Artykuł metodologiczny

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

DOI:

10.3791/52392

⸱

6 grudnia 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Immunology Unit, Université Libre de Bruxelles, 2Institut Jules Bordet, Université Libre de Bruxelles, 3Institut d'Immunologie Médicale, Université Libre de Bruxelles, 4Flow Cytometry Core Facility, Université Libre de Bruxelles

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje szybką nieenzymatyczną dysocjację świeżych fragmentów tkanek ludzkich do jakościowej i ilościowej oceny komórek CD45+ (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkowo, supernatant uzyskany z pierwotnego homogenatu tkankowego może być zbierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność komórek nowotworowych do unikania układu odpornościowego, charakteryzująca się ucieczką guza zarówno od wrodzonej, jak i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej, jest obecnie akceptowana jako ważna cecha charakterystyczna raka. Nasze badania nad rakiem piersi koncentrują się na aktywnej roli, jaką limfocyty naciekające guz odgrywają w progresji guza i wynikach leczenia. W tym celu opracowaliśmy metodologię szybkiej izolacji nienaruszonych komórek limfoidalnych z normalnych i nieprawidłowych tkanek w celu oceny ich stanu bezpośredniego do ich rodzimego stanu. Homogenaty przygotowane przy użyciu dysocjatora mechanicznego wykazują zarówno zwiększoną żywotność, jak i regenerację komórek, przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji receptorów powierzchniowych w porównaniu z tkankami trawionymi enzymatami. Co więcej, trawienie enzymatyczne pozostałego nierozpuszczalnego materiału nie pozwoliło odzyskać dodatkowych komórek CD45 +, co wskazuje, że pomiary ilościowe i jakościowe w pierwotnym homogenacie prawdopodobnie rzeczywiście odzwierciedlają infiltrujące subpopulacje we fragmencie tkanki. Komórki limfoidalne w tych homogenatach można łatwo scharakteryzować za pomocą podejścia immunologicznego (fenotyp, proliferacja itp.) lub molekularnego (DNA, RNA i/lub białko). Komórki CD45+ mogą być również wykorzystywane do oczyszczania subpopulacji, ekspansji in vitro lub krioprezerwacji. Dodatkową zaletą tego podejścia jest to, że pierwotny supernatant tkankowy z homogenatów może być wykorzystany do scharakteryzowania i porównania cytokin, chemokin, immunoglobulin i antygenów obecnych w tkankach prawidłowych i złośliwych. Protokół ten działa bardzo dobrze w przypadku ludzkich tkanek piersi i powinien mieć zastosowanie do szerokiej gamy normalnych i nieprawidłowych tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrośrodowisko guza składa się z różnych typów komórek, a liczne badania pokazują, że każda z nich odgrywa odrębną i ważną rolę w procesie nowotworzenia1,2. Należą do nich między innymi naciekające komórki odpornościowe, komórki zrębu, komórki śródbłonka i komórki nowotworowe3. Badania ex vivo limfocytów naciekających nowotwór (TIL; Komórki CD45 + lub leukocyty, które są głównie limfocytami w nowotworach piersi) ze świeżych próbek tkanek ludzkich jest utrudnione ze względu na ich niską częstotliwość, małe rozmiary próbek często dostępne do badań i możliwość utraty żywotności podczas ekstrakcji. Ponieważ komórki odpornościowe naciekające guzy są zwykle obecne jako pasażerowie, a nie stali mieszkańcy, są one łatwiejsze do uwolnienia z macierzy tkankowej.

