Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Równowaga sedymentacji małego białka błonowego tworzącego oligomer: wpływ protonacji histydyny na stabilność pentamieryczną

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52404

⸱

2 kwietnia 2015

 , 
1School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

W tym artykule

Podsumowanie

Równowaga sedymentacji (SE) może być wykorzystana do badania interakcji białko-białko w środowisku fizjologicznym. Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie tej techniki do określenia wpływu pH na stabilność homo-pentameru utworzonego przez małe białko hydrofobowe (SH) kodowane przez ludzkiego syncytialnego wirusa oddechowego (hRSV).

Streszczenie

Analityczne ultrawirowanie (AUC) może być używane do badania odwracalnych oddziaływań między makrocząsteczkami w szerokim zakresie intensywności oddziaływań i w warunkach fizjologicznych. To sprawia, że AUC jest metodą z wyboru do ilościowej oceny stechiometrii i termodynamiki asocjacji homo- i hetero, które są przejściowe i odwracalne w procesach biochemicznych. W modalności równowagi sedymentacji (SE) równowaga między dyfuzją a sedymentacją zapewnia profil jako funkcję odległości promieniowej, która zależy od określonego modelu asocjacji. W niniejszym artykule opisano szczegółowy protokół SE w celu określenia wielkości i energii asocjacji monomer-monomer małego oligomeru białka błonowego za pomocą ultrawirówki analitycznej. AUC-ES jest bezznacznikowy, oparty tylko na zasadach fizycznych i może być stosowany zarówno na białkach rozpuszczalnych w wodzie, jak i błonowych. Pokazano przykład tego ostatniego, małego hydrofobowego (SH) białka w ludzkim syncytialnym wirusie oddechowym (hRSV), 65-aminokwasowym polipeptydzie z pojedynczą α-helisową domeną transbłonową (TM), która tworzy pentameryczne kanały jonowe. Dane strukturalne oparte na NMR pokazują, że białko SH ma dwie protonatowalne reszty He w swojej domenie transbłonowej, które są zorientowane w kierunku światła kanału. Eksperymenty SE zostały zaprojektowane w celu określenia, w jaki sposób pH wpływa na stałą asocjacyjną i oligomeryczną wielkość białka SH. Podczas gdy forma pentameryczna była zachowana we wszystkich przypadkach, jej stała asocjacyjna była zmniejszona przy niskim pH. Dane te są zgodne z podobną zależnością pH obserwowaną dla aktywności kanału SH, zgodną z orientacją światła dwóch reszt He w białku SH. Te ostatnie mogą ulegać odpychaniu elektrostatycznemu i zmniejszonej stabilności oligomerów przy niskim pH. Podsumowując, metoda ta ma zastosowanie wszędzie tam, gdzie konieczne jest zmierzenie informacji ilościowych na temat subtelnych zmian asocjacji białko-białko w warunkach fizjologicznych.

Wprowadzenie

Ultrawirowanie analityczne1-5 jest jedną z najważniejszych metod badania oddziaływań makrocząsteczek w warunkach fizjologicznych, dostępną zarówno dla słabych, jak i silnych oddziaływań. Metoda jest bezznacznikowa i wykorzystuje absorpcję lub interferencję światła, a nawet fluorescencyjne systemy optyczne mogą być używane do uzyskiwania dostępu do zakresów stężeń w zakresie kilku rzędów wielkości6.

Ta metoda jest szczególnie przydatna, ponieważ większość procesów biochemicznych zależy od odwracalnych interakcji. Stechiometria i siła tych oddziaływań muszą być scharakteryzowane ilościowo, aby zrozumieć procesy biologiczne, a istnieje szereg metod w tym celu 7,8. Jednak interakcje przejściowe są trudne do zbadania 9.

Wybór metody charakteryzowania oddziaływań makromolekularnych zależy od jej statycznej lub dynamicznej natury. W pierwszym przypadku stosuje się prędkość sedymentacji (SV), w której mierzy się szybkość transportu promieniowego, a kompleksy frakcjonuje się na podstawie różnic w masie i kształcie wyporu.

