indukcja, endoskopia; schemat planu eksperymentalnego; schemat podawania DSS i AOM.
Rysunek 2: Monitorowanie skuteczności terapii interwencyjnej w modelu raka związanego z zapaleniem jelit. Protokół eksperymentalny (a) trwa 72 dni od rozpoczęcia do zakończenia. Środki terapeutyczne (b) są podawane myszom z rozwiniętymi guzami od 46. dnia w ramach leczenia interwencyjnego. AOM (c) jest wstrzykiwane 1. dnia, a DSS jest dostarczany w wodzie pitnej w ciągu trzech cykli protokołu eksperymentalnego, rozpoczynając od 8. dnia. Endoskopia (d) jest wykonywana w celu monitorowania progresji choroby u zwierząt. Sugerowane punkty czasowe obejmują 0. dzień (brak leczenia), 20. dzień (monitorowanie stanu zdrowia) oraz 40. dzień (w celu pogrupowania zwierząt według obciążenia nowotworowego). Endoskopia jest wykonywana co tydzień w trakcie leczenia terapeutycznego w celu monitorowania wyników choroby. Eksperyment (e) zostaje zakończony rano 72. dnia. U myszy typu dzikiego (f) obciążenie nowotworowe wzrasta od 40. dnia.

Timeline diagram for AOM disease induction therapy, endoscopy schedule, and expected disease burden.
Rysunek 3: Monitorowanie skuteczności terapii interwencyjnej w modelu spontanicznego raka jelita grubego. Protokół eksperymentalny (a) wymaga >50 tygodni od rozpoczęcia do zakończenia. Terapie (b) podaje się myszom z rozwiniętymi guzami w celu przeprowadzenia leczenia interwencyjnego. AOM (c) zostaje wstrzyknięty w 1. dniu, a następnie raz w tygodniu w ramach 6 kolejnych iniekcji w ciągu protokołu eksperymentalnego. Endoskopia (d) wykonuje się w celu monitorowania postępu choroby u zwierząt. Sugerowane punkty czasowe obejmują dzień 0 (grupa nieleczona), tydzień 8 (monitorowanie guza) oraz kolejne pomiary co dwa tygodnie (w celu ustalenia obciążenia nowotworowego). Endoskopię przeprowadza się co tydzień w trakcie leczenia, aby monitorować efekty terapeutyczne. Eksperyment (e) zakończono w 50. tygodniu. U myszy typu dzikiego (f) obciążenie nowotworowe wzrasta od 40. tygodnia.

Konfiguracja stacji roboczej do endoskopii z monitorem, komputerem, źródłem światła i osłoną endoskopową.
Rycina 4: Konfiguracja sprzętu. Układ eksperymentalny (a) jednostki endoskopowej, z zaznaczonymi poszczególnymi elementami wyposażenia. Sztywny endoskop (b), z zaznaczonymi poszczególnymi komponentami. Pasek skali = 2.5 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela punktowa dla zapalenia jelita grubego i guzów; oceny stopnia nasilenia i kryteria punktacji dla klasyfikacji badawczej.
Rycina 5: Ocena parametrów choroby podczas endoskopii. Schemat (a) mysiego endoskopowego wskaźnika nasilenia zapalenia jelita grubego (MEICS). Schemat (b) poszczególnych parametrów oceny punktowej guzów. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Efekty terapii DSS na masę ciała, badanie endoskopowe oraz wskaźniki zapalenia jelit/guzów; przedstawione wykresy i wyniki.
Rysunek 6: Reprezentatywne zabiegi terapeutyczne. Reprezentatywna utrata masy ciała, obrazy endoskopowe i wskaźniki dla: (a) ostrego uszkodzenia śluzówki indukowanego DSS. (b) guzów, które rozwinęły się po zastosowaniu protokołu AOM/DSS. (c) guzów, które rozwinęły się po sekwencyjnym protokole AOM. N = 3 myszy na grupę. *P <0,05, ***P <0,001 (test t Studenta). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Trzy opisane protokoły przedstawiają metody niezawodnej i powtarzalnej indukcji patologii choroby okrężnicy u myszy. W połączeniu z rutynowym monitorowaniem endoskopowym i opisanymi tutaj strategiami interwencyjnymi, protokoły te dostarczą potężnego przedklinicznego wglądu w skuteczność terapii. Nasze laboratoria rutynowo stosują wszystkie te protokoły w celu monitorowania skuteczności nowatorskich terapii10,23,24.

