Artykuł metodologiczny

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

DOI:

10.3791/52410

⸱

12 kwietnia 2015

 ,  , 
1ReNeuron

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronalne komórki macierzyste (NSC) są zdolne do samoodnawiania się i różnicowania w neurony, astrocyty i oligodendrocyty w określonych lokalnych mikrośrodowiskach. W niniejszym artykule przedstawiamy zestaw metod stosowanych do trójwymiarowego (3D) różnicowania i analizy miRNA linii klonalnych ludzkich nerwowych komórek macierzystych (hNSC), obecnie w badaniach klinicznych dotyczących niepełnosprawności po udarze mózgu (NCT01151124 i NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSC pochodziły z zatwierdzonej etycznie ludzkiej kory płodowej w pierwszym trymestrze ciąży i zostały warunkowo unieśmiertelnione przy użyciu retrowirusowej integracji pojedynczej kopii konstruktu c-mycERTAM. Opisujemy, jak mierzyć rozrost procesu aksonowego hNSC zróżnicowanych na rusztowaniach 3D i jak określić ilościowo związane z tym zmiany w ekspresji miRNA za pomocą macierzy PCR. Ponadto przeprowadzamy analizę obliczeniową w celu wyboru przypuszczalnych celów miRNA. SOX5 i NR4A3 zidentyfikowano jako odpowiedni przypuszczalny cel miRNA wybranych, znacznie obniżonych miRNA w zróżnicowanym hNSC. Walidację celu MiRNA przeprowadzono na 3'UTR SOX5 i NR4A3 za pomocą podwójnej transfekcji plazmidu reporterowego i testu podwójnej lucyferazy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad komórkami macierzystymi odgrywają kluczową rolę w medycynie regeneracyjnej, która obejmuje również takie dyscypliny jak inżynieria tkankowa, biologia komórkowa, terapia komórkowa, terapia genowa i biomateriały (rusztowania i matryce). Komórki macierzyste są ważne zarówno w rozwoju narządów, jak i naprawie tkanek; Zrozumienie, jak działają komórki macierzyste, ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych terapii opartych na komórkach macierzystych1. CTX0E03 to klonalna, warunkowo unieśmiertelniona linia2 ludzkich nerwowych komórek macierzystych (hNSC) wyizolowana z kory płodu ludzkiego w pierwszym trymestrze ciąży. CTX0E03 ma zdefiniowane cechy jakościowe, które są niezbędne do klinicznego bankowania komórek zgodnie z dobrą praktyką wytwarzania (GMP)3. HNSC mogą spontanicznie różnicować się w neurony, komórki glejowe i oligodendrocyty i udowodniono, że łagodzą deficyty neurologiczne po przeszczepieniu do modelu ogniskowego niedokrwienia u gryzoni2,4,5. CTX0E03 hNSC są obecnie w fazie badań klinicznych dotyczących niepełnosprawności po udarze mózgu (6 NCT01151124 i NCT02117635 Clinicaltrials.gov).

MiRNA mają średnio 22 nukleotydy długości i są sprawdzonymi cząsteczkami regulatorowymi7, nie kodują białek, ale raczej wiążą 3 główne nietranslowane regiony (3'UTR) mRNA, regulując ich stabilność i translację do białek. Doniesiono, że MiRNA uczestniczą w regulacji wielu procesów komórkowych, w tym rozwoju, proliferacji i różnicowania8. Kilka miRNA jest zaangażowanych w regulację losu i specyfikację nerwowych komórek macierzystych9.

W dwuwymiarowym (2D) standardowym środowisku hodowlanym złożoność środowiska in vivo nie jest dopasowana, a co za tym idzie, indukcja i regulacja różnicowania hNSC nie jest optymalna. In vivo komórki są otoczone trójwymiarowym (3D) mikrośrodowiskiem złożonym z innych komórek i ligandów zewnątrzkomórkowych, w tym wielu rodzajów kolagenów, lamininy i innych białek macierzy (macierzy zewnątrzkomórkowej, ECM). Wcześniejsze badania wykazały, że topografia architektoniczna materiałów naśladujących ECM i ich geometria wpływają na fenotyp i los komórki10-15. Dostępnych jest wiele dostępnych na rynku rusztowań 3D; Użyliśmy wysoce porowatego rusztowania polistyrenowego zaprojektowanego z dobrze zdefiniowaną i jednolitą architekturą w membranie o grubości 200 μm, która zapewnia przestrzeń 3D, w której komórki mogą atakować i różnicowaćsię 16-18.

