Artykuł metodologiczny

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52408

⸱

17 lutego 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience & Behavioral Disorders, Duke-NUS Graduate Medical School, 2Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Streszczenie

Tutaj opisujemy protokół generowania kokultury składającej się z 2 różnych populacji neuronów. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są przeprogramowywane z ludzkich fibroblastów za pomocą wektorów episomalnych. Kolonie iPSC można obserwować po 30 dniach od rozpoczęcia przeprogramowania fibroblastów. Kolonie pluripotencjalne są ręcznie zbierane i hodowane w pożywce do indukcji neuronów, aby umożliwić różnicowanie się w neuronalne komórki progenitorowe (NPC). Komórki iPS szybko przekształcają się w komórki neuronabłonkowe w ciągu 1 tygodnia i zachowują zdolność do samoodnawiania, gdy są utrzymywane w wysokiej gęstości hodowli. Pierwotne mysie NPC różnicują się w astrocyty przez ekspozycję na pożywkę zawierającą surowicę przez 7 dni i tworzą monowarstwę, do której dodaje się embrionalne neurony korowe szczura w 18. dniu (E18) (transfekowane rodopsyną kanałową-2 (ChR2)). Ludzcy NPC oznaczeni białkiem fluorescencyjnym, tandemowym dimerem pomidorowym (tdTomato), są następnie umieszczani w kulturze neuronów astrocytów/kory mózgowej następnego dnia i pozostawiani do różnicowania przez 28 do 35 dni. Wykazaliśmy, że system ten tworzy połączenia synaptyczne między neuronami pochodzącymi z iPSC a neuronami korowymi, co jest widoczne we wzroście częstotliwości prądów synaptycznych po fotostymulacji neuronów korowych. Ten system współhodowli stanowi nowatorską platformę do oceny zdolności neuronów pochodzących z iPSC do tworzenia połączeń synaptycznych z innymi populacjami neuronów.

Wprowadzenie

W ostatnich latach nasze zrozumienie neuronów i funkcji obwodów neuronalnych zostało zrewolucjonizowane przez kilka narzędzi optogenetycznych, które kontrolują pobudliwość neuronów. Jednym z takich narzędzi jest aktywowany światłem kanał kationowy, rodopsyna kanałowa-2 (ChR2): neurony wyrażające potencjały czynnościowe ChR2 w odpowiedzi na stymulację światłem1-3. Ponieważ neurony zwykle nie są wrażliwe na światło, ta niezwykła zdolność otwiera nowe możliwości precyzyjnej czasowej i przestrzennej kontroli aktywności genetycznie zdefiniowanych populacji neuronów4 i znacznie przyspieszyła badania nad funkcjonowaniem mózgu. ChR2 został zastosowany w badaniach nad komórkami macierzystymi do różnych celów, od monitorowania rozwoju neuronów5 po regulację aktywności sieci neuronowych6.

Tutaj użyliśmy ChR2, aby zwiększyć użyteczność systemu kokultury neuronów. Systemy kohodowli umożliwiają ocenę interakcji między różnymi typami komórek. Kohodowle neuronów i gleju, głównych typów komórek układu nerwowego, są powszechnie stosowane do badania sygnalizacji między tymi różnymi typami komórek, a także do oceny znaczenia tej sygnalizacji dla odpowiedzi fizjologicznych, propagacji uszkodzeń i do badania mechanizmów molekularnych, które są potencjalnie zaangażowane w tę sygnalizację7. Poprzednie badanie wykazało, że ludzkie iPSC bardzo szybko różnicują się w neurony w obecności pierwotnej kultury kory mózgowej szczura zawierającej neurony, astrocyty, oligodendrocyty i mikroglej8.

W tym protokole demonstrujemy metodę, która wykorzystuje ChR2 w systemie kohodowlanym do badania połączeń synaptycznych między neuronami korowymi szczura a neuronami pochodzącymi z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Opisujemy etapy preparowania i pobierania tkanek mózgowych9, a także utrzymywania i różnicowania mysich nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w astrocyty i ludzkich NPC w neurony w celu stworzenia systemu kohodowli. Aby ustanowić ten system kokultur, użyliśmy metody przeprogramowania bez integracji opisanej przez Okita i wsp.10 w celu wytworzenia ludzkich iPSC. Te iPSC zostały następnie skutecznie zróżnicowane w NPC w warunkach zdefiniowanych chemicznie przy użyciu małocząsteczkowych inhibitorów, jak opisali Li i wsp.11

W kokulturach, różne populacje neuronów mogą być identyfikowane poprzez wykrywanie ekspresji ChR2 w neuronach korowych i oznaczanie neuronów pochodzących z iPSC za pomocą białka fluorescencyjnego, tandemowego dimeru pomidorowego (tdTomato). Połączenie zapisów elektrofizjologicznych z neuronów pochodzących z iPSC z optogenetyczną fotostymulacją neuronów korowych pozwala na ocenę zdolności tych dwóch typów neuronów do tworzenia ze sobą obwodów. W szczególności fotostymulacja neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2 wywołuje reakcje synaptyczne w neuronach pochodzących z iPSC, które utworzyły obwody synaptyczne z fotostymulowaną siecią neuronów korowych. Wykazaliśmy, że w takich warunkach zwiększone prądy postsynaptyczne są rzeczywiście wykrywane w neuronach pochodzących z iPSC. Protokół ten umożliwia ocenę obwodów synaptycznych w różnych warunkach eksperymentalnych, w tym rekapitulację różnych modeli chorób neurologicznych przy użyciu iPSC pochodzących z fibroblastów pacjentów z chorobą.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w SingHealth.