Natomiast dynamiczne skojarzenia, które są odwracalne na skali czasowej eksperymentu, nie mogą być fizycznie oddzielone. W tym przypadku interakcje własne lub hetero prowadzące do oddziaływań niekowalencyjnych są w równowadze, która zależy od całkowitego stężenia białka. Te dynamiczne oddziaływania można badać zarówno za pomocą równowagi sedymentacji (SE), jak i prędkości sedymentacji (SV) 10. Jednak pierwsza metoda jest prostsza do wykonania i została opisana tutaj. W SE wirowanie odbywa się z wystarczająco niską prędkością, aby osiągnąć równowagę między dyfuzją a sedymentacją. W tym momencie profil równowagowy sygnału optycznego (UV-VIS) w funkcji odległości radialnej może być analizowany przy użyciu wstępnie ustawionych modeli termodynamicznych dla asocjacji11.

W niniejszym artykule przedstawiono badanie równowagi sedymentacji dotyczące samokojarzenia białka błony wirusowej, które tworzy kanały jonowe. Ze względu na jego hydrofobowość eksperyment przeprowadza się w obecności detergentu i w tym przypadku gęstość rozpuszczalnika musi być dopasowana do gęstości detergentu. Jednak opisany protokół byłby identyczny w przypadku białka rozpuszczalnego w wodzie, z wyjątkiem tego, że nie byłoby wymagane dopasowanie gęstości rozpuszczalnika.

Użyte białko jest kodowane w ludzkim syncytialnym wirusie oddechowym (hRSV), otoczkowym wirusie pneumowirusa z rodziny paramyxoviridae, który powoduje choroby dolnych dróg oddechowych u niemowląt, osób starszych i z obniżoną odpornością na całym świecie 12. Każdego roku dochodzi do 64 milionów zgłoszonych przypadków zakażenia wirusem hRSV i 160 000 zgonów.

Genom hRSV transkrybuje 11 białek, w tym trzy białka błonowe F, G i małe hydrofobowe (SH). Białko SH bierze udział w patogenezie zakażenia RSV. RSV pozbawiony genu SH (RSVΔSH) był żywotny, powodował powstawanie syncytii i rozwijał się tak samo jak wirus typu dzikiego (WT) 13-16. Jednak wirus RSVΔSH replikował się 10-krotnie mniej efektywnie niż WT w górnych drogach oddechowych 15,16. Wirus RSVΔSH był również atenuowany w modelach in vivo myszy i szympansów 13,17.

Białko SH to 64 (RSV podgrupa A) lub 65 (RSV podgrupa B) aminokwasy o długim integralnym typie II białko błonowe, które gromadzi się głównie na błonach kompartmentu Golgiego 18. SH białko ma pojedynczą przewidywaną domenę transbłonową a-helisową (TM) 19, która jest wysoce konserwatywna 20,21. C- i N-końcowe domeny zewnątrzbłonowe są zorientowane odpowiednio światłem/zewnątrzkomórkowo i cytoplazmatycznym.

<>jove_contentWykazano, że zarówno syntetyczna domena TM (reszty 18-43), jak i białko SH o pełnej długości tworzą homopentamery w różnych detergentach. Forma homopentameryczna jest odpowiedzialna za aktywność kanałową w płaskich dwuwarstwach lipidowych 22,23. Prawidłowa orientacja monomerów TM w dwuwarstwie lipidowej została po raz pierwszy określona za pomocą specyficznego dla miejsca dichroizmu podczerwonego 23, który wykazał, że His-22 znajduje się w orientacji świetlnej, bliskiej międzyhelikalnej. Ta sama orientacja domeny TM została potwierdzona w badaniach NMR, które zrekonstruowały pentameryczne pęczek a-helisowy białka o pełnej długości w micelach dodecylofosfocholiny (DPC) 22. W tym modelu "miceli" pojedyncza a-spiralna domena TM była otoczona N-końcowo przez a-helisę, a C-końcowo przez przedłużoną b-spinkę do włosów. Dwie protonowalne reszty białka SH, His-22 i His-51, znajdują się odpowiednio w domenie TM (zorientowane światłem) i na końcu zewnątrzbłonowej C-końcowej β spinki do włosów (daleko od poru kanału). Jednak w środowisku dwucelarnym α-helisa TM rozciąga się aż do His-51, a obie Jego reszty są dostępne dla światła kanału24. Struktura kanału przyjmuje architekturę lejkową 22, gdzie węższy obszar (od Ser-29 do Cys-45) 22 jest wyłożony hydrofobowymi łańcuchami bocznymi (Ile-32, Ile-36, Ile-40 i Leu-44), a Ile-36 określa najwęższy punkt w świetle kanału. His-22 znajduje się w największym otworze tego lejka, podczas gdy His-51 znajduje się na końcu najmniejszego otworu.