Tutaj testy różnicowania 2D i 3D są używane do oceny przerostu procesu aksonowego. Ponadto opisujemy metodę profilowania ekspresji miRNA linii hNSC klasy klinicznej w celu dalszego zbadania wpływu miRNA na jej różnicowanie. Przedstawione tu metody są oparte na metodach pierwotnie opisanych wpunkcie 19.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zróżnicowanie HNSC w kulturze trójwymiarowej (3D)

UWAGA: Wyizoluj i wyprowadź hNSC z zatwierdzonej etycznie tkanki, opisanej w poprzedniej publikacji2. Postępując zgodnie z tą procedurą, należy postępować zgodnie z wytycznymi etycznymi i instytucjonalnymi.

1.1) Kultura 3D przy użyciu płytki 12-dołkowej

  1. Stosuj technikę aseptyczną podczas całej procedury. W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy ponownie nawodnić rusztowania, dodając 2 ml / studzienkę 70% etanolu przygotowanego przy użyciu wody do nawadniania (WFIr). Unikaj dotykania rusztowań, dozując 70% etanolu po ścianie każdej studni.
  2. Ostrożnie odessać 70% etanol i natychmiast umyć rusztowania 2 ml/studzienkę DMEM: F12 przez 1 min. Powtórzyć procedurę mycia dwukrotnie. Ostrożnie odessać DMEM: F12 po ostatnim praniu.
  3. Pokryj rusztowania, dodając 2 ml / studzienkę lamininy (10 μg / ml) w DMEM: F12. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny. Umyj płytę ciepłym DMEM: F12.
  4. Wysiewaj każde rusztowanie około 500 000 hNSC w objętości 150 μl RMM+GFs.
  5. Inkubować płytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 , aby umożliwić komórkom osadzenie się na rusztowaniach.
  6. Dodać 3,5 ml RMM do każdego dołka, uważając, aby nie usunąć komórek z rusztowań.
  7. Inkubować płytkę przez 7 dni; wymienić pożywkę RMM (3,5 ml/dołek) po 1 dniu (pierwsze karmienie) i ponownie po 2-3 dniach od pierwszego karmienia.
  8. Po 7 dniach usunąć pożywkę i utrwalić komórki 4% paraformaldehydem (PFA) do immunocytochemii (ICC) lub dodać 500 μl/studzienkę odczynnika do lizy w celu ekstrakcji całkowitego RNA (przechowywać płytkę w temperaturze ≤ -80 °C lub przystąpić do ekstrakcji całkowitego RNA).

1.2) Pomiar wzrostu procesu Axon

  1. Barwienie 4% PFA utrwaliło zróżnicowane hNSC zgodnie ze standardowym protokołem ICC20 przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała β3-tubuliny (TUBB3) wykrytego za pomocą przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluorochromem. Przeciwbarwić jądra komórkowe za pomocą Hoechst (1 μM).
  2. Uchwyć reprezentatywne obrazy komórek barwionych β3-tubuliną za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego; zapisz obrazy w formacie tiff lub jpeg. Pomiar wzrostu procesu aksonowego za pomocą programowego narzędzia pomiarowego (np. Image-Pro Plus).
  3. Otwórz obraz, wybierz opcję pomiarów na pasku narzędzi i wybierz funkcję śledzenia.
  4. Aby rozpocząć śledzenie, wybierz punkt początkowy na wyrostku aksonu, klikając przycisk myszy. Śledź na całej długości wyrostka aksonu; Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć każdy ślad. Powtórz tę czynność, aby zmierzyć wszystkie wyrostki aksonów w polu view.
  5. Wyrażaj pomiary w pikselach lub μm (w oczekiwaniu na konfigurację kalibracji). Eksport pomiarów długości do arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia próbnej analizy porównawczej i statystycznej.