1. Pozyskiwanie wczesnych mózgów myszy po urodzeniu

  1. Przed sekcją należy przygotować roztwór do trawienia tkanek hipokampa: 10 μl papainy na 1 ml 1x Zbilansowany roztwór soli Earle'a (EBSS) (+ 1% HEPES) z dezoksyrybonukleazą I (DNaza I) (250 U/ml) i Dypazą II (1 U/ml). Przygotować około 2,5 ml roztworu do wytrawiania tkanek i przefiltrować go za pomocą jednostki filtrującej 0,20 μm. Roztwór należy utrzymywać w cieple w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
  2. Znieczulenie szczeniąt myszy w 5. dniu porodowym (P5) należy umieścić je w lodzie na 5 minut. Zdejmij z lodu i przetestuj odruch bólowy przez uszczypnięcie palca u nogi lub ogona. Spryskaj szczenięta 70% etanolem. Odetnij głowy szczeniętom i umieść głowy na szalce Petriego nad lodem.
  3. Wykonaj nacięcie w skórze wzdłuż linii środkowej, od podstawy czaszki do nosa, za pomocą małych nożyczek lub cienkich kleszczy preparacyjnych. Otwórz skórę i wykonaj podobne nacięcie przez czaszkę. Wykonaj dwa dodatkowe poziome nacięcia po każdej stronie czaszki, jedno rostralne (przy bregmie) i jedno ogonowe (przy lambdzie).
  4. Otwórz czaszkę wzdłuż naciętych linii, aby odsłonić leżący pod spodem mózg. Użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę leżącą nad opuszkami węchowymi i wszelką kość pośrodku między nimi. Zrób to, trzymając głowę stabilnie za pomocą kleszczy w dłoni niepreparującej.
  5. Poluzuj płaską część szpatułki między brzuszną częścią mózgu a podstawą czaszki na końcu ogonowym. Trzymając szpatułkę równolegle do podstawy czaszki pod mózgiem, przesuń ją w kierunku rostralnego końca czaszki, aby przeciąć wszelkie zrosty między mózgiem a podstawą czaszki.
    1. Wyjmij mózg szpatułką i umieść go na szalce Petriego zawierającej lodowaty 1x EBSS (+ 1% HEPES). Utrzymuj tkanki zanurzone przez cały czas.
  6. Na wszystkich etapach mikropreparacji pracuj pod mikroskopem preparacyjnym i użyj pary cienkich kleszczy preparacyjnych w każdej ręce, jeden do cięcia tkanki, a drugi do stabilnego utrzymywania tkanki.
  7. Wykonaj cięcie tuż za korą mózgową, aby oddzielić ją od tyłomózgowia. Przetnij wzdłuż linii środkowej, aby oddzielić korę mózgową na dwie półkule. Usuń opony mózgowe z półkul mózgowych.
  8. Umieść półkulę przyśrodkową do góry i włóż kleszcze do bocznej komory pod hipokampem. Odetnij śródmózgowie.
    1. Wykonaj nacięcia na górnym i dolnym końcu hipokampa oraz w pobliżu połączenia zębatego / kory śródwęchowej, aby odizolować hipokamp od kory. Zbierz hipokampy w naczyniu zawierającym lodowaty 1x EBSS (+ 1% HEPES).

2. Dysocjacja tkanki hipokampa

  1. Przenieś hipokampy do naczynia zawierającego wstępnie podgrzany roztwór do trawienia tkanek hipokampa. Tkanki hipokampa rozdrobnić do jak najdrobniejszych rozmiarów i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Delikatnie rozdzielić tkanki na pojedyncze komórki za pomocą mechanicznego pipetowania i przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  3. Wirować przy 200 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
  4. Zawiesić osad komórkowy w 20 ml 0,5x Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) zawierający sacharozę (0,9 M) i odwirować przy 200 x g przez 10 min.
  5. Usunąć supernatant i zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki konserwacyjnej NPC (Tabela 1), umieścić na 10 ml 4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w roztworze 1X EBSS i odwirować przy 200 x g przez 5 min.
  6. Usuń supernatant i dodaj mysią pożywkę konserwacyjną NPC (Tabela 1) do osadu komórkowego. Delikatnie pipetuj w górę i w dół 5-10 razy, aby upewnić się, że osad komórkowy został rozbity na pojedyncze komórki.
  7. Przenieść podłoże zawierające komórki do wstępnie powlekanych płytek Matrigel i dodać naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2) (oba po 20 ng / ml) w heparynie (5 mg / ml). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