W niniejszym artykule, wirowanie analityczne w trybie równowagi sedymentacji zostało użyte do określenia, czy Jego protonacja wpływa na stabilność pentameru białka SH. W tym przypadku białko SH zostało rozpuszczone w detergencie C14-betaina, który był wcześniej używany do wykazania, że białko SH tworzy oligomery pentamerowe22.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół opiera się na następujących zasobach, do których należy się odwołać w celu uzyskania szczegółowych informacji i specjalnych uwag3,25-28.

1. Dopasowanie gęstości miceli detergentów do 2H2O

Uwaga: Gęstość roztworu buforowego musi być dostosowana do gęstości miceli detergentu. Powszechnie stosowane środki regulujące gęstość to 2H2O, H218O, 2H218O, glicerol i sacharoza29. H218O ma taką samą gęstość jak 2H2O i może być lepszym wyborem, jeśli nie pożądana jest deuteracja protonów wymiennych w białku. W tej procedurze gęstość detergentu 3-(N,N-dimetylomyrystyloammonio)-propansulfonianu (C14SB) w 50 mM Tris pH 7.3, 100 mM NaCl zostanie dopasowana za pomocą 2H2O. Jako wstępne przypuszczenie zostaną zastosowane następujące stężenia 2H2O: 10, 30 i 50% v/v.

1.1. Przygotowanie próbek

  1. Przygotować następujące roztwory robocze i wysterylizować je poprzez filtrację za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm: 50 mL 500 mM Tris pH 7,3 oraz 1 M NaCl (roztwór buforu 10X); 1 mL 250 mM C14SB (roztwór detergentu 50X).
  2. Przygotować 200 μl roztworu próbki, mieszając 20 μl roztworu buforu 10X, 4 μl roztworu detergentu 50X, 20 μl 2H2O (99,9%) oraz 156 μl dejonizowanej H2O. Przygotować również 200 μl roztworu referencyjnego, mieszając 20 μl roztworu buforu 10X, 20 μl 2H2O (99,9%) oraz 160 μl dejonizowanej H2O.
  3. Powtórzyć krok 1.1.2 dla pozostałych stężeń 2H2O, tj. 30% i 50%, odpowiednio dostosowując ilości 2H2O oraz H2O.

1.2. Montaż 6-kanałowych ogniw AUC i ładowanie próbek do ogniw.

Uwaga: Istnieją dwa typy ogniw AUC, zależnie od metody załadunku próbki. Ogniwa bez zewnętrznego napełniania muszą zostać załadowane przed uszczelnieniem, natomiast ogniwa z zewnętrznym napełnianiem można załadować po ich uszczelnieniu. Montaż ogniwa AUC z zewnętrznym napełnianiem został opisany wcześniej3. W niniejszym protokole opisano montaż 6-kanałowego ogniwa AUC bez zewnętrznego napełniania. Główną różnicą jest to, że posiada ono pierścienie śrubowe po obu stronach, które należy dokręcić oddzielnie, i nie wymaga ono zaślepek obudowy (Rys. 1). Różnice w etapach montażu zostały wyróżnione poniżej.

Schemat rozstrzelony zespołu obudowy spektroskopowej z pierścieniem śruby, podkładką i elementem centralnym.
Rysunek 1. Widok rozstrzelony 6-kanałowej celi AUC bez zewnętrznego wypełnienia. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie instrukcji obsługi rotora analitycznego, cel i przeciwwagi Beckman Coulter An-50 Ti oraz An-60 Ti.