Dysocjacja tkanki nowotworowej przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej jest technicznie trudna i tradycyjnie była wykonywana przy użyciu kombinacji mechanicznych i enzymatycznych etapów w celu przygotowania zawiesin pojedynczych komórek4-8. Takie podejście obejmuje długie okresy inkubacji i wiąże się ze znacznym zmniejszeniem żywotności komórek, a także utratą receptorów powierzchniowych komórek w wyniku rozszczepienia enzymatycznego. Wysokiej jakości badania cytometrii przepływowej charakteryzujące TIL w mikrośrodowisku guza, a także czyste oczyszczanie subpopulacji CD45 + za pomocą cytometrii przepływowej lub kulek pokrytych przeciwciałami są trudniejsze do osiągnięcia z trawionej enzymatycznie tkanki nowotworowej. Ponadto supernatant (SN) z otrzymanego homogenatu guza nie nadaje się do dalszej analizy, w tym do oznaczania ilościowego wydzielanych białek (cytokin, chemokin, immunoglobulin lub antygenów nowotworowych) lub eksperymentalnego traktowania normalnych komórek, ze względu na możliwość degradacji białek w trawieniach enzymatycznych.

W naszych poszukiwaniach metody przygotowania jednokomórkowych homogenatów z tkanek piersi [w tym z guza, niesąsiadujących tkanek nienowotworowych (NANT) i normalnych (z redukcji sutka) bez trawienia enzymatycznego, przetestowaliśmy różne techniki mechanicznej homogenizacji. Homogenaty przygotowane przy użyciu dysocjatora mechanicznego charakteryzowały się zwiększoną żywotnością komórek (2-krotnie) i całkowitym odzyskiem komórek (2-krotnie) przy zachowaniu ekspresji receptorów powierzchniowych. Trawienie enzymatyczne pozostałego nierozpuszczalnego materiału nie pozwoliło odzyskać dodatkowych komórek CD45 +, co sugeruje, że wszystkie zostały uwolnione w początkowym homogenacie. Tak więc to szybkie i proste podejście pozwala zarówno na jakościową, jak i ilościową ocenę subpopulacji CD45 + obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkową zaletą tego podejścia jest to, że SN z początkowego homogenatu (SN tkanki pierwotnej) może być pobierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie próbki zostały pobrane przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez Komisję Etyki Medycznej Instytutu Jules Bordet z pisemną świadomą zgodą uzyskaną od każdego pacjenta.