3. Utrzymanie przylegających mysich hipokampów NPC

  1. Przygotować powlekane płytki/kolby co najmniej godzinę przed pasażowaniem mysich hipokampowych NPC. Dodać tyle Matrigelu, aby pokryć powierzchnię każdej płytki lub kolby i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  2. Usuń pożywkę z 90% zlewających się mysich kultur NPC i przemyj raz 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), a następnie odessaj PBS.
  3. Dodać tyle roztworu do oddzielania komórek, aby pokryć wszystkie studzienki/kolby i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Upewnij się, że wszystkie komórki odłączyły się, patrząc pod mikroskop odwróconego jasnego pola pod 10-krotnym powiększeniem. Jeśli nadal są przyczepione komórki, inkubuj naczynie hodowlane przez kolejne 1-2 minuty i ponownie sprawdź komórki. Dodać dwukrotnie większą ilość zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium/mieszanki składników odżywczych F-12 szynki (DMEM/F-12) firmy Dulbecco niż roztworu oddzielającego komórki do studzienek/kolb po odłączeniu wszystkich komórek.
  5. Przenieść komórki zawierające DMEM/F-12 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 200 x g przez 5 minut.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml mysiej pożywki do konserwacji NPC (Tabela 1). Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozbić osad komórkowy na pojedyncze komórki.
  7. Umieścić jedną trzecią wszystkich komórek w nowych dołkach/kolbach hodowlanych i uzupełnić wystarczającą ilość pożywki hodowlanej uzupełnionej EGF i FGF2. Inkubować naczynia hodowlane w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 . Uzupełniaj pożywkę co drugi dzień i dziel komórki 1:3 co 3 do 4 dni. Unikaj przerostu mysich kultur NPC, aby zapobiec agregacji i oderwaniu.

4. Różnicowanie mysich NPC na astrocyty

  1. Przygotuj 12-milimetrowe okulary ochronne pokryte poli-L-lizyną (PLL)/lamininą co najmniej dzień wcześniej przed rozpoczęciem różnicowania mysich NPC w astrocyty. Dodać szkiełka nakrywkowe do płytki 24-dołkowej i pokryć całą powierzchnię studzienek wystarczającą ilością PLL (1 mg/ml w buforze boranowym).
    1. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia usuń PLL i umyj raz 1x PBS.
  2. Dodać lamininę (1 mg/ml w lodowatym DMEM/F-12), ponownie pokrywając całą powierzchnię każdej studzienki, a następnie inkubować przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Usuń pożywkę z mysich kultur NPC i umyj raz 1x PBS, a następnie odessaj PBS.
  4. Dodać tyle roztworu do oddzielania komórek, aby pokryć wszystkie studzienki/kolby i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Upewnij się, że wszystkie komórki zostały odłączone, a następnie dodaj do studzienek/kolb dwukrotnie większą ilość DMEM/F-12 niż roztworu do oddzielania komórek.
  6. Przenieść komórki zawierające DMEM/F-12 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 200 x g przez 5 minut.
  7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki do różnicowania astrocytów (Tabela 1). Delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę i w dół, aby rozbić osad komórek na pojedyncze komórki. Policz liczbę pojedynczych komórek za pomocą hemocytometru.
  8. Komórki płytki o wymiarach 5 x 104 komórki/cm2 w 500 μl pożywki na każde dołek płytki 24-dołkowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zastąp połowę pożywki świeżą pożywką co drugi dzień. Mysie NPC szybko różnicują się w astrocyty w ciągu 2 dni i różnicują się przez tydzień przed rozpoczęciem dalszych eksperymentów.

5. Pobieranie embrionalnych mózgów szczurów i dysocjacja tkanki korowej

  1. Usunąć pożywkę różnicującą astrocyty (Tabela 1) z kultur astrocytów i zastąpić pożywką neuronów pierwotnych (Tabela 1) co najmniej 4 godziny przed rozpoczęciem pobierania embrionalnych mózgów szczurów.
  2. Przed sekcją należy przygotować roztwór do trawienia tkanek korowych: 10 μl papainy na 1 ml 1x EBSS (+ 1% HEPES) z 12,1 mg/ml L-cysteiny. Przygotować około 2,5 ml roztworu do wytrawiania tkanek i przefiltrować go za pomocą jednostki filtrującej 0,20 μm. Roztwór należy utrzymywać w cieple w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
  3. Poddaj ciężarną matkę eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla przy użyciu sprężonego gazu. Przetestuj odruch bólowy przez uszczypnięcie palca u nogi lub ogona.
  4. Połóż zwierzę brzuszną stroną do góry na podkładce chłonnej i nasącz jego brzuch 70% etanolem. Uszczypnij skórę kleszczami i wykonaj boczne nacięcie nożyczkami chirurgicznymi, wystarczająco szerokimi, aby odsłonić brzuch. Chwyć otrzewną kleszczami i rozetnij jamę brzuszną.
  5. Podnieś róg macicy za pomocą kleszczy i odetnij go wzdłuż mezometrium. Umieść wypreparowaną macicę na szalce Petriego nad lodem. Oddziel każdy zarodek, przecinając tkankę macicy między nimi.
    1. Wykonaj nacięcie w worku embrionalnym. Delikatnie wyłuskaj płód przez otwór. Odetnij głowę płodu i umieść głowę na szalce Petriego nad lodem.
  6. Aby zebrać embrionalne mózgi szczurów, postępuj zgodnie z opisem z kroków od 1.3 do 1.5.
    1. Aby wypreparować tkanki korowe, umieść półkulę mózgu boczną stroną do góry. Przetnij półkulę na dwie części bocznie od środka. Wyrzuć połowę bliżej podstawy mózgu. Przytnij wyciętą tkankę, aby usunąć śródmózgowie.
  7. Przenieść tkanki korowe do naczynia zawierającego wstępnie podgrzany roztwór do trawienia tkanek korowych. Tkanki korowe rozdrobnić do możliwie najdrobniejszej objętości i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Przenieść tkanki korowe z roztworu do trawienia tkanek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki dla neuronów pierwotnych (Tabela 1). Oddzielić tkanki korowe poprzez wielokrotne pipetowanie ich w górę i w dół w pipecie serologicznej, aż do uzyskania jednorodnego roztworu bez kawałków tkanki.
  9. Przepuść roztwór tkankowy przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm, aby odfiltrować pozostałe grudki tkanek. Roztwór tkankowy rozdzielić na 15 ml probówek wirówkowych, dodając około 3 ml do każdej probówki.
  10. Dodaj 800 μl 7,5% BSA w 1x PBS na dno każdej probówki, tworząc dwie warstwy z roztworem tkankowym na górze i BSA na dole.
  11. Wirować przy 200 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant, zasysając go z powierzchni styku dwóch warstw. Unikaj naruszania osadu komórkowego na dnie tuby.
  12. Zawiesić każdą osadkę komórkową w 1 ml pierwszorzędowej pożywki neuronalnej (Tabela 1) i połączyć je w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru.