  1. Przygotuj dwa zestawy okien dla każdej celi AUC, stosując okno szafirowe zamiast okna kwarcowego (Ryc. 2). Umieść uszczelkę okna w uchwycie okna. Lekko zegnij tuleję okna i umieść ją w uchwycie okna w taki sposób, aby szczelina powstała naprzeciwko wpustu uchwytu okna. Umieść okno szafirowe wewnątrz tulei okna, dopasowując oznaczenie do wpustu uchwytu okna.
    Uwaga: Okno kwarcowe jest ściśliwe, przez co powoduje silniejsze załamanie światła przy wysokich prędkościach 28, 30. Dlatego w pomiarach interferencyjnych powyżej 30000 rpm, takich jak w tym eksperymencie dopasowania gęstości, stosuje się okna szafirowe. Okno szafirowe jest cięższe od okna kwarcowego i posiada wytrawioną literę „X” na krawędzi.

Schemat zestawu optycznego z soczewką kwarcową/szafirową i wpustem; szczegóły wyrównania i komponentów.
Rycina 2. Widok rozłożony zestawu okna. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie instrukcji obsługi rotora analitycznego, ogniw i przeciwprzeciagów Beckman Coulter An-50 Ti i An-60 Ti

  1. Umieść obudowę komórki o numerze katalogowym do góry nogami. Wsuń do obudowy komórki, dbając o wyrównanie wpustów z kluczem obudowy, najpierw 6-sektorowy element środkowy ściętą stroną w dół, a następnie jeden zespół okna oknem skierowanym w dół (Rys. 1, lewa strona).
  2. Lekko pokryj gwinty pierścienia śrubowego oraz podkładkę pierścienia śrubowego preparatem spinkote. Umieść podkładkę pierścienia śrubowego na górze zespołu okna. Zamontuj pierścień śrubowy w obudowie okna tak, aby napis „OUT” był skierowany na zewnątrz. Dokręć pierścień śrubowy ręcznie, używając narzędzia do wyrównywania komórek.
  3. Za pomocą klucza dynamometrycznego dokręć pierścień śrubowy z siłą zaledwie 60 inch-pounds.
  4. Umieść komórkę o numerze katalogowym w pozycji pionowej, ustawiając ją na godzinie 12. Napełnij lewe rzędy 120 μl referencji, a prawe rzędy 110 μl próbki. Upewnij się, że każda próbka i referencja są prawidłowo sparowane.
    Uwaga: Dokładna objętość próbki nie jest krytyczna, ale referencja musi mieć nieco większą objętość niż próbka (5-10 μl), aby menisk próbki był wyraźnie widoczny.
  5. Ostrożnie wsuń do obudowy komórki jeden zespół okna oknem skierowanym w dół (Rys. 1, prawa strona). Należy uważać, aby nie potrząsać komórką zbyt mocno i nie rozlać zawartości.
  6. Powtórz kroki 1.2.3 oraz 1.2.4, dokręcając drugi pierścień śrubowy z siłą 120 inch-pounds. Odwróć komórkę i ponownie dokręć pierwszy pierścień śrubowy z siłą 120 inch-pounds.
  7. Załaduj komórki do rotora, zamontuj rotor w wirówce oraz zainstaluj monochromator zgodnie z instrukcjami producenta 28.
    Uwaga: Szczegóły dotyczące tego kroku można znaleźć również w tej referencji 3.

1.3. Konfiguracja pomiaru interferencji

  1. Uruchom oprogramowanie interfejsu użytkownika instrumentu AUC i przeprowadź konfigurację lasera oraz kalibrację radialną dla każdej komórki przy 3000 rpm, zgodnie z instrukcjami producenta, które zostaną krótko podsumowane w następnym kroku.
  2. 1.3.1.1 Po osiągnięciu odpowiedniej próżni (< 100 micronów), uruchom wirówkę przy 3000 rpm. Przejrzyj wzór interferencyjny w oprogramowaniu interfejsu użytkownika i dostosuj parametry lasera, aby uzyskać najwyższy kontrast.
  3. Utwórz nowy plik konfiguracji (File | New File), określając pomiar „Equilibrium” (równowaga) i „Interference” (interferencja). Skonfiguruj metodę równowagi sedymentacyjnej (przycisk „Method”), aby pracowała przy 45000 rpm lub najwyższej przewidywanej prędkości dla próbek białek, zależnie od tego, która wartość jest wyższa, przy temperaturze pomiaru 20°C i zbieraniu 1 skanu co 15 minut. Monitoruj postępy osiągania stanu równowagi, otwierając pliki danych w programie HeteroAnalysis i wybierając funkcję „Match” po upływie co najmniej 12 godzin (mniej więcej przez noc, Rys. 3).
    Uwaga: podobna funkcja jest również dostępna w programie SEDFIT (Options | Loading Options | Test Approach to Equilibrium).

