Method Article

Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

DOI:

10.3791/52416

⸱

February 11th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, UCLA David Geffen School of Medicine, 2Department of Molecular and Medical Pharmacology, UCLA David Geffen School of Medicine, 3Department of Medicine, UCLA David Geffen School of Medicine, 4Brain Research Institute, UCLA David Geffen School of Medicine, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, UCLA David Geffen School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół monitorowania ruchliwości radialnej nieprzylegających komórek odpornościowych in vitro za pomocą kolektora sedymentacyjnego/suwaka komórkowego. Migracja komórek jest śledzona na monowarstwach komórek nowotworowych lub na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Badanie za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej pozwala na obserwację ruchliwości komórek i funkcjonalności cytotoksycznej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Informujemy o nowatorskiej adaptacji testu migracji komórek Radial Monolayer Cell Migration, po raz pierwszy zgłoszonego do pomiaru migracji radialnej przylegających komórek nowotworowych na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej, do pomiaru ruchliwości znakowanych fluorescencyjnie, nieprzylegających ludzkich lub mysich efektorowych komórek odpornościowych. Technika ta wykorzystuje kolektor ze stali nierdzewnej i 10-dołkowy szkiełko teflonowe do ogniskowego osadzania nieprzylegających limfocytów T w studzienkach przygotowanych z konfluentnych monowarstw komórek nowotworowych lub białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Lekka i/lub wielokanałowa mikroskopia fluorescencyjna służy do śledzenia ruchu i zachowania komórek efektorowych w czasie. Barwniki fluorescencyjne i/lub wektory wirusowe, które kodują transgeny fluorescencyjne, są używane do różnicowego znakowania typów komórek do obrazowania. Metoda ta różni się od podobnych testów in vitro, które śledzą poziomą lub pionową migrację/inwazję przy użyciu komór szkiełkowych, płytek agarowych lub transwellowych. Test umożliwia zebranie szczegółowych danych obrazowych z różnymi typami komórek różniącymi się określonymi markerami fluorescencyjnymi; Można monitorować nawet określone subpopulacje komórek (tj. transdukowane/nietransdukowane). Wykresy fluorescencji o intensywności powierzchniowej są generowane przy użyciu określonych kanałów fluorescencyjnych, które odpowiadają migrującemu typowi komórki. Pozwala to na lepszą wizualizację nieprzylegającej ruchliwości komórek odpornościowych w określonych momentach. Możliwe jest również zebranie dowodów na inne funkcje komórek efektorowych, takie jak cytotoksyczność lub przenoszenie wektorów wirusowych z komórek efektorowych do docelowych. W ten sposób metoda ta pozwala naukowcom na mikroskopowe dokumentowanie interakcji międzykomórkowych różnie znakowanych, nieprzylegających z przylegającymi komórkami różnych typów. Takie informacje mogą być szczególnie istotne w ocenie biologicznie manipulowanych lub aktywowanych typów komórek odpornościowych, gdzie pożądany jest wizualny dowód funkcjonalności komórek docelowych guza przed ich zastosowaniem w terapii przeciwnowotworowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test migracji komórek promieniowych jednowarstwowych został pierwotnie opracowany do pomiaru właściwości naciekowych przylegających komórek nowotworowych1-4 na szkiełkach pokrytych białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)5-7 lub pojedynczymi składnikami ECM, takimi jak fibronektyna lub laminina1,2. Technika polegała na wysiewie pojedynczej zawiesiny komórek nowotworowych w środku studzienek za pomocą kolektora sedymentacyjnego ze stali nierdzewnej (CSM). Po sedymentacji komórki nowotworowe przylegały do dna studni, a zmiana średnicy początkowej populacji komórek w czasie została wykorzystana do ustalenia szybkości ruchliwości poziomej. Test radialnej migracji komórek jednowarstwowych zapewnił wizualną przewagę nad innymi istniejącymi metodami, które wykorzystywały płytki transwell do badania zdolności migracyjnych komórek in vitro; Testy te nie sprzyjają obrazowaniu8. Zapewniło to również dużą swobodę w wyborze punktów czasowych, w których oceniana jest migracja, bez ograniczeń co do liczby punktów czasowych, które badacz mógł wybrać do zobrazowania po sedymentacji.