1. Przygotowanie homogenatu tkankowego

  1. Wycięte tkanki (złośliwe i normalne tkanki wycięte z sali operacyjnej) są umieszczane w laboratorium patomorfologicznym przez przeszkolony personel w celu natychmiastowego odbioru. Guz, NANT (pobrany jak najdalej od guza) i normalne fragmenty tkanek są rutynowo przetwarzane w ciągu 1 - 3 godzin od wycięcia chirurgicznego w laboratorium BSL2 przy użyciu standardowych procedur bezpieczeństwa biologicznego dla tkanek ludzkich. Schemat blokowy protokołu jest zilustrowany na rysunku 1.
  2. Zważ wszystkie fragmenty tkanek (normalne, NANT i guz) i zmierz długość, szerokość i wysokość (długość x szerokość x wysokość). Jest to ważny krok dla późniejszej normalizacji subpopulacji komórek, wyekstrahowanego RNA itp.
    UWAGA: Zakres wielkości próbki wynosi od 100 do 10 000 mm3 bez tłuszczu, jeśli to możliwe.
  3. Odcisk fragmentu guza na szkiełku podstawowym w celu barwienia H&E, aby sprawdzić, czy tkanka jest rzeczywiście częścią guza.
    1. Zrób to, naciskając szklane szkiełko mikroskopowe na fragment guza i delikatnie uciskając palcami przez kilka sekund.
    2. Zamocuj szkiełko izopropanolem na 2 minuty, a następnie przemyj je w wodzie. Przeciwbarwić tkankę przez 30 sekund hematoksyliną Mayera.
    3. Umyj szkiełko w sześciu kąpielach wodnych. Barwienie w floksynie B 2% przez 15 sek.
    4. Umyć w jednej kąpieli wodnej, następnie w czterech kąpielach izopropanolu i zakończyć jedną kąpielą w wodzie.
    5. Inkubować w izopropanolu przez 1 minutę i odcedzić. Klarowny w dwóch kąpielach ksylenu.
    6. Zamontuj za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu. Zbadaj komórkowość guza (ryc. 2).
      UWAGA: Głównie komórki nowotworowe przyklejają się do odciśniętego szkiełka - komórki zrębowe, limfoidalne lub tłuszczowe rzadko pozostają, pozostawiając przestrzenie między komórkami nowotworowymi (ryc. 2).
  4. Umieścić fragment tkanki w małym naczyniu hodowlanym zawierającym 1 ml chemicznie zdefiniowanej, pozbawionej surowicy pożywki z komórek krwiotwórczych (zwanej dalej pożywką) w temperaturze pokojowej i pokroić go w drobną kostkę (~1 - 2 mm2) za pomocą sterylnego skalpela.
  5. Przenieś wszystko (fragmenty tkanki + pożywka) do mechanicznej rurki C dysocjatora.
  6. Przepłukać szalkę Petriego i skalpel 2 ml pożywki za pomocą pipety Pasteura i dodać ją do probówki C (objętość pożywki do dysocjacji = 3 ml).
  7. Użyj programu dysocjatora mechanicznego A.01 dla probówek C (najdelikatniejszy program), aby homogenizować fragmenty tkanek w zawiesinę pojedynczej komórki. Umieść rurkę C w aparacie i uruchom program dwa razy z rzędu (jeden cykl = 25 sekund).
    UWAGA: Ta procedura homogenizacji została opracowana i zatwierdzona dla ludzkiej tkanki piersi, inne typy nowotworów lub tkanek mogą wymagać użycia innego programu i powinny być najpierw przetestowane.
  8. Wyjąć probówkę C z aparatu i zdekantować homogenat bezpośrednio do sitka o wielkości 40 μm umieszczonego na probówce o pojemności 50 ml. Używając tej samej pipety Pasteura, co w kroku 1.6, przenieś płyn pozostały w probówce C do sitka do komórek.
  9. Przefiltrowaną ciecz przenieść do probówki o pojemności 15 ml za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 1 ml. Tymczasowo należy zachować sitko do komórek i jego probówkę o pojemności 50 ml.
  10. Przepłukać probówkę C dodatkowymi 3 ml pożywki i przenieść ją, ponownie używając tej samej pipety Pasteura, co w kroku 1.6, do sitka do komórek, które nadal jest osadzone na probówce o pojemności 50 ml. Wycisnąć maksymalną ilość pozostałego płynu uwięzionego w niehomogenizowanej tkance do probówki o pojemności 50 ml, delikatnie przesuwając ją po sitku za pomocą czystej pipety Pasteura lub końcówki o pojemności 1 ml, którą następnie wyrzuca się, aby uniknąć zanieczyszczenia eluatu.
  11. Umieść sitko do komórek do góry nogami na oryginalnej probówce C i spłucz 3 ml pożywki, aby niehomogenizowana tkanka wpadła z powrotem do probówki C.
  12. Przeprowadzić ponowną homogenizację jak w kroku 1.7 przez dwa cykle programu A.01.
  13. Przelać ten drugi homogenat przez sitko umieszczone na probówce o pojemności 50 ml, ponownie przepłukać probówkę C 3 ml pożywki (jak w kroku 1.10) i przenieść pipetą Pasteura do sitka komórkowego osadzonego na probówce o pojemności 50 ml, ponownie wyciskając maksymalną ilość płynu z pozostałej tkanki łącznej uwięzionej w sitku do komórek.
  14. W tym momencie objętość ~2,5 ml znajduje się w probówce 15 ml i ~9 ml w probówce 50 ml.