Wykres RMSD w funkcji czasu; analiza danych; stabilność białek; bioinformatyka; wykres naukowy.
Rycina 3. Wynik z funkcji Match w programie HeteroAnalysis. Funkcja Match może być wykorzystywana do monitorowania postępu stanu równowagi poprzez porównanie RMSD pomiędzy kolejnymi skanami a ostatnim skanem. Ten przykład pokazuje osiągnięcie stanu równowagi po 8 hr, co wskazuje asymptotyczny przebieg wartości RMSD względem osi X.

1.4. Analiza danych

  1. Dla każdego zestawu próbek wykreśl zależność nachylenia profilu rozkładu radialnego od stężenia 2H2O.
    Uwaga: Rozkład będzie miał postać bardzo płytkiej funkcji wykładniczej zbliżonej do liniowej. Punkt przecięcia z osią X odpowiada dopasowanemu stężeniu 2H2O.
  2. Aby uzyskać dokładniejsze wyniki, przeprowadź eksperyment w kilku powtórzeniach. Alternatywnie powtórz eksperyment w węższym zakresie stężeń 2H2O.

2. Równowaga sedymentacyjna SH w micelach C14SB

2.1. Parametry przebiegu

  1. Oblicz gęstość i lepkość buforu, parcjalną objętość właściwą białka oraz prędkość wirowania, korzystając z programu SEDNTERP. Aby obliczyć gęstość i lepkość buforu, wybierz opcję Compute w sekcji „Buffer Data Select” i wprowadź odpowiednie składniki buforu, w tym stężenie D2O.
  2. 2.1.1.1 Aby obliczyć parcjalną objętość właściwą białka, wybierz opcję Compute w sekcji „V-bar” i wprowadź sekwencję aminokwasową białka. Określ największy spodziewany rozmiar oligomeru w polu „Make an oligomer from this monomer: N=”, w tym przypadku N = 5. Oblicz prędkość, wprowadzając wartości w polu RPM w głównym oknie, aż do uzyskania σ ≈ 1; jest to ogólna zasada zapewniająca odpowiedni kształt wykładniczy profilu rozkładu radialnego25.
    Uwaga: Wartości obliczone dla tego eksperymentu wynosiły: ρ = 1.03839 g/ml, η = 1.0267 cP = 0.7569 ml/g, ω1 = 16000 rpm.
  3. Oblicz kolejne prędkości, których należy przestrzegać, aby zapewnić wystarczającą różnicę między profilem rozkładu przy jednej prędkości a kolejną25.
    Uwaga: można to również zrobić za pomocą funkcji „Estimate equilibrium rotor speeds function” w programie SEDFIT, która bierze pod uwagę kolumnę roztworu (objętość wypełnienia).