6. Elektroporacja i galwanizacja pierwotnych neuronów korowych

UWAGA: Transfer genów można osiągnąć za pomocą kilku metod, w tym elektroporacji, transfekcji fosforanu wapnia i transdukcji wirusa. W tym protokole opisujemy elektroporację w celu dostarczenia konstruktu ChR2 do pierwotnych neuronów korowych.

  1. Odwirować 6 x 106 neuronów korowych szczura przy 200 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Co najmniej 6 x 106 neuronów korowych jest wymaganych do elektroporacji, aby zapewnić tworzenie sieci neuronowej przez neurony, które przeżyły.
  2. Dodać 100 μl roztworu do elektroporacji do osadu ogniw i delikatnie zawiesić. Połącz 100 μl zawiesiny komórek z 6 μg plazmidu pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE4 i przenieś do certyfikowanej kuwety. Unikaj wytwarzania pęcherzyków powietrza podczas przenoszenia.
  3. Wybierz i zastosuj odpowiedni program do elektroporacji zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Po elektroporacji dodać 500 μl MEM do zawiesiny komórki/DNA do kuwety. Przenieść próbkę do 11,5 ml pożywki dla neuronów pierwszorzędowych (Tabela 1) i delikatnie zawiesić ponownie. Całkowita ilość podłoża wystarcza na całą płytkę 24-dołkową. Podwielokrotność 500 μl pożywki na każde zagłębienie płytki 24-dołkowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

7. Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

UWAGA: Ta metoda została zaadaptowana z Okita et al.10

  1. Hodowla ludzkich fibroblastów w DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w płytkach 6-dołkowych.
  2. Przed przystąpieniem do przeprogramowywania fibroblastów należy pokryć 6-dołkowe preparaty Matrigel i inkubować przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej. Przy 80% zbiegu usuń pożywkę z kultur fibroblastów i przemyj raz 1x PBS.
  3. Dodać wystarczającą ilość 0,25% trypsyny-EDTA, aby pokryć całą płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  4. Gdy komórki zostaną usunięte z dołków, dodaj dwa razy więcej DMEM z 10% FBS niż trypsyny, aby wygasić trawienie trypsyny. Delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę i w dół, aby rozbić komórki. Policz liczbę pojedynczych komórek za pomocą hemocytometru.
  5. Przenieść 7 x 105 komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórek o sile 200 x g przez 5 minut.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad ogniwa w roztworze do elektroporacji. Elektroporować fibroblasty zgodnie z instrukcjami producenta. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu do elektroporacji i dodać 1 μg każdego wektora episomalnego. Ogniwa elektroporacyjne o nastawach 1 650 V, 10 ms i 3 impulsach czasowych.
  7. Przenieś zawiesinę komórek do DMEM uzupełnioną 10% FBS i płytką 5 x 104 komórki na dołek płytki 6-dołkowej. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  8. Po 48 godzinach usunąć pożywkę z transfekowanych kultur fibroblastów i zastąpić pożywką mTeSR. Pożywkę hodowlaną należy wymieniać codziennie, aż indukowane kolonie pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) będą gotowe do wyizolowania. Kolonie iPSC można zaobserwować po 28-35 dniach.
  9. Gdy będziesz gotowy do izolacji, mechanicznie przeciąć kolonię iPSC i ponownie zasiać w pożywce mTeSR z inhibitorem 10 μM kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) (Y-27632) na 6-dołkowej płytce pokrytej Matrigelem12. Codziennie wymieniaj pożywkę hodowlaną.

8. Indukcja neuronalna i utrzymanie ludzkich NPC

UWAGA: Ta metoda została opisana przez Li et al.11

  1. Gdy zbieżność kultur iPSC wynosi około 20%, należy usunąć pożywkę mTeSR i zastąpić ją pożywką do indukcji neuronalnej (Tabela 1). Uzupełniaj podłoże co drugi dzień.
  2. Po 7 dniach usuń pożywkę do indukcji neuronów i zastąp ją pożywką do konserwacji NPC dla ludzi (Tabela 1). Uzupełniaj pożywkę co drugi dzień do 7 dni przed pasażowaniem kultur.
  3. Przed kulturami pasażowymi pokryć płytki/kolby Matrigelem w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę.
  4. Usuń pożywkę z konflujących się ludzkich kultur NPC i umyj raz 1x PBS, a następnie odessaj PBS.
  5. Dodać tyle roztworu do oddzielania komórek, aby pokryć wszystkie studzienki, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Upewnij się, że wszystkie komórki zostały odłączone. Dodać do studzienek/kolb dwukrotnie większą ilość DMEM/F-12 niż roztworu do oddzielania komórek.
  7. Przenieść komórki zawierające DMEM/F-12 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 200 x g przez 5 minut.
  8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml ludzkiej pożywki do konserwacji NPC (Tabela 1). Delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę i w dół, aby rozbić komórki.
  9. Umieścić jedną trzecią wszystkich komórek w studzienkach/kolbach hodowlanych pokrytych Matrigelem i uzupełnić wystarczającą ilość pożywki uzupełnionej 10 μM Y-27632. Inkubować naczynia hodowlane w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 .
    1. Dziel kultury 1:3 co 3 do 4 dni i uzupełniaj podłoże co drugi dzień. Utrzymuj ludzkie kultury NPC w dużym zagęszczeniu, aby zapobiec różnicowaniu.