2. Ekspresja miRNA za pomocą komórek macierzystych i szlaków rozwojowych Skoncentrowana matryca miRNA PCR

2.1) ekstrakcja całkowitego RNA miRNA

  1. Wykonaj ekstrakcję miRNA na rusztowaniach i próbkach wyhodowanych 2D (zróżnicowane i niezróżnicowane, kontrola hNSC).
  2. W razie potrzeby rozmrozić rusztowania, umieszczone w płytce 12-dołkowej. Połączyć zawartość odczynnika do lizy (500 μl) z 2 studzienek w tej samej probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml, końcowa objętość 1 ml odczynnika do lizy. Uważaj, aby zostawić rusztowanie w studni.
  3. W przypadku próbek uprzednio pobranych w postaci granulek suchych komórek 2D (zróżnicowane kultury hNSC 2D i niezróżnicowana kontrola) należy dodać 1 ml odczynnika do lizy i przenieść zawartość do 1,5 ml probówki do mikrowirówki.
  4. Homogenizować każdą badaną próbkę za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i krótkiej igły o rozmiarze 20-25. Przepuścić lizat przez igłę za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml do 5 razy, aż do uzyskania jednorodnego lizatu.
  5. Dodać 200 μl chloroformu do każdej probówki Eppendorf i szczelnie zakręcić. Odwróć i zwiruj probówki, aby wymieszać zawartość.
  6. Odwirować każdą probówkę mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającą homogenat przez 15 minut w temperaturze ≥12 000 x g.
  7. Przenieść górną fazę wodną każdej próbki (unikać przenoszenia jakiejkolwiek międzyfazowej, różowej cieczy) do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 750 μl 100% etanolu. Dokładnie wymieszaj przez odwrócenie.
  8. Odpipetować do 700 μl każdej badanej próbki, łącznie z dowolnym osadem, do minikolumny w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Zamknij pokrywę i odwiruj przy ≥8 000 x g przez około 30 sekund w temperaturze pokojowej. Odrzuć przepływ. Powtórz ten krok, używając pozostałej części próbki.
  9. Przeprowadzaj trawienie DNA przez 15 minut.
  10. Dodać 700 μl buforu RWT do mini kolumny i odwirowywać przez około 30 sekund przy ≥8 000 x g. Wyrzucić przepływ.
  11. Przemyć mini kolumnę, dodając 500 μl buforu RPE i odwirowując przez około 30 sekund przy ≥8 000 x g. Wyrzucić przepływ. Powtórz pranie. Wirować przy ≥12 000 x g przez 1 minutę, aby dalej wysuszyć membranę.
  12. Eluować całkowite RNA w 1,5 ml probówce Eppendorfa, dodając 40 μl wody wolnej od RNaz do mini kolumny i wirując przez 1 minutę przy ≥8 000 x g. Zmierzyć całkowite stężenie RNA za pomocą odpowiedniego spektrofotometru.

2.2) miRNA cDNA Przygotowanie

  1. Przygotuj główny miks z odwrotną transkrypcją. Każda próbka wymaga 4 μl 5x bufora miScript HiSpec, 2 μl 10x mieszanki nukleinowej, 2 μl mieszanki odwrotnej transkryptazy miScript.
  2. Podać podamy 8 μl mieszanki wzorcowej w probówce do PCR, dodać wymaganą objętość całkowitego RNA (250 ng) i dodać wodę wolną od RNaz do końcowej objętości 20 μl.
  3. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C, aby dezaktywować mieszaninę odwrotnej transkryptazy miScript.
  4. Dodaj 200 μl wody wolnej od RNaz do każdej 20 μl reakcji odwrotnej transkrypcji, przechowuj w temperaturze –20 °C lub natychmiast przystąp do PCR w czasie rzeczywistym.