2.2. Przygotowanie próbek

  1. Przygotować 1 ml literatura roztwór zawierający 5 mM C14SB i 32,3% 2H2O wyznaczone na podstawie eksperymentu dopasowania gęstości (sekcja 1), poprzez mieszanie 100 μl roztwór buforu 10X (krok 1.1.1), 20 μl roztwór detergentu 50X (krok 1.1.1), 323 μl 2H2O (99,9%) i 527 μl dejonizowana H2O2O.
  2. Rozpuścić liofilizowane, oczyszczone metodą HPLC peptydy SH (ekspresję i oczyszczanie opisano wcześniej31) w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak metanol lub 50% v/v wodny acetonitryl. Zmierz absorbancję przy 280 nm (A280) rozpuszczonych peptydów w spektrofotometrze UV/Vis o mikroobjętości i podziel na trzy próbki, aby uzyskać A280, 12 mm = 0,3, 0,5 i 0,8 (A280, 10 mm = 0,25, 0,417 i 0,67) odpowiednio po rozcieńczeniu do 130 μlLiofilizować próbki przez noc, a następnie resuspender w 130 μl roztwór odniesienia (krok 2.2.1), aby otrzymać próbka roztwory
    Uwaga: białko SH można wykryć za pomocą absorbancji UV/Vis przy 280 nm, ponieważ zawiera ono reszty Trp i Tyr. Białka pozbawione reszt aromatycznych można wykryć poprzez ich znakowanie odpowiednim chromoforem, zastosowanie mutanta zawierającego Trp lub poprzez zastosowanie pomiarów interferencyjnych zamiast absorbancji.
  3. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 1.2, aby złożyć 6-kanałową celę AUC. z oknami kwarcowymi. Nanieś próbkę o najwyższym stężeniu (A280, 12 mm = 0,8) w kanale najbliższym środka rotora oraz próbka o najniższym stężeniu (A280, 12 mm = 0,3) najdalej od środka rotora.

2.3. Konfiguracja pomiarów absorbancji

  1. Utwórz nowy plik konfiguracji (File | New File), wybierając pomiar „Equilibrium” oraz „Absorbance”. Jako długość fali detektora określ 280 nm.
  2. Wykonaj kalibrację radialną przy 3000 rpm, zaznaczając opcję „Radial calibration before first scan” w sekcji Scan Options, ustawiając zbieranie danych w niskiej rozdzielczości, np. z Radial step size = 0.01 cm, Replicates = 3 (low resolution, fast), i wykonując pojedynczy skan (Single Scan). Po zakończeniu skanowania odznacz tę opcję.
  3. Skonfiguruj metodę równowagi sedymentacyjnej (przycisk „Method”), aby uruchomić ją przy pierwszej prędkości obliczonej w kroku 2.1.3, w temperaturze 20°C i zbierać 1 skan co 30 minut. W sekcji „Detail” dla każdej komórki określ zbieranie danych w niskiej rozdzielczości, analogicznie do kroku 2.3.2. Monitoruj postęp osiągania równowagi, otwierając pliki danych w programie HeteroAnalysis i wybierając funkcję „Match” po upływie co najmniej 18 godzin (mniej więcej przez noc, Rys. 4).
    Uwaga: osiągnięcie stanu równowagi może zająć znacznie więcej czasu dla pierwszej prędkości, natomiast kolejne prędkości będą wymagały krótszego czasu.

Cztery wykresy RMSE w funkcji czasu ilustrujące trendy analizy danych w eksperymentach naukowych.
Rycina 4. Wyniki z funkcji dopasowania HeteroAnalysis. Pierwsza i druga prędkość (lewa i prawa góra) wydają się mieć osiągniętą równowagę, jednak dla pewności lepiej odczekać jeszcze kilka godzin. W porównaniu z nimi, trzecia i czwarta prędkość (lewa i prawa dół) wyraźnie osiągnęły równowagę w krótszym czasie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Po osiągnięciu stanu równowagi wykonaj pojedynczy pomiar w wysokiej rozdzielczości, np. przy Radial step size = 0.001 cm, Replicates = 10 (wysoka rozdzielczość, powolny pomiar).
  2. Po zakończeniu pomiaru powtórz kroki 2.3.3 i 2.3.4 dla kolejnej prędkości.
  3. Opcjonalnie, jeśli znany jest czas potrzebny na osiągnięcie stanu równowagi dla każdej prędkości (wyliczony lub określony na podstawie doświadczenia), skonfiguruj pomiar metodą równowagi sedymentacyjnej tak, aby objął on wszystkie prędkości obliczone w kroku 2.1.3 i wykonaj jeden pomiar po czasie wyrównania dla każdej prędkości. W takim przypadku w sekcji „Detail” dla każdej komórki określ zbieranie danych w wysokiej rozdzielczości.