9. Różnicowanie ludzkich NPC na neurony w kokulturach

  1. Dodaj wektor lentiwirusowy Synapsin1-tdTomato do ludzkiej kultury NPC przed zainicjowaniem różnicowania w neurony. Przygotuj kohodowle astrocytów i neuronów korowych z jednodniowym wyprzedzeniem przed różnicowaniem ludzkich NPC.
  2. Umyć ludzkie kultury NPC raz 1x PBS i dodać tyle roztworu do oddzielania komórek, aby pokryć wszystkie studzienki/kolby, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Upewnij się, że wszystkie komórki zostały odłączone. Dodać do studzienek/kolb dwukrotnie większą ilość DMEM/F-12 niż roztworu do oddzielania komórek. Przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki różnicującej neurony (Tabela 1). Delikatnie pipetuj zawiesinę komórek w górę i w dół, aby rozbić osad komórek na pojedyncze komórki. Policz liczbę pojedynczych komórek za pomocą hemocytometru.
  5. Ostrożnie odessać pożywkę z kultur neuronów astrocytów/kory mózgowej. Płytka ludzkich NPC w 5 x 103 komórki/cm2 w 500 μl pożywki różnicującej neurony (Tabela 1) uzupełniona 10 μM Y-27632 dla każdego 24-dołka. Delikatnie dodaj pożywkę zawierającą ludzkich NPC do każdej studzienki, aby uniknąć zakłócenia astrocytów i neuronów korowych.
  6. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zastępuj połowę pożywki świeżą pożywką co dwa do trzech dni przez co najmniej 28 dni.

10. Zapisy elektrofizjologiczne neuronów pochodzących z iPSC

  1. Sprawdź, czy ludzkie iPSC zachowują się jak dojrzałe neurony.
    1. Znajdź komórki różniące się od ludzkich iPSC poprzez wizualizację tdTomato za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w soczewkę zanurzeniową 60X (0,9 NA).
    2. Pociągnąć pipetę rejestrującą do oporu od 4 do 6 M. Komory perfuzyjne w temperaturze pokojowej w roztworze zewnętrznym (Tabela 1) stale bąbelkowane 95%O2/5%CO2. Napełnić mikropipetę rejestrującą roztworem wewnętrznym (Tabela 1).
    3. Łat tdTomato+ ogniwo w trybie całego ogniwa i rejestruj wyzwolenie potencjału czynnościowego w odpowiedzi na wstrzyknięcie prądu (czas trwania 1 s, przyrosty 10 pA) w cęgach prądowych.
  2. Sprawdź, czy potencjał czynnościowy komórek korowych eksprymujących ChR2 jest niezawodnie wywoływany przez stymulację światłem.
    1. Znajdź komórki korowe wyrażające ChR2 poprzez wizualizację GFP pod mikroskopem konfokalnym. Wykonaj zapis klamry krosowej całej komórki na komórkach korowych, wykonując kroki od 10.1.2 do 10.1.3.
    2. Sprawdzenie, czy potencjał czynnościowy jest niezawodnie wywoływany przez oświetlenie świetlne rtęciową lampą łukową (100 W). Długość fali filtra wzbudzenia wynosi 480/40 nm.
  3. Wykonaj stymulację optogenetyczną.
    1. Łat ogniwo tdTomato+ w trybie całego ogniwa i ustaw cęgi napięciowe na -70mV. Filtruj sygnały prądowe przy 2 kHz i digitalizuj przy 10 kHz. Rezystancja serii monitorów w zakresie od 10 do 20 M zapewnia spójność podczas nagrań.
    2. Stymulowanie całego pola przez lampę rtęciową o mocy 100 W z filtrem wzbudzenia 480/40 nm przez 30 sek.
    3. Rejestruj prądy postsynaptyczne (PSC) łatanych komórek indukowane przez fotostymulację presynaptycznych neuronów korowych eksprymujących ChR2. Wykrywanie i pomiar PSC. Ustaw próg dla obszaru amplitudy i prądu odpowiednio na 5 pA i 20 pC. Ręcznie sprawdź te zdarzenia, aby odrzucić wszystkie ślady inne niż PSC.