2. Oddzielenie supernatantu tkankowego od komórek

  1. Odwirować homogenaty w probówkach o pojemności 15 ml i 50 ml przez 15 minut przy 600 x g w temperaturze pokojowej.
  2. Zdekantować SN z probówki o pojemności 15 ml do czystej probówki i tymczasowo przechowywać w temperaturze 4 °C. Ten supernatant = guz pierwotny, NANT lub SN w tkance prawidłowej (objętość końcowa 2,5 ml) jest następnie klarowany i podawany przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz (patrz poniżej).
  3. Odlać sklarowany osad z probówki o pojemności 50 ml.
  4. Delikatnie zawiesić oba granulki komórkowe w końcowej objętości 1 ml pożywki. Krótko mówiąc, najpierw delikatnie rozbij osad komórkowy w obu probówkach (stukając rurką o twardą powierzchnię). Zawiesić luźno komórkowy osad w 50 ml z 500 μl pożywki i przenieść tę zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml w celu ponownego zaparcia drugiej osadki. Powtórz ten krok raz z drugimi 500 μl pożywki, aby uzyskać maksymalny odzysk komórek.
  5. Przenieść 10 μl zawiesiny komórek do małej probówki, wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego (rozcieńczenie 1:1) i policzyć liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: W tym momencie część zawiesiny komórkowej można również przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny wielkości komórki, ziarnistości i, w razie potrzeby, ograniczonej liczby markerów subpopulacji w celu bardziej precyzyjnej oceny względnego rozmieszczenia komórek w homogenacie przed obszerną analizą lub eksperymentami. Wszystkie analizy metodą cytometrii przepływowej obejmują znakowanie CD45 w celu normalizacji subpopulacji.
  6. Granulować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki z guza, NANT lub normalnej tkanki są teraz gotowe do dalszego oczyszczania lub analizy. Te dodatkowe kroki najlepiej wykonywać w tym samym dniu co zabieg.
    UWAGA: Do analizy metodą cytometrii przepływowej, ale nie do sortowania komórek, resztki krwinek czerwonych powinny być poddane lizie po znakowaniu przeciwciałami poprzez dodanie 0,4 ml buforu do lizy czerwonych krwinek do osadu komórkowego, natychmiastowe wirowanie przez 1 sekundę i inkubację przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej (chronionej przed światłem) przed analizą.

3. Klarowanie supernatantu tkankowego

  1. Odwirować probówki o pojemności 1,5 ml z tkanką SN o stężeniu 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie dotykając ani nie naruszając osadu. Przenieść do czystej probówki (lub probówek) w zależności od pożądanej liczby i objętości podwielokrotności.
  3. Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

4. Krew pacjenta

  1. Pobrać próbkę krwi od każdego pacjenta jako kontrolę przez nakłucie żyły do heparynizowanych probówek dzień przed operacją. Odwirować krew o sile 400 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C z wyłączonym hamulcem w celu uzyskania osocza i kożuchowego płaszcza.
  2. Usunąć osocze i sklarować je przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 20 °C. Podwielokrotność i przechowywać osocze w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Rozcieńczyć kożuszek w podłożu
  3. Oddzielić komórki jednojądrzaste za pomocą standardowego wirowania gradientu ficoll-hypaque przed natychmiastową analizą, izolacją subpopulacji, ekstrakcją DNA/RNA/białka lub kriokonserwacją.

5. Cytometria przepływowa

  1. Oznaczyć ogniwa zgodnie z instrukcjami producenta w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem. Lizować czerwone krwinki w zawiesinach komórkowych z fragmentów tkanek po znakowaniu przeciwciałami, dodając 0,4 ml buforu do lizy komórek do osadu komórkowego.
  2. Wirować natychmiast przez 1 sekundę i inkubować co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Przepuść oznakowane komórki w cytometrze przepływowym w celu uzyskania danych bez mycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enzymatyczne trawienie fragmentów tkanek za pomocą dostępnych na rynku roztworów dysocjacji tkanek lub różnych laboratoryjnych mieszanin kolagenazy, DNazy i/lub inhibitorów hialuronidazy, rozszczepia szeroką gamę receptorów na powierzchni komórek. Nasze badania, początkowo skoncentrowane na limfocytach T CD4 + naciekających guzy piersi, szybko napotkały poważny problem techniczny spowodowany rozszczepieniem powierzchniowych receptorów CD4 przy użyciu standardowych protokołów trawienia enzymatycznego4-8