2.3) Komórki macierzyste i szlaki rozwojowe Skoncentrowana matryca miRNA PCR

  1. Przygotuj mieszankę składników PCR w probówce o pojemności 15 ml, dodając 1375 μl 2x zielonej mieszanki wzorcowej SYBR, 100 μl preparatu cDNA miRNA, 275 μl 10x miScript Universal Primer i 1000 μl wody wolnej od RNaz (całkowita objętość 2,750 μl).
  2. Przenieś składniki PCR na zbiornik ładujący PCR. Ostrożnie wyjąć 96-dołkowy zestaw PCR z zamkniętej torby.
  3. Dodaj 25 μl składników PCR do każdego dołka macierzy PCR za pomocą pipetora 8-kanałowego lub pipetora 12-kanałowego przy użyciu tylko 8 końcówek. Końcówki pipet należy wymieniać po każdym etapie pipetowania, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między studzienkami.
  4. Uszczelnij płytkę optyczną folią samoprzylepną i odwiruj przez 1 minutę przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej (15–25 °C) w celu usunięcia pęcherzyków. Sprawdź wzrokowo płytkę od spodu, aby upewnić się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków.
  5. Umieść 96-dołkową matrycę PCR na płytce w cyklerze czasu rzeczywistego.
  6. Zaprogramuj odpowiednio cykler w czasie rzeczywistym: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 10 minut i 45 cykli przez 15 sekund w temperaturze 95 °C oraz 1 minuta w temperaturze 60 °C ustaw pojedynczy (zbieranie danych fluorescencyjnych).
  7. Eksportuj wartości Ct dla wszystkich studzienek do pustego arkusza kalkulacyjnego Excel do użytku z szablonem analizy danych PCR Array Excel i oprogramowaniem internetowym.
    UWAGA: Oprogramowanie jest dostępne pod adresem www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php.

3. Analiza obliczeniowa do przewidywania docelowego celu miRNA i walidacji docelowych mRNA za pomocą transfekcji plazmidu reporterowego i testu podwójnej lucyferazy.

3.1) Analiza obliczeniowa do przewidywania celu miRNA

  1. Przeglądaj PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/)21, dostępny online algorytm do identyfikacji mRNA do przewidywania docelowych mRNA.
  2. Kliknij "kliknij tutaj, aby przewidzieć PicTar dla kręgowców". Otworzy się nowa strona.
  3. Na nowej stronie, w interfejsie internetowym PicTar, wybierz gatunek z menu rozwijanego i wstaw interesujące go miRNA w polu identyfikatora miRNA. Kliknij przycisk Wyszukaj cele miRNA.
  4. Obserwuj listę docelowych mRNA uszeregowanych według wyniku aPicTar.
    UWAGA: PicTar oblicza wynik odzwierciedlający prawdopodobieństwo, że dany UTR będzie celem wybranego miRNA, i oparty na komplementarności nasion, termodynamice i kombinatorycznym przewidywaniu dla wspólnych celów w zestawach współeksprymowanych miRNA22.
  5. Podobnie pobierz listę docelowych mRNA za pomocą alternatywnych algorytmów dostępnych on-line (http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/)23 i TargetScan (http://www.targetscan.org/)24.
  6. Sporządź tabelę porównawczą miRNA na podstawie rankingu uzyskanego przy użyciu różnych narzędzi programowych. PicTar klasyfikuje się według wyniku, DianaLab według precyzji (na podstawie stosunku sygnału do szumu i wyniku precyzji dla oceny istotności przewidywanych wyników), a TargetScan według zagregowanego PCT (w oparciu o komplementarność nasion, termodynamiczną energię swobodną wiązania, zachowanie nad różnymi gatunkami), patrz tabela 1.

3.2) Walidacja docelowych mRNA za pomocą transfekcji plazmidu reporterowego i testu podwójnej lucyferazy.

UWAGA: 3' reportery lucyferazy UTR do walidacji docelowego mRNA zostały wcześniej opisane25.