Wyniki

W niniejszym materiale przedstawiono protokół opisujący wieloetapowy proces tworzenia kokultury składającej się z astrocytów, neuronów korowych i neuronów ludzkich. Ludzkie iPSC uzyskano poprzez reprogramowanie fibroblastów z użyciem wektorów episomalnych10, a następnie zróżnicowano w kierunku linii neuronalnej za pomocą koktajlu inhibitorów małocząsteczkowych, otrzymując NPC11, które utrzymywano w wysokiej gęstości (Rycina 1A). Do stworzenia kokultury wymagane jest przeprowadzenie kilku etapów: zróżnicowania mysich NPC w astrocyty, wysiania szczurzych neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2 oraz wysiania ludzkich NPC znakowanych tdTomato (Rycina 1B). W 2. dniu różnicowania w naszych kulturach można łatwo zaobserwować astrocyty GFAP+ (białka kwaśnego włókienka gliało-fibrylarnego) (Rycina 1C). Myszim NPC pozwolono różnicować się przez co najmniej tydzień przed wysianiem neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2 na monowarstwę astrocytów (Rycina 1D). Po 3 do 4 tygodniach różnicowania ludzkich NPC w kulturach wykryto neurony tdTomato+ (Rycina 1E).

Ten system kokultury umożliwia spójną detekcję prądów postsynaptycznych z pojedynczych neuronów pochodzących z iPSC w odpowiedzi na stymulację światłem (Rycina 2A). Po stymulacji światłem w neuronach korowych wykazujących ekspresję ChR2 generowane były potencjały czynnościowe (Rycina 2B). Neurony pochodzące z iPSC są również pobudliwe (Rycina 2C), wykazując zwiększoną częstotliwość wyładowań potencjałów czynnościowych wraz ze wzrostem amplitudy depolaryzujących impulsów prądowych (Rycina 2D). Zatem komórki te wykazują dojrzałe właściwości neuronalne. W absence światła neurony pochodzące z iPSC otrzymywały spontaniczne sygnały synaptyczne (Rycina 2E). Te dośrodkowe prądy postsynaptyczne były pośredniczone głównie przez receptory AMPA, ponieważ prądy przez receptory GABA byłyby odśrodkowe, a receptory NMDA nie przewodzą prądu przy potencjale spoczynkowym -70 mV. Przynajmniej część tych sygnałów pochodziła z presynaptycznych neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2, ponieważ stymulacja światłem znacznie zwiększyła częstotliwość prądów postsynaptycznych (Rycina 2E). Przebieg czasowy tego wzrostu sygnałów synaptycznych przedstawiono na Rycini 2F: fotostymulacja neuronów korowych była utrzymywana przez cały czas trwania 30 s błysku światła. Podczas gdy częstotliwość PSC była podwyższona podczas fotostymulacji neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2 (Rycina 2G), ich amplituda nie uległa zmianie (Rycina 2H). Podsumowując, wyniki te wskazują, że neurony pochodzące z iPSC wykazują dojrzałe właściwości neuronalne i mogą tworzyć połączenia synaptyczne z presynaptycznymi neuronami korowymi.

Oś czasu różnicowania iPSC; przeprogramowanie fibroblastów; indukcja NPC i neuronów; obrazy z mikroskopii.
Rycina 1: Schematy generowania systemu kokultury. (A) Oś czasu przeprogramowania ludzkich fibroblastów do iPSC oraz indukcji neuronalnej do NPC. (B) Oś czasu różnicowania końcowego ludzkich NPC w dojrzałe neurony na kulturach neuronów korowych i astrocytów. (C) Mysie NPC szybko różnicują się w astrocyty GFAP+ po 2 dniach in vitro. (D) Po jednym tygodniu neurony korowe wykazujące ekspresję ChR2 zostały wysiane na astrocyty GFAP+. (E) Od 4 do 5 tygodni po różnicowaniu ludzkich NPC przeprowadzono pomiary elektrofizjologiczne neuronów tdTomato+. Paski skali oznaczają 100 µm.

Aktywacja optogenetyczna neuronów pochodzących z iPSC; stymulacja ChR2, analiza danych elektrofizjologicznych.
Rysunek 2: Analiza optogenetyczna funkcjonalnej łączności synaptycznej. (A) Komórki pochodzące z iPSC znakowane tdTomato (czerwony) współhodowano z neuronami korowymi wykazującymi ekspresję kanału aktywowanego światłem, ChR2 (zielony). Rejestracje z neuronów pochodzących z iPSC ujawniły odpowiedzi w postaci prądów postsynaptycznych (PSC), które mogły pochodzić zarówno z neuronów korowych, jak i z innych neuronów pochodzących z iPSC. (B) Naświetlanie (niebieski pasek) wywołało serię potencjałów czynnościowych w neuronach korowych wykazujących ekspresję ChR2. (C)Komórki pochodzące z iPSC są aktywowane poprzez wstrzyknięcie prądu. (D) Krzywa częstotliwości wyładowań w funkcji prądu dla komórek pochodzących z iPSC. (E) Fotostymulacja neuronów korowych wykazujących ekspresję ChR2 (niebieski pasek) zwiększyła częstotliwość PSC w neuronach pochodzących z iPSC. (F)Przebieg czasowy zwiększenia częstotliwości PSC wywołanego fotostymulacją. Niebieski pasek oznacza czas fotostymulacji. (G, H) Podczas gdy częstotliwość PSC wzrosła pod wpływem fotostymulacji (G), amplituda PSC nie uległa zmianie (H). * oznacza p < 0,05 w porównaniu do kontroli, test t studenta.