Ponieważ zdolność do migracji jest ważną funkcjonalnością dla komórek nieprzylegających, szczególnie w obszarze immunoterapii lub tam, gdzie mogą być używane jako nośniki dla wektorów wirusowych, dostosowaliśmy użycie CSM do oceny migracji nieprzylegających typów komórek na monowarstwach komórek nowotworowych, oprócz białek ECM. Dodatkowa korzyść z mikroskopowej wizualizacji migracji nieprzylegających komórek na żywotnych monowarstwach komórek nowotworowych, na złożonym ECM wyizolowanym z guza lub na poszczególnych składnikach ECM sprawia, że test ten jest wszechstronny. Testy, w których wykorzystuje się studzienki pokryte pojedynczym białkiem zewnątrzkomórkowym, nie odzwierciedlają dokładnie substratu tkankowego ECM lub guza, przez który migrowałyby komórki in vivo.

Tutaj użyliśmy alloreaktywnych cytotoksycznych limfocytów T (alloCTL), uwrażliwionych na białka głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) za pomocą jednokierunkowych mieszanych reakcji limfocytów nowotworowych (MLTR) lub mieszanych reakcji limfocytów (MLR)9, jako naszego reprezentatywnego typu komórek nieadherentnych. Przetestowaliśmy komórki zarówno pochodzenia ludzkiego, jak i mysiego. Kiedy migracja była mierzona na monowarstwach guza, zastosowane komórki nowotworowe były albo częściowo istotnymi celami, wykazującymi niektóre z tych samych białek MHC, które znajdują się w populacji komórek używanych do uwrażliwiania efektorów, albo w pełni istotnymi celami, z pełnym zestawem cząsteczek MHC, na które efektory zostały uczulone. W niektórych eksperymentach używaliśmy fluorescencyjnego CellTracker Red CMPTX lub barwnika proliferacji komórek eFluor 670 do różnicowania komórek efektorowych i docelowych. Zastosowaliśmy również transdukcję z wektorami wirusowymi kodującymi białka fluorescencyjne jako dodatkowy sposób wizualizacji komórek. W przypadku niektórych testów transdukowaliśmy alloCTL za pomocą retrowirusowych wektorów replikujących (RRV) kodujących białko fluorescencyjne Emerald Green (EMD)10,11; w przypadku innych komórek nowotworowych transdukowano wektorami lentiwirusowymi kodującymi mStrawberry.

AlloCTL zostały zasiane przez kanał rozmaitości do środka monowarstw komórek nowotworowych lub ECM pobranych z monowarstw komórek nowotworowych. Interakcje między komórkami przylegającymi i nieprzylegającymi wizualizowano za pomocą światła i/lub mikroskopii fluorescencyjnej w czasie. Zakłócenie w monowarstwie komórek nowotworowych przy niskiej mocy lub komórki nowotworowe z rozdrobnionymi jądrami o dużej mocy były wskaźnikami uszkodzenia komórki odpowiednio przez lizę i apoptozę. Stworzyliśmy cyfrowo mapy fluorescencyjne o natężeniu powierzchniowym pokazujące migrację nieprzylegających fluoryzujących limfocytów T nad kulturami jednowarstwowymi. Zauważyliśmy również cytotoksyczność wywołaną przez przylegającą monowarstwę komórek glejaka po utworzeniu klastra nałożonego na siebie nieprzylegającego alloCTL. Zaobserwowano również poziomą transdukcję RRV-EMD od alloCTL do monowarstwy glejaka.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie slajdów