  1. Transfekcja
    1. Umieść komórki HeLa w gęstości 105 komórek / dołek w 24-dołkowej płytce.
    2. Po 24 godzinach współtransfekować komórki HeLa z 1,5 μl odczynnika do transfekcji i 100 ng plazmidu NR4A3 3' UTR lub SOX5 3' UTR, a także mimikami 20 nM miRNA (has-miR-96-5p dla SOX5 3' UTR i has-miR-7-5p i has-miR-17-5p odpowiednio dla NR4A3 3' UTR) na studzienkę.
    3. Studzienki kontrolne kotransfekcji z NR4A3 3' UTRor SOX5 3' UTRplasmidem i fluorochromowymi siRNA kontrolnymi znakowanymi fluorochromem. Transfekcja studzienek kontrolnych za pomocą znakowanych fluorochromem siRNA kontroli ujemnej umożliwia ocenę skuteczności transfekcji i uwzględnia swoistość wiązania mimimicznego 3'UTR.
  2. Pomiar podwójnej aktywności lucyferazy
    1. Zmierz aktywność lucyferazy świetlika i Renilla 24 godziny po transfekcji. Usuń pożywkę do wzrostu komórek.
    2. Przygotować roztwór roboczy I, dodając 50 μl substratu I do 10 ml roztworu I; dokładnie wymieszać. Dodać 300 μl roztworu roboczego I do każdego 24 dołka.
    3. Przenieść zawartość każdej z 24 studzienek do 3 dołków z 96 białymi płytkami, po 100 μl każdy. Odczekaj 10 minut i zmierz lucyferazy świetlika w luminometrze ustawionym do akwizycji luminescencji.
    4. Przygotować roztwór roboczy II, dodając 50 μl substratu II do 10 ml roztworu II; dokładnie wymieszać. Dodać 100 μl roztworu roboczego I do każdej 96 studzienek zawierających już 100 μl roztworu roboczego I.
    5. Odczekaj 10 minut i zmierz lucyferazy Renilla w luminometrze ustawionym do akwizycji luminescencji. Oblicz stosunek luminescencji lucyferazy świetlików do lucyferazy Renilla.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na rysunku 1 jest pokazane badanie i kwantyfikacja różnicowania hNSC na rusztowaniach 3D w porównaniu z tradycyjnymi kulturami o płaskiej powierzchni (2D) i wyrażone jako pomiary wzrostu procesu aksonowego. Na rycinie 2 przedstawiono przebieg pracy i wyniki kwantyfikacji miRNA przy użyciu komórek macierzystych i szlaków rozwojowych skoncentrowanej na macierzy miRNA PCR w celu zbadania zróżnicowanej ekspresji miRNA w zróżnicowanych hNSC 2D i 3D w porównaniu z niezróżnicowaną kontrolą. Po analizie porównawczej miRNA między zróżnicowanymi i niezróżnicowanymi hNSC oraz analizie obliczeniowej w celu przewidywania celu, SOX5 i NR4A3 (NOR1) zostały zidentyfikowane jako przypuszczalne docelowe mRNA. Aby zbadać bezpośrednią interakcję między miRNA a ich przypuszczalnym miejscem na mRNA 3'UTR, użyliśmy 2 dostępnych na rynku plazmidów zawierających sekwencję 3′UTR SOX5 lub NR4A3 wstawioną za genem reporterowym lucyferazy świetlika świetlika i zawierającą w tym samym plazmidzie gen lucyferazy renilla w celu normalizacji. Reprezentatywne wyniki regulacji w dół aktywności lucyferazy 3' UTR przedstawiono na rysunku 3.