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniu tym opisano zoptymalizowaną metodę szybkiego przygotowania normalnych i złośliwych homogenatów tkanki piersi bez trawienia enzymatycznego do późniejszego sortowania komórek, ekstrakcji, kriokonserwacji i / lub analizy fenotypowej subpopulacji CD45 + . Celem tego eksperymentalnego podejścia jest uzyskanie obrazów TIL, które dokładnie odzwierciedlają ich stan in vivo i porównanie ich z normalnymi tkankami przy minimalnej manipulacji tkankami prosto z sali operacyjnej. Do tej pory nasze laborat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Belgijskiego Funduszu Badań Naukowych (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Plan Cancer of Belgium, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds J.C. Heuson i Fonds Barsy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dysocjator GentleMacsMiltenyi Biotec130-093-235BD Medimachine jest w pewnym sensie odpowiednikiem
Wirówka 5810R Eppendorflub inna standardowa wirówka stołowa
Wirówka 5417R Eppendorflub inna standardowa mikrowirówka
Esco Klasa II A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznegoESCO globalnylub inny standardowy kaptur
BSL2Mikroskop odwróconyNikon eclipse TS100lub inny mikroskop kompatybilny z hememytometrem
Bü rker ChamberMarienfield 640210lub inny standardowy hemacytometr
Navios Cytometr przepływowy BeckmanCoulterlub inny cytometr przepływowy (zalecany 8-10 kolorów)
GentleMacs C-TubeMiltenyi Biotec130-096-344BD Medimachine używa
naczynia do hodowli komórkowychSarstedt72,710lub innych niepirogennych wyrobów z tworzyw sztucznych
Jednorazowy skalpelSwann-Morton0510lub standardowy sterylny skalpel jednorazowego użytku
BD Cell Strainer 40 µ mBecton Dickinson734-0002lub inne niepirogenne wyroby z tworzyw sztucznych
BD Falcon Tube 50 mlBecton Dickinson352070lub inne niepirogenne tworzywa sztuczne
BD Falcon Tube 15 mlBecton Dickinson352097lub inne niepirogenne wyroby z tworzyw sztucznych
BD FACS Tubka 5 mlBecton Dickinson352008lub inne niepirogenne wyroby z tworzyw sztucznych
Sterylny Pasteur Pipeta 5 mlVWR612-1685lub inne niepirogenne wyroby z tworzywa sztucznego
Probówka do mikrofuge 1,5 mlEppendorf7805-00lub inne niepirogenne tworzywa sztuczne
X-Vivo 20LonzaBE04-448Qzalecane podłoże bez surowicy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLonzaBE17-516Fstandard fizjologiczny PBS
Błękit trypanowyVWR17942Elub inna życiowa plama
VersaLyseBeckman CoulterA09777do eksperymentów cytometrii przepływowej
Możliwa do ustalenia żywotność Barwnik eFluor 780eBioscience65-0865-14do eksperymentów cytometrii przepływowej
anty-CD3 FITCBD Biosciences345763do eksperymentów cytometrii przepływowej
anty-CD3 Vio BlueMiltenyi Biotec130-094-363do eksperymentów
cytometrii przepływowejanty-CD4 PEBD Biosciences345769do eksperymentów z cytometrią przepływową
anty-CD4 APCMiltenyi Biotec130-091-232do eksperymentów z cytometrią przepływową
anty-CD8 ECDBeckman Coulter737659do eksperymentów z cytometrią przepływową
anty-CD8PerCP BD Biosciences345774do eksperymentów z cytometrią przepływową
anty-CD19 APC-Vio770Miltenyi Biotec130-096-643do eksperymentów z cytometrią przepływową
anty-CD45 VioGreenMiltenyi Biotec130-096-906do eksperymentów z cytometrią przepływową
Filcon

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  4. Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
  5. Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
  6. McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
  7. Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
  8. Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
  9. Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  10. Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).
  11. Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18(2014).
  12. Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).
  13. Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
  14. Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229(2012).
  15. Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tissue HomogenizationMechanical DissociationLymphocyte IsolationFlow CytometryCell ViabilityCD45 Positive CellsTissue SupernatantCytokine AnalysisBreast TissueCell Recovery

Powiązane artykuły