Dyskusja

Optogenetyka zapewnia czasową i przestrzenną precyzję aktywacji zdefiniowanych populacji neuronów13. W naszych eksperymentach całe pole obiektywu mikroskopu było oświetlane przez 30 sekund, aby fotostymulować tylko neurony korowe wyrażające ChR2. Pozwoliło nam to ustalić, czy połączenia synaptyczne zostały utworzone między różnymi populacjami neuronów w obrębie kokultury. Nasze wyniki ujawniły, że fotostymulacja zwiększa częstotliwość PSC w neuronach pochodzących z iPSC, co pokazuje, że neurony te otrzymują dane synaptyczne z presynaptycznych neuronów korowych eksprymujących ChR2. To z kolei pozwoliło ustalić, że neurony pochodzące z iPSC z powodzeniem integrują się z obwodami z neuronami korowymi.

Istnieje kilka kluczowych etapów tworzenia tego systemu kokultur. Ważne jest, aby upewnić się, że hodowle astrocytów pochodzące z mysich NPC są zdrowe, z minimalną śmiercią komórki, przed przystąpieniem do posiewu innych typów komórek. Neurony korowe i ludzcy NPC dobrze przyczepiają się do zdrowych astrocytów, a zapisy elektrofizjologiczne zależą w dużym stopniu od warunków hodowli. Innymi kluczowymi krokami w tym protokole są elektroporacja i posiew neuronów korowych na kulturach astrocytów. Ponieważ duża liczba komórek umiera po elektroporacji, ważne jest, aby upewnić się, że co najmniej 6 milionów neuronów korowych jest elektroporowanych w celu posiewu na kulturach astrocytów na 24-dołkowych płytkach. Zaobserwowaliśmy, że gdy mniej niż 6 milionów komórek zostało poddanych elektroporacji, liczba neuronów, które przeżyły, nie tworzyła gęstej sieci neuronalnej, co wpływało na zapisy elektrofizjologiczne. Liczba elektroporowanych neuronów korowych powinna być również spójna dla każdego eksperymentu z udziałem współkultur, aby umożliwić porównanie różnych badań. W przypadku wszystkich etapów związanych z trawieniem enzymatycznym ważne jest, aby nie pozostawiać komórek w roztworze trawiennym zbyt długo, ponieważ może to prowadzić do śmierci komórki.

Podejście to można wykorzystać do badania przesiewowego zdolności neuronów pochodzących z fibroblastów specyficznych dla pacjenta do tworzenia kontaktów synaptycznych z innymi neuronami. Neurony pochodzące z fibroblastów od pacjentów cierpiących na zaburzenie neurorozwojowe Zespół Retta (RTT) wykazują defekty transmisji synaptycznej: neurony RTT wykazują znaczny spadek częstotliwości i amplitudy PSC w porównaniu ze zdrowymi neuronami, prawdopodobnie z powodu mniejszej łączności synaptycznej14. Nasz system kohodowli pozwala na badanie wpływu leków na neurony wykazujące wady rozwojowe. Można to przeprowadzić poprzez dodawanie interesujących związków podczas wysiewu chorych ludzkich NPC, a także podczas ciągłej ekspozycji na związki przez cały czas różnicowania neuronów.

Chociaż ten system kohodowli może być również używany jako model do testowania leków, ograniczeniem tego podejścia jest to, że proces badania skutków każdego kandydującego związku może być długi i żmudny, ponieważ nie jest to wysokoprzepustowa metoda przesiewowa. Po leczeniu związkami kandydującymi, neurony pochodzące z iPSC muszą być indywidualnie łatane, aby określić wpływ każdego związku na PSC. Co więcej, obecnie nie ma wielu dostępnych fibroblastów i iPSC od pacjentów. W związku z tym w najbliższej przyszłości interesujące będzie posiadanie większej liczby komórek pacjentów, a także dostosowanie tego protokołu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Na przykład, znakując neurony pochodzące z iPSC za pomocą wskaźnika aktywności, takiego jak genetycznie kodowane czujniki jonów lub potencjału błonowego, możliwe byłoby znaczne zwiększenie przepustowości poprzez pominięcie czasochłonnej procedury elektrofizjologicznej. Ponieważ cały proces generowania tego systemu kohodowli, od przeprogramowania fibroblastów po wykonywanie zapisów elektrofizjologicznych, wymaga ponad 90 dni, zaleca się, aby ludzkie iPSC lub NPC zostały namnażone, po odpowiednio etapach przeprogramowania i indukcji neuronalnej, i kriokonserwowane w celu skrócenia czasu potrzebnego na przyszłe eksperymenty.

W naszych eksperymentach wykazaliśmy ekspresję ChR2 w neuronach korowych pod promotorem synapsyny1. Ponieważ ten promotor jest panneuronalny, przypuszczalnie fotostymulowaliśmy zarówno hamujące, jak i pobudzające neurony korowe. Jeśli celem przyszłych eksperymentów jest specyficzne badanie obwodów hamujących lub pobudzających, można zastosować bardziej specyficzne promotory. Alternatywnie, neurony korowe można uzyskać od myszy transgenicznych (lub wstrzykniętych wirusem), u których ekspresja ChR2 jest specyficznie ukierunkowana na genetycznie zdefiniowane subpopulacje neuronów. Na przykład pobranie tkanek korowych od myszy, u której rekombinaza Cre ulega ekspresji w interneuronach zawierających parwalbuminę (interneurony PV), która jest krzyżowana z myszą z floksowanym ChR2, da sytuację, w której jedynymi neuronami korowymi wyrażającymi ChR2 będą interneurony PV15. Zastosowanie takich interneuronów wykazujących ekspresję ChR2 w naszym systemie kohodowli umożliwi określenie, czy neuron pochodzący z iPSC jest w stanie włączyć się do obwodu z interneuronami PV.