figure-results-1
Rysunek 1: Różnicowanie hNSC na rusztowaniach 3D i pomiar przerostu procesów aksonowych. (A) Po standardowym barwieniu ICC dla β3-tubuliny (zielonej) i jąder wybarwionych przeciwstawnie Hoechst (niebieskim) uzyskano reprezentatywne mikrofotografie i przeprowadzono pomiary procesów aksonowych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. (B) Diagramy przedstawiające pomiar rozrostu procesu aksonowego wykonany w zróżnicowanych hNSC 2D i 3D przez 1 (1 W) lub 3 tygodnie (3 W). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schematyczny przebieg profilowania miRNA w zróżnicowanych hNSC. Całkowite RNA, w tym miRNA, wyekstrahowano albo ze zróżnicowanych hNSC na rusztowaniach 3D i standardowych kulturach 2D, albo z niezróżnicowanej kontroli. 250 ng całkowitego RNA poddano retrotranskrypcji za pomocą metody, która ułatwia selektywną konwersję dojrzałych miRNA w cDNA nadające się do kwantyfikacji miRNA z różnicowaniem i rozwojem komórek ludzkich w układzie miRNA PCR. Do analizy danych w oparciu o metodę 2-ΔΔct wykorzystano średnią geograficzną SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A i RNU6-2. Istotne zmiany zdefiniowano jako regulację +/- 1,5 krotności w górę i w dół w statystycznie istotnym stopniu. Dane analizowano za pomocą oprogramowania internetowego dostępnego pod adresem Wyniki są wyrażone w postaci klastrgrama. Zmodyfikowano z rysunku 319. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Walidacja docelowego mRNA przewidywanego mRNA przy użyciu testu raportu podwójnej lucyferazy. (A) Reprezentatywny diagram plazmidu reporterowego podwójnej lucyferazy używanego jako narzędzie do walidacji sekwencji 3'UTR jako bezpośredniego celu miRNA. (B) Reprezentatywna mikrofotografia przedstawiająca skuteczność transfekcji. oraz Sygnały, wyrażone jako względna aktywność lucyferazy, od ludzkich reporterów 3'UTR genów SOX5 i NR4A3 zostały znacznie osłabione w obecności odpowiednio mimików has-miR-96 i has-miR-7 i 17. Zmodyfikowano na podstawie rysunku 519. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: pkt. pkt. powiedział: powiedział: pkt. pkt. pkt. powiedział: powiedział: pkt. pkt. powiedział: pkt. powiedział: powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. powiedział: pkt.
DIANALABPicTarSkanowanie docelowe
MirnaGen docelowyZnalezione miejsca docelowe/genyprecyzjawynikAgregat PCT
has-miR-96Klasa SOX5nr kat. 1214/76316,740,94
has-miR-183DUSP10nr 302/1900,72Godzina 4,750,85
has-miR-302aZobacz materiał NR4A3nr 863/4730,84Klasa 3,05Nf
has-miR-182FOXN3nr kat. 1358/7940,94Nf0,96
has-miR-7Zobacz materiał NR4A3NfNfWynik 1,610,17
has-miR-7FOXN3nr 399/1360,17Nf0,88
has-miR-20aZobacz materiał NR4A3nr kat. 1650/8410,85Klasa 5,870,63
has-miR-20bZobacz materiał NR4A3Sezon 1955/9730,9Klasa 5,870,63
has-miR-17Zobacz materiał NR4A3Sezon 1928/9610,9Klasa 5,380.63+0.37
has-miR-20aZobacz materiał EIF4G3nr kat. 1650/8410,97NfNf
has-miR-20bZobacz materiał EIF4G3Sezon 1955/9730,94NfNf
has-miR-17Zobacz materiał EIF4G3Sezon 1928/9610,94NfNf

Tabela 1: Lista mRNA przewidujących cel miRNA. Reprezentatywna tabela miRNA, docelowych genów predykcyjnych i analiza algorytmów (przewidywanie/wynik/agregacja dostarczane odpowiednio za pomocą Diana Lab, PicTar i TargetScan). Zmodyfikowano na podstawie tabeli 319.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie nowych testów in vitro do oceny i poprawy różnicowania komórek macierzystych zawsze stanowiło wyzwanie dla badania ich funkcjonalności i możliwości terapeutycznych. Zajęto się kwestią długoterminowego i stabilnego przyłączania hNSC, niezbędnego do opracowania solidnego testu różnicowania 3D in vitro , testując kilka substratów 3D o różnych właściwościach pod względem materiałów i struktur. W ramach opracowywania testu oceniliśmy również optymalne stężenie wysiewu komórek i określiliśmy wymóg, aby rusztowania były pokryte lamininą. Chociaż nasze hNSC mogą spontanicznie różnicować się po usunięciu 4-OHT i czynnika wzrostu, wdrożenie systemu hodowli 3D wykazało znaczną poprawę ich zdolności różnicowania mierzonej wzrostem procesu aksonów w porównaniu ze standardowymi hNSC różnicowanymi 2D.