2.4. Analiza danych w programach SEDFIT i SEDPHAT

Uwaga: W celu uzyskania dalszych szczegółów i uwag dotyczących analizy danych czytelnik może zapoznać się z następującą stroną internetową: www.analyticalultracentrifugation.com.

  1. Otwórz skany o wysokiej rozdzielczości w programie SEDFIT (Data | load sedimentation equilibrium data) i podziel dane na 3 kanały (odpowiadają one różnym stężeniom dla każdej próbki; Options | Loading Options |Save 6-channel Raw Data in 3 Subsets).
  2. Ponownie otwórz w SEDFIT pliki danych należące do tej samej próbki i tego samego stężenia, ale dla różnych prędkości. Dostosuj linię menisku (pionowa czerwona linia), dno komórki (pionowa niebieska linia) oraz granice dopasowania (pionowe zielone linie), a następnie wyeksportuj dane do użytku w SEDPHAT (Data | Export Data to SEDPHAT). Wprowadź parametry obliczone w kroku 2.1.1, a także typ rotora i typ adaptera centralnego zgodnie z prośbą. Powtórz ten krok dla każdej próbki i każdego stężenia.
  3. Otwórz w SEDPHAT wszystkie dane z tej samej próbki (wszystkie stężenia i prędkości) i wypełnij Parametry Eksperymentu (Experiment Parameters); przykład przedstawiono na Rys. 5.
    Uwaga: gdy do buforu dodano D2O, deuterowanie protonów wymiennych może znacząco zmienić masę cząsteczkową białka, szczególnie w przypadku białek rozpuszczalnych w wodzie. Białka błonowe, zwłaszcza małe, takie jak białko SH, są mniej podatne na ten efekt, ponieważ regiony zanurzone w błonie są chronione przed wymianą. Aby to skorygować, wprowadź „buffer D mol fraction”.
    Uwaga: Na tym etapie zaleca się oddzielne zapisanie edytowanego zestawu danych poprzez wybranie menu Data | Copy All Data And Save As New Config.
  4. Wybierz Model i wypełnij Parametry Globalne (Global Parameters) dla tego modelu.
    Uwaga: Jako przykład, model „Monomer-n-Mer Self-Association” oraz jego parametry przedstawiono na Rys. 6.

Interfejs wprowadzania parametrów eksperymentalnych dla wieloprzędkościowej równowagi absorbancji, pokazujący wprowadzane dane i ustawienia.
Rysunek 5. Przykład sposobu wypełniania parametrów eksperymentalnych.

Interfejs oprogramowania do analizy stanu równowagi; wyświetla parametry takie jak stężenie i stała równowagi.
Rysunek 6. Przykład wypełniania parametrów globalnych (Global Parameters) dla modelu samoasocjacji monomer-n-meru.

  1. Wykonaj dopasowanie globalne (Global Fit), wybierając menu Fit | Global Fit i poczekaj do czasu osiągnięcia zbieżności dopasowania. Zapisz (lub zrób zrzut ekranu) wyniki dopasowania, zwłaszcza globalną zredukowaną wartość chi-kwadrat oraz wartości log Ka. Wyeksportuj pozostałe dane, takie jak dane dopasowania i residua dopasowania, z menu Copy and Display | Display Thermodynamic Information.
  2. Powróć do Global Parameters i zaznacz M(1), aby dopasować masę cząsteczkową monomeru, a następnie powtórz krok 2.4.5. Zapisz dopasowaną masę cząsteczkową oraz globalny zredukowany chi-kwadrat.
  3. Powtórz kroki od 2.4.3 do 2.4.6 dla każdego testowanego modelu i porównaj jakość dopasowania każdego z nich, analizując wartość globalnego zredukowanego chi-kwadratu oraz residua dopasowania.
    Uwaga: Małe i losowe residua dopasowania zazwyczaj wskazują na dobre dopasowanie, a model najlepiej dopasowany powinien mieć najmniejszą globalną zredukowaną wartość chi-kwadrat. Dopasowana masa cząsteczkowa monomeru i odpowiadająca jej wartość chi-kwadrat nie powinny znacząco odbiegać od wartości dla stałej (teoretycznej) masy cząsteczkowej.
  4. Oblicz przedział ufności dla uzyskanej wartości log Ka, wybierając najpierw Statistics | Critical chi-square for error surface projections i wprowadzając pożądany przedział ufności. Następnie przejdź do Statistics | Generate 1-dimensional error surface projection i odznacz log Ka w dialogu Global Parameters, aby uzyskać wartości chi-kwadrat dla log Ka.
    Uwaga: Czytelnikom zaleca się zapoznanie z następującymi źródłami (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat/statistics.htm) w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat tej metody 32 oraz jej ilustracji 33.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Profil rozkładu radialnego miceli detergentu C14SB w 50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7,3 tworzy bardzo płytką funkcję wykładniczą, którą można dopasować do modelu liniowego (Rysunek 7A). Nachylenie tego rozkładu jest odwrotnie skorelowane z stężeniem D2O (Rysunek 7B). Punkt, w którym nachylenie wynosi zero, tj. dopasowane stężenie D2O, wyniósł 32,3%.