  1. Włóż kolektor sedymentacyjny komórek do woreczków sterylizacyjnych i uszczelnij taśmą autoklawową. Skieruj suwak w stronę pokrytą teflonem w stronę papierowej torebki, aby uniknąć osadzania się plastiku na studzienkach.
  2. Torebki w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C.
  3. Wyjmij szkiełko z torebki sterylizacyjnej wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego i umieść na sterylnej sterylnej szalce Petriego o wymiarach 150 x 15 mm. W jednym naczyniu mogą zmieścić się do czterech szkiełek. Umieść szalkę Petriego o wymiarach 35 x 10 mm obok szkiełek. Dodaj 2-3 ml sterylnegoH2O, aby zapewnić nawilżenie.
  4. Wstępnie pokryj szkiełka poli-D-lizyną w stężeniu 100 μg/ml, używając wystarczającej objętości, aby pokryć całą studzienkę. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej należy odessać roztwór i dwukrotnie przepłukać powierzchnię studzienki, pipetując 1 x PBS po powierzchni studzienek.
  5. Opcjonalnie dodaj fibronektynę lub inne składniki ECM, aby zapewnić silniejsze przyleganie komórek nowotworowych. Dodać fibronektynę w dawce 5 μg/ml w takiej objętości, aby studzienki nie wyschły w krótkim czasie w temperaturze pokojowej.
    1. Po 1 godzinie odessać pozostały roztwór i przemyć dwukrotnie, pipetując w górę iw dół za pomocą 1x PBS.
  6. Trzymaj PBS w studzienkach, aż guz będzie gotowy do posiewu. Korzystaj ze slajdów tego samego dnia.
  7. Zbierz zlewającą się kolbę pożądanego przylegającego typu komórek nowotworowych. Policz żywe komórki za pomocą wykluczenia barwnika błękitu trypanowego za pomocą mikroskopii świetlnej i ponownie zawieś przy 5 x 106 komórek/ml w odpowiednio buforowanej pożywce wzrostowej - na przykład minimalnej pożywce niezbędnej (DMEM) Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), L-glutaminą i pirogronianem sodu.
  8. Jeśli pożądane jest obrazowanie fluorescencyjne przylegającej populacji komórek, należy oznaczyć przylegającą populację komórek ważnym barwnikiem fluorescencyjnym lub barwnikiem proliferacji komórek, postępując zgodnie z protokołami dostarczonymi przez producenta.
  9. Płynnie odpipetować 10 μl kompletnego podłoża do każdej studzienki szkiełka, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków w studzienkach, ponieważ mogą one uniemożliwić równomierne przyleganie komórek nowotworowych.
  10. Dodaj 2,5-5,0 x 104 komórki (5-10 μl zawiesiny komórkowej) do pożywki w każdym dołku (ryc. 1A). Dostosuj optymalną liczbę w zależności od typu komórek nowotworowych i pożądanej liczby dni wzrostu. Większe komórki nowotworowe lub szybko rosnące komórki mogą początkowo wymagać mniejszej liczby komórek. Doprowadzić objętość studzienki do 40 μl, dodając pożywkę i pipetując w górę iw dół, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.
  11. Po wysianiu wszystkich studzienek pozwól komórkom nowotworowym przylegać do wilgotności względnej, a następnie umieść pokrywkę na szalce Petriego o wymiarach 150 x 15 mm i ostrożnie przenieś naczynie do inkubatora z wilgotnością 37 °C/5% CO2 na co najmniej 24 godziny.
  12. Codziennie zmieniaj pożywkę hodowlaną. Ostrożnie odpipetować część zużytego podłoża z jednowarstwy i zastąpić je świeżym, kompletnym podłożem.
    UWAGA: Ze względu na parowanie konieczne będzie dodanie większej objętości niż zostało usunięte. Studzienki będą gotowe do testu, gdy obecna będzie równa, zlewająca się warstwa komórek. Zwykle jest to 1-3 dni po pierwszym wysiewie.
  13. Delikatnie umyj monowarstwę raz PBS, jak opisano w kroku 1.4 i albo przejdź do kroku 2, jeśli pożądane są monowarstwy, albo do kroku 1.13 poniżej, aby wyekstrahować białka ECM z monowarstwy.
  14. Przygotować 0,5% roztwór Triton-X (v/v) w kompletnym podłożu i dodać 30 μl do każdego dołka. Pozostaw jednowarstwę do strawienia w kapturze przez 2 minuty, a następnie przemyj dwukrotnie kompletną pożywką, pipetując zgodnie z powyższym opisem.
    UWAGA: Warstwa ECM może być widoczna pod mikroskopem świetlnym (rysunek 2). Szkiełka należy stosować od razu lub przechowywać w kompletnym podłożu w nawilżanym inkubatorze CO2 przez 1-2 dni. Nie pozwól, aby studzienki wyschły.