Aby zbadać wpływ różnicowania indukowanego przez 3D na ekspresję miRNA hNSC, użyliśmy macierzy PCR. W porównaniu ze standardowym chipem, macierz PCR z mikromacierzą oferuje korzyści płynące z bezpośredniej kwantyfikacji i walidacji miRNA, które są przedmiotem zainteresowania. Chociaż matryca PCR jest ograniczona pod względem całkowitej liczby miRNA na macierz, na przykład w tym przypadku mniej niż 96, można ją dostosować tak, aby zawierała interesujące miRNA, w naszym przypadku wcześniej zgłoszone w rozwoju komórek macierzystych. Ekspresja miRNA skoncentrowanych na szlaku była profilowana w hNSC zróżnicowanych 3D i 2D w porównaniu z niezróżnicowanymi hNSC. Najbardziej znacząco obniżone miRNA zostały wybrane i przeanalizowane w celu oceny ich przypuszczalnych docelowych mRNA z zamiarem określenia ich funkcjonalności i interpretacji biologicznej przy użyciu algorytmów dostępnych online (DIANA Lab, PicTar i TargetScans).

Pojedyncze miRNA może rozpoznawać setki celów i z tego powodu zwalidowaliśmy interakcje miRNA z mRNA 3' UTR, które mogą być odpowiednimi kandydatami w regulacji aksonalnej. NR4A3, cel z rodziny has-miR-7 i miR-17, jest członkiem receptorów jądrowych rodziny NR4A, które, w zależności od poziomu ekspresji, biorą udział w różnicowaniu, przeżyciu, apoptozie i regulacji przewodnictwa aksonów hipokampa26. Podobnie SOX5, cel has-miR-96, kontroluje progresję cyklu komórkowego w neuronalnych progenitorachodługości aksonu27 28, migrację, różnicowanie pomigracyjne i projekcje neuronów29. Zarówno SOX5, jak i NR4A3 zostały zidentyfikowane jako bezpośrednie docelowe mRNA has-miR-96 i has-miR-7 i 17 odpowiednio za pomocą podwójnych testów reporterowych lucyferazy. Podwójna lucyferazy (Firefly i Renilla) opiera się na dwóch różnych genach reporterowych w tym samym plazmidzie i oferuje ulepszony system umożliwiający normalizację efektów spowodowanych nieoptymalną transfekcją i efektami cytotoksycznymi w porównaniu z pojedynczym systemem plazmidowym lucyferazy. W ramach rozwoju naszych testów zoptymalizowaliśmy również warunki transfekcji, aby uzyskać wysoką wydajność.