Patrz Rysunek 7 poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule przedstawiono eksperymentalny protokół przygotowania próbki i analizy oligomeryzacji małego białka błonowego w detergentzie z wykorzystaniem sedymentacji równowagowej. Opisany protokół jest równie ważny – i prostszy – dla białek rozpuszczalnych, ponieważ etap dopasowania gęstości nie jest wymagany. Rzeczywiście, system składa się z mieszaniny detergentu i białka. Aby przeprowadzić badania sedymentacji, detergent musi być niewidoczny dla pola grawitacyjnego, aby nie przyczyniał się do flotacji cząstek. W związk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez grant National Research Foundation NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) oraz grant Tier 1 RG 51/13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-(N,N-dimetylomistylamido)propanosulfonianSigmaT0807
Tlenek deuteru 99,8%Izotop CambridgeDLM-4-99,8
An-50 Ti Wirnik analityczny, 8-miejscowyBeckman Coulter363782
An-60 Ti, Analityczny, 4-miejscowyBeckman Coulter361964
Obudowa ogniwaBeckman Coulter
Sześciokanałowy element centralny 12 mm, wypełniony węglem elektrycznym BeckmanCoulter331376
Uchwyt okiennyBeckman Coulter305037
Uszczelka okiennaBeckman Coulter327021
Nakładka okiennaBeckman Coulter362329
SzafirowaBeckman Coulter307177
Okno kwarcoweBeckman Coulter301730
Podkładka pierścieniowaBeckman Coulter362328
Pierścień śrubowyBeckman Coulter301922
SpinkoteRedlica Beckman 306812
stojaka momentu obrotowegoBeckman Coulter361318
PrzeciwwagaBeckman Coulter360219
Narzędzie do wyrównywania komórekBeckman Coulter362340
SEDNTERPhttp://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page
HeteroAnalysis http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp
SEDFIThttp://www.analyticalultracentrifugation
.com/sedfit.htm
SEDPHAThttp://www.analyticalultracentrifugation
.com/sedphat/default.htm
334784 szyba Zespół

Bibliografia

  1. Laue, T. M., Stafford, W. F. 3rd Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).
  2. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
  3. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530(2009).
  4. Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
  5. Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
  6. MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
  7. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
  8. Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
  9. Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
  10. Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
  11. Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
  12. Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
  13. Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
  14. Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
  15. Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
  16. Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
  17. Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
  18. Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
  19. Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
  20. Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
  21. Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
  22. Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
  23. Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
  24. Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
  25. Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
  26. Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
  27. Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
  28. An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , Beckman Coulter, Inc. Available from: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003 (2005).
  29. Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
  30. Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, John Wiley & Sons, Inc. 20.23.21-20.23.13 (2001).
  31. Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
  32. Bevington, P. R., Robinson, D. K. Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, McGraw-Hill. New York. (1969).
  33. Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
  34. Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
  35. Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
  36. Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
  37. Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
  38. Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analityczna ultracentryfukacjaoligomer bia ka b onowegoma e bia ko hydrofobowedopasowanie ci aru w a ciwego za pomoc tlenku deuterudetergent sulfalan C14pomiar sta ej asocjacjioligomeryzacja zale na od pH
Równowaga sedymentacji małego białka błonowego tworzącego oligomer: wpływ protonacji histydyny na stabilność pentamieryczną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.