2. Sedymentacja nieprzylegających limfocytów T na szkiełku

  1. Jeśli pożądane jest obrazowanie fluorescencyjne populacji komórek nieprzylegających, oznacz nieprzylegające populacje komórek za pomocą ważnego barwnika fluorescencyjnego, takiego jak CFSE, Cell Tracker Red CMPTX lub eFluor 670, postępując zgodnie z protokołami dostarczonymi przez producenta co najmniej 1 godzinę przed testem. Alternatywnie, manipuluj komórkami w celu ekspresji białek fluorescencyjnych kodowanych przez wektory wirusowe.
  2. Umieścić w autoklawie kolektor sedymentacyjny komórek w torebce autoklawu, jak opisano w ppkt 1.2 powyżej.
  3. Wyjąć z inkubatora nawilżoną komorę zawierającą szkiełka pokryte teflonem i umieścić w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  4. Przemyć studzienki 1x PBS, pipetując w górę i w dół, a następnie dodać 45 μl kompletnej pożywki zawierającej co najmniej 10% surowicy.
  5. Wyjmij kolektor z koperty sterylizacyjnej i ostrożnie wsuń go nad studzienki, aż "haczyk" na końcu kolektora dotknie dna szkiełka (rysunek 1B).
  6. Upewnij się, że pożywka hodowlana jest widoczna w każdym z kanałów. Jeśli nie jest widoczny, zdejmij kolektor i dodaj więcej pożywki do odpowiedniej studzienki, a następnie wymień i sprawdź ponownie.
  7. Powtórz krok 2.5 dla każdego kanału kolektora lub dla dowolnej liczby studzienek.
  8. Policz nieprzylegające komórki i ponownie zawieś w temperaturze nie mniejszej niż 1,0-2,0 x 105/μl. Pobrać 1 μl komórek i powoli pipetować je do kanału (Rysunek 1C). Zrób to dla każdego pożądanego.
  9. Pozostaw cały aparat obciążony komórkami, tj. kolektor i wsunięcie, wewnątrz okapu biologicznego na 20-30 minut, aby umożliwić komórkom w kanale osadzenie się.
  10. Wyjmij kolektor, dotykając obu końców i delikatnie podnosząc go prosto do góry ze szkiełka, aby nie naruszyć komórek umieszczonych w środku studzienek (rysunek 1D).
  11. Sprawdź każdą studzienkę, aby upewnić się, że nieprzylegające komórki zostały pomyślnie zasiane w środku studni, pozostając w obwodzie kanału kolektora. Nieprzylegające komórki będą idealnie lekko przylegać do monowarstwy lub ECM i do siebie nawzajem, dlatego delikatne przesuwanie szkiełka nie spowoduje rozproszenia osadu komórkowego. Nie szarp zjeżdżalnią.

3. Mikroskopia fluorescencyjna

  1. Za pomocą odpowiedniej aparatury doświadczalnej należy wykonać obrazowanie po potwierdzeniu sedymentacji. Najlepiej użyć mikroskopu, który jest wyposażony w komoręCO2 i wilgotność. Obraz o niskiej mocy, tj. 4X lub 10X, aby umożliwić wykonanie wielu zdjęć większego obszaru, tak aby można było zobaczyć całą studnię.
  2. Rejestruj obrazy cyfrowe za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazów. Wykonaj obrazowanie fluorescencyjne w jasnym polu i/lub wielokanałowym.
  3. W razie potrzeby ustaw film poklatkowy, aby rejestrować obrazy w różnych kanałach na danym obszarze lub utrzymuj szkiełko nawilżone i w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 i ręcznie wyjmij je do obrazu w żądanych punktach czasowych (Rysunek 1E i F, zalecane dla dłuższych punktów czasowych).