Przy wyborze przedklinicznego modelu zwierzęcego do testowania nowych środków terapeutycznych należy wziąć pod uwagę szereg czynników. Obejmują one znaczenie modelu dla choroby człowieka oraz wkład mikrośrodowiska guza w proponowane działanie celu terapeutycznego. W tym miejscu przedstawiamy trzy protokoły interwencji terapeutycznej w ustalonych modelach chorób jelitowych. Modele te są powtarzalne, a dostarczanie odczynników w celu wywołania choroby jest łatwe do opanowania. Co ważne, modele te są bardzo istotne dla wielu aspektów i etapów wystąpienia zapalenia jelita grubego oraz inicjacji i progresji guza. Projektując eksperymenty, naukowcy powinni wziąć pod uwagę tło genetyczne szczepów myszy wykorzystywanych do ich stosowania, ponieważ podatność na choroby wywołane przez DSS i/lub OZUŚ może się znacznie różnić25. Ponadto różne społeczności drobnoustrojów mogą mieć różne zdolności metaboliczne w kontekście OZUŚ, która jest metabolizowana przez bakterie. Przestrzegamy przed wykorzystywaniem różnych kohort myszy, które urodziły się w różnych obiektach dla zwierząt (w tym u sprzedawców komercyjnych) w jednym eksperymencie. Podobnie, różna mikroflora u myszy wykorzystywanych w różnych obiektach może wywoływać różne reakcje gospodarza na uszkodzenie bariery nabłonkowej wywołane przez DSS11. Ponadto należy również rozważyć odpowiednią analizę tkanki (na przykład oczyszczanie RNA), ponieważ zdolność DSS do hamowania odwrotnej transkryptazy będzie miała wpływ na późniejszą analizę molekularną26,27.

Endoskopia myszy to najnowocześniejsza technika wielokrotnego monitorowania początku i postępu choroby u pojedynczej myszy. Możliwość nagrywania filmów i wyodrębniania zdjęć pozwala na łatwe monitorowanie wielu parametrów chorobowych i nowotworów. Oprócz poprawy dobrostanu zwierząt, monitorowanie endoskopowe zmniejsza również potrzebę stosowania wielu kohort myszy eksperymentalnych, które tradycyjnie były zabijane w różnych punktach czasowych w celu śledzenia wyników choroby. System punktacji MEICS nie zastępuje analizy histopatologicznej, ale stanowi alternatywny sposób monitorowania zdrowia zwierząt i uszkodzeń błon śluzowych u żywych myszy. Endoskopia myszy jest specjalistyczną techniką laboratoryjną, a wszystkie procedury powinny być wykonywane przez przeszkolony personel, aby zapewnić odpowiednią manipulację i obchodzenie się z myszami, a także zapewnić stałą jakość obrazów wykorzystywanych do oceny choroby. W rękach wykwalifikowanej osoby odkryliśmy, że endoskopia wywołuje niewielkie lub żadne uszkodzenia guzów, które spowodowałyby krwawienie wewnątrznowotworowe. W przypadku przedstawionych protokołów terapeutycznych uważamy, że endoskopia jest bardzo korzystna, ponieważ zapewnia sposób określenia początkowego obciążenia guzem i pozwala nam grupować kohorty zwierząt o podobnym obciążeniu guzem przed podaniem leku terapeutycznego. Sekwencyjne monitorowanie myszy umożliwia naukowcom określenie skuteczności nowych terapii na wczesnym etapie, z możliwością zakończenia nieudanych eksperymentów w odpowiednim czasie.

Wraz z postępem w naszej wiedzy na temat nieswoistych zapaleń jelit i raka jelita grubego, zostaną zidentyfikowane nowe cele terapii. Odpowiednie modele zwierzęce będą miały kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że najbardziej obiecujące nowe terapie zostaną przeniesione do badań klinicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować firmie CSL Ltd. za wsparcie zakupu sprzętu do endoskopii. Badania w laboratorium ME są wspierane przez Ludwig Institute for Cancer Research, a laboratoria TP i ME są wspierane przez Victorian State Government Operational Infrastructure Support oraz National Health and Medical Research Council of Australia. ME jest starszym pracownikiem naukowym NHMRC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Siarczan dekstranu sodu (MW 36 000-50 000)MP Biochemicals160110Wymaga badania partii.
AzoksymetanSigmaA5486-100MGWymaga testów wsadowych.
Waniliowy koktajl białkowyN/AN/ADostępne w aptekach szpitalnych.
IzofluranPPCM60303Jest to odczynnik o ograniczonym dostępie, który powinien być przechowywany pod kluczem i zamknięciem.
70% etanolNie dotyczydotyczyStandardowy odczynnik laboratoryjny.
Miniendoskopowy system
Endovision TricamKarl Storz20212001-020
Źródło światła Xenon 175 z pompą przeciwmgielnąKarl Storz20134001
Teleskop prosty HOPKINSKarl Storz64301AA
Osłona endoskopowa (średnica całkowita 3 mm)Kalr Stroz61029C
Światłowód świetlnyKalr Stroz69495ND
Oprogramowanie komputerowe i odtwarzacz multimedialnyAppleiMovie
ScaleDowolnawaga odpowiednia do ważenia myszy.
Nie Coloview

Bibliografia

  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
  2. Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
  3. Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
  4. Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
  5. Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
  6. Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
  7. Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
  8. Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
  9. Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
  10. Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
  11. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  12. Rose, W. A. 2nd, Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41(2012).
  13. Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084(2012).
  14. Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
  15. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
  16. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
  17. Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
  18. Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
  19. Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
  20. Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
  21. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
  22. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
  23. Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
  24. Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
  25. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9(2011).
  26. Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350(2013).
  27. Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele zapalenia jelita grubegorak jelita grubegoskuteczność terapeutycznaocena endoskopowamonitorowanie chorobymodele mysiebadania przedkliniczne
Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.