Protokoły opisane w niniejszym dokumencie mogą być wykorzystane do dalszej optymalizacji i scharakteryzowania różnicowania hNSC in vitro , co może być wdrożone w protokołach transplantacyjnych do badań przedklinicznych i przyszłych zastosowań klinicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy są pracownikami, posiadaczami akcji i/lub opcji na akcje w ReNeuron Ltd lub jej spółce macierzystej. Badanie to było wspierane przez ReNeuron (RENE. L).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Julie Heward za pomoc w przygotowaniu hNSC, oraz Lavaniya Thanabalasundaram za jej wsparcie techniczne przy hodowli i transfekcji HeLa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM:F12Invitrogen21331-020Do przygotowania podłoża RMM
Roztwór albuminy ludzkiej Baxter Health Care Limited 1501052Do pożywki RMM stosowanej w stężeniu końcowym   0,03%
Transferyna, Rekombinowana Sigma ludzkaSigmaT8158Do pożywki RMM stosowana w stężeniu końcowym   5 &mikro; g/ml
Putrescyna DiHCl SigmaP5780Do pożywki RMM stosowana w stężeniu końcowym   16,2 &mikro; g/ml
Insulina ludzka rekombinowana   SigmaI9278Do podłoża RMM stosowanego w końcowym stężeniu   5 &mikro; g/ml
Progesteron SigmaP6149Do pożywki RMM stosowanej w końcowym stężeniu  60 ng/ml
L-glutamina Invitrogen25030-24Do pożywki RMM stosowany w końcowym stężeniu   2
mM Selenin sodu   SigmaS9133Do pożywki RMM stosowanej w końcowym stężeniu 40 ng/ml
bFGF         PeprotechAF-100-15Do dodania do pożywki RMM, stosowany w końcowym stężeniu 10 ng/ml
EGF             PeprotechAF-100-188Do dodania do pożywki RMM, stosowany w końcowym stężeniu 20 ng/ml
4-OHTSigmaH7904Do dodania do pożywki RMM, stosowany w końcowym stężeniu 100 nM
LamininAMS Biotech3400-010-10
TrypZean/EDTALonza BE02-034E
Woda do nawadnianiaBaxter HealthcareUKF7114
Zdefiniowany inhibitor trypsyny (DTI) (sklep -20° C)Płytka 12-dołkowa InvitrogenR007-100
Alvetex Reinnervate LtdAVP002
Etanol Firma Merck 1.00986.1000
β III tubulinaprzeciwciało SigmaT8660
HoechstSigmaB2261
miRNeasy mini zestawQiagen 
DNazy wolne od RNaz Qiagen 79254
Zestaw ChloroformSigmaC7559-5VL
miScript II RT Qiagen 218160
Zestaw SYBR do zielonego PCRQiagen 
Rozwój komórek & Różnicowanie miScript miRNA PCR ArrayQiagen/ SABiosciencesMIHS-103Z
Lightcycler 480 biała 96 płytkaRoche 
Lightcycler 480  folia uszczelniającaRoche 
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027
Wektor NR4A3 miRNA 3' docelowe klony UTR GeneCopeiaHmiT019538-MT0
Wektor SOX5 miRNA 3' docelowe klony UTR GeneCopeiaHmiT017632-MT01
Allstars kontrola negatywna siRNA AF 488 (Qiagen).Qiagen 1027284Kontrola transfekcji MiRNA
Luc-Pair miR Lucyferazy TestGeneCopeiaLPFR-M010
Lightcycler 480 
Luminometr mikropłytkowy Roche GloMax 96 Preparat Promega
21700421807347296920014729757001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falanga, V. Stem cells in tissue repair and regeneration. J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).
  2. Pollock, K., et al. A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).
  3. Hodges, H., et al. Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).
  4. Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).
  5. Stroemer, P., et al. The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion. Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).
  6. Kalladka, D., Muir, K. W. Brain repair: cell therapy in stroke. Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
  9. Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).
  10. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).
  11. Buxboim, A., Discher, D. E. Stem cells feel the difference. Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).
  12. Li, W. J., et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).
  13. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  14. Ortinau, S., et al. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed Eng Online. 9 (1), 70(2010).
  15. Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. Designing synthetic materials to control stem cell phenotype. Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).
  16. Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture. Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).
  17. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity. J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).
  18. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
  19. Stevanato, L., Sinden, J. D. The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49(2014).
  20. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  21. Chen, K., Rajewsky, N. Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).
  22. Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
  23. Maragkakis, M., et al. Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels. BMC Bioinformatics. 10, 295(2009).
  24. Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 120 (1), 15-20 (2005).
  25. Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells. J Vis Exp. (55), (2011).
  26. Ponnio, T., Conneely, O. M. nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility. Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).
  27. Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway. EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).
  28. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).
  29. Lai, T., et al. SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes. Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ludzkie neuralne kom rki macierzystehodowla tr jwymiarowaekspresja mikroRNAwzrost wypustek aksonalnychdualny test lucyferazyanaliza macierz PCRkomputerowe przewidywanie celuwalidacja SOX5 NR4A3barwienie beta III tubulinytransfekcja plazmidu reporterowego

Powiązane artykuły