Na podstawie poprzedniego badania9 stwierdzono, że neurony korowe są dojrzałe z nakładającymi się dendrytami po 14 dniach in vitro. Tak więc, jeśli fotostymulacja nie wywołuje odpowiedzi z łatanego neuronu pochodzącego z iPSC, powinno to wskazywać, że neuron nie ma zdolności do tworzenia połączeń synaptycznych z neuronami korowymi. Neuron pochodzący z iPSC jest w stanie odbierać sygnały synaptyczne z innych neuronów pochodzących z iPSC lub neuronów korowych. Gdyby użyto tradycyjnych nagrań z zaciskiem krosowym, nie byłoby możliwe rozróżnienie, skąd pochodzi wejście synaptyczne. Zaletą naszego systemu jest to, że odpowiedzi postsynaptyczne z korowego sygnału presynaptycznego mogą być selektywnie wywoływane i identyfikowane. Przedstawione tutaj procedury zapewniają proste podejście do oceny zdolności neuronów pochodzących z iPSC do integracji ze zdefiniowaną siecią neuronalną.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy K. Deisseroth i S. Je za odpowiednio konstrukcje lentiwirusowe ChR2 i Synapsin1-tdTomato, C. Chai za podzielenie się wiedzą i protokołem generowania iPSC, W.Y. Leongowi za wsparcie techniczne, członkom laboratorium Goh za podzielenie się odczynnikami i ekspertyzą. Prace te były wspierane przez Abbott Nutrition i Academic Centre of Excellence (ACE) Research Award od GlaxoSmithKline (GSK) dla E.L.G., przez National Research Foundation Singapore w ramach Konkurencyjnego Programu Badawczego (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) dla E.L.G. i G.J.A., a także przez program World Class Institute (WCI) Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji. Science and Technology of Korea (MEST) (numer grantu NRF: WCI 2009-003) na rzecz G.J.A.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do proliferacji Neurocult (mysz)STEMCELL Technologies5702Zawiera pożywkę podstawową NSC i suplement proliferacyjny NSC
Epi5 Episomal iPSC Reprogramming KitInvitrogenA15960
DMEM/F12Lonza12719F
MatrigelBD Biosciences354277
Neurobasel mediumInvitrogen
MEM bez glutaminyInvitrogen11090081
N2Invitrogen17502048
B27Invitrogen17504044
L-glutaminaInvitrogen25030081
suplement GlutaMAXInvitrogen35050061
PenStrepInvitrogen15140122
BSASigmaA7906
Human LIFInvitrogenPHC9484
CHIR99021Miltenyi Biotech130103926
SB431542SigmaS4317
Compound EMerck Millipore565790
EGFMerck Millipore324856
FGF2R& D Systems233FB025
Klasa badawcza FBSThermo ScientificSV30160.03Do podłoża różnicowania astrocytów
Zdefiniowany FBSThermo ScientificSH30070.03Dla pierwotnego podłoża neuronowego
PBSThermo ScientificSH30028.02
GlukozaSigmaG8270Dla pierwotnego podłoża neuronowego
SacharozaSigmaS0389
HeparynaEMD Milipore375095
PapainaWorthington3126
HBSSInvitrogen14175095
DNase IRoche10104159001
Dispase IISTEMCELL Technologies7923
HEPESGibco15630080Dla zbieranie mózgów
EBSSInvitrogen14155063
L-CysteinaSigmaC7352
Trypsyna-EDTAInvitrogen25200056
70 &mikro; m sitko komórkoweBD Biosciences   352350
20 &mikro; m jednostka filtrującaSartorius Stedim16534K
NaClSigmaS7653
KClSigmaP5405
NaHCO3SigmaS5761
NaH2PO4Fluka71505
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
D(+)-GlucoseSigmaG7520Do badań elektrofizjologicznych
K-glukonianSigmaP1847
KOHKANTO Chemical3234400
HEPESSigmaH3375Do badań elektrofizjologicznych
EGTASigmaE3889
Na2ATPSigmaA7699
Na3GTPSigmaG8877
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoŚwiatowe instrumenty precyzyjne, Inc1604323
15 ml probówka wirówkowaBD Biosciences 
Probówka wirówkowa 50 mlBD Biosciences352070
Płytki 24-dołkoweCorning9761146
Płytki 6-dołkoweKolby Corning720083
T25Okulary korekcyjne Corning430641
12 mmMarienfeld-Superior111520
AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit& nbsp;LonzaVPG1003Do elektroporacji pierwotnych neuronów korowych
System transfekcji neonowej InvitrogenMPK5000Do elektroporacji ludzkich fibroblastów
Mini analiza SynaptosoftMini Analysis v.6Do pomiaru PSC
Normalne ludzkie fibroblasty skórnePromoCellC12300
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPREAddgene20945
Lampa rtęciowa o krótkim łukuOSRAMHBO 103 W/2
21103049352096

Bibliografia

  1. Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  4. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  5. Stroh, A., et al. Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation. Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).
  6. Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).
  7. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).
  8. Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).
  9. Shivaraj, M. C., et al. Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain. PLoS ONE. 7, e42935(2012).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).
  12. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).
  13. Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
  14. Marchetto, M. C. N., et al. A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  15. Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, 160(2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neurony pochodz ce z iPSCchannelrodopsyna 2stymulacja optogenetycznapr dy synaptyczner nicowanie ludzkich NPCmonowarstwa astrocytarnarejestracje elektrofizjologicznemikroskopia konfokalna
Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.