4. Analiza i wyświetlanie

  1. Korzystając z oprogramowania do edycji obrazów, połącz obrazy świetlne i fluorescencyjne w jedną warstwę, aby na tym samym obrazie można było zobaczyć wiele typów komórek i znaczników. Przeciągnij i upuść pliki obrazów dla każdego koloru do programu, a po wyświetleniu monitu wybierz opcję "Dodaj warstwę", aby utworzyć plik obrazu z wieloma warstwami.
    1. Przy większym powiększeniu rób, wyrównuj i zszywaj obrazy w poprzek studni cyfrowo. Wyrównaj pliki, patrząc na zachowane regiony między dwoma obrazami i nakładając jeden obraz na drugi, aż zostanie wygenerowany pełny obraz.
  2. Dodawaj mikronowe paski do obrazów podczas akwizycji za pomocą oprogramowania do przechwytywania, aby określić odległość, na jaką migrowały poszczególne komórki.
  3. Aby określić migrację komórek w różnych momentach, należy wykonać mapy fluorescencji powierzchniowej za pomocą oprogramowania do obrazowania, tj. ImageJ, w celu ilościowego określenia agregacji fluorescencyjnych limfocytów T lub rozprzestrzeniania się w czasie.
    1. Aby wygenerować wykresy powierzchniowe, weź warstwowy obraz wygenerowany w kroku 4.1 i w oknie Warstwy odznacz wszystkie warstwy z wyjątkiem tych, które odpowiadają żądanemu kanałowi. Na przykład, jeśli wykres powierzchni ma być wyświetlany w celu wizualizacji wyrażenia EMD, powinny być widoczne tylko "zielone" warstwy odpowiadające filtrowi używanemu dla tego znacznika.
    2. Spłaszcz obraz i zapisz go w rozpoznanym formacie pliku (np. .png) i załaduj obraz do programu. Aby wygenerować wykres powierzchniowy, zmień typ obrazu na 8-bitowy, zmień jasność/kontrast zgodnie z potrzebami, aby zmniejszyć tło, a następnie wybierz opcję "Analizuj/Wykres powierzchniowy". Obrazy na rysunku 5 zostały wygenerowane przez zaznaczenie pól wyboru "Cień", "Rysuj oś", "Jeden wielokąt na linię" i "Wygładzaj".
    3. Alternatywnie, należy wykonać pomiary przy użyciu promienia lub średnicy od ogniskowego osadu ogniwa w czasie zerowym i porównać z komórkami w najbardziej zewnętrznym punkcie w różnych momentach. Średnica studzienek teflonowych wynosi 6,0 mm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wektory wirusowe kodujące białka fluorescencyjne mogą być używane jako dodatek lub zamiast barwnika fluorescencyjnego. Transdukcja wirusa powinna być wykonana przed testem ruchliwości. Zarówno przylegające, jak i nieprzylegające typy komórek mogą być różnie oznakowane. Protokół transdukcji będzie zależał od rodzaju zastosowanego wektora. W tym przypadku przeprowadziliśmy transdukcję alloCTL na rysunkach 3, 5 i 6 za pomocą RRV-EMD co najmniej dwa dni przed testem przy uży...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki nowotworowe w zawiesinie jednokomórkowej pipetowano do studzienek szkiełka zamaskowanego teflonem. Komórkom pozostawiono do przylegania, a następnie uformowano monowarstwy w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37°C (ryc. 1A). Do tych testów można zebrać ustalone monowarstwy lub białka ECM pochodzące z monowarstwy (ryc. 1B). Efektorowe limfocyty T znakowane ważnymi barwnikami fluorescencyjnymi lub transdukowane wektorami kodującymi EMD zostały wysian...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częściowo wspierane przez NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH/NCATS UCLA CTSI Grant Number UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734 oraz Joan S. Holmes Memorial Research Fund. MJH i GCO otrzymały wsparcie od Joan S. Holmes Memorial Postdoctoral Fellowship na UCLA. Urządzenie CSM uzyskano z Creative Scientific Methods: www.creative-sci.com. Wektor lentiwirusowy otrzymano z UCLA Vector Core, który jest obsługiwany przez CURE/P30 DK041301.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Szkiełka mikroskopowe z maską teflonowąKreatywne metody naukoweCSM002
Kolektor sedymentacji komórekKreatywne metody naukoweCSM001
Szalka Petriego, 150 mmSzalka Petriego Corning430597
, 35 mmCorning430588
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Mediatech21-040
20 μ l PipetmanGilsonF123600
200 μ l PipetmanGilsonF123601
200 μ l końcówki do pipetVWR89003-060
Destylowana, dejonizowana woda (sterylna)Mediatech25-055
TrypsinMediatech25-054-CL
Celltracker Red CMPTXInvitrogenC34552
TrypLE Express (opcjonalnie)Gibco12604
Pożywka do hodowli komórek nowotworowych (np. DMEM)Mediatech10-013
AIM-V pożywka bez surowicyInvitrogen12055-083
Surowica bydlęcapłodu Omega ScientificFB-02
odwrócony
SPOT Zaawansowaneinstrumenty
Poli-D-lizynaMiliporA-003-E
FibronektynaBD354008
31/2 x 51/4 Woreczki autoklawoweCrosstexSCXS2
Trypan BlueMediatech25-900-CI
Proliferacja komórek eFluor 670eBioscience65-0840-85
ImageJNIH
Mikroskop diagnostyczne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
  2. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  3. Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
  4. Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
  5. Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
  6. Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
  7. Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
  8. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  9. Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
  10. Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
  11. Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
  12. Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
  13. Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
  14. Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
  15. Prevention, C. fD. C. a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5 edn, Health and Human Services. (2009).
  16. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
  17. Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
  18. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
  19. Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21(2005).
  20. Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
  21. Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Radial Migration AssayNon adherent T CellsTumor Cell MonolayerCell Sedimentation ManifoldFluorescence MicroscopyRetroviral Vector TransductionCytotoxic T LymphocytesAllogeneic Effector CellsSurface Intensity MappingCo culture Migration

Related Articles