Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Podsumowanie

Pokażemy, jak przygotować wycinki siatkówki z oka myszy i rejestrować reakcje świetlne w neuronach siatkówki. Cała procedura przeprowadzana jest w warunkach przystosowanych do ciemności.

Streszczenie

Siatkówka jest bramą do układu wzrokowego. Aby zrozumieć mechanizmy przetwarzania sygnałów wzrokowych, badamy funkcje sieci neuronowych siatkówki. Neurony siatkówki w sieci składają się z wielu podtypów. W badaniach morfologicznych zidentyfikowano ponad 10 podtypów komórek dwubiegunowych, komórek zwojowych i komórek amakrynowych. Uważa się, że wiele podtypów neuronów siatkówki koduje różne cechy sygnalizacji wizualnej, takie jak ruch i kolor, oraz tworzą wiele ścieżek neuronalnych. Jednak funkcjonalne role każdego neuronu w przetwarzaniu sygnałów wzrokowych nie są w pełni poznane. Metoda zacisku krosowego jest przydatna do odpowiedzi na to podstawowe pytanie. W tym miejscu przedstawiono protokół rejestrowania wywołanych światłem odpowiedzi synaptycznych w neuronach siatkówki myszy za pomocą nagrań patch clamp w warunkach dostosowanych do ciemności. Oczy myszy są przystosowane do ciemności O/N, a preparaty z plastrów siatkówki są preparowane w ciemnym pomieszczeniu przy użyciu oświetlenia podczerwonego i widzów. Światło podczerwone nie aktywuje fotoreceptorów myszy, a tym samym zachowuje ich wrażliwość na światło. Patch clamp służy do rejestrowania odpowiedzi wywołanych światłem w neuronach siatkówki. Barwnik fluorescencyjny jest wstrzykiwany podczas nagrań w celu scharakteryzowania podtypów morfologicznych neuronów. Procedura ta pozwala nam określić fizjologiczne funkcje każdego neuronu w siatkówce myszy.

Wprowadzenie

Siatkówka jest jedną z unikalnych części układu nerwowego. Jako dostępna część mózgu, jego architektura synaptyczna została dobrze scharakteryzowana. Ponadto funkcje tej sieci neuronowej można badać za pomocą bodźca fizjologicznego: światła. Jeśli tkanka siatkówki zostanie odizolowana w ciemnym pomieszczeniu za pomocą odpowiednich procedur, neurony w tkance będą reagować na światło. Preparat ten został wykorzystany do badania przetwarzania sygnałów wzrokowych i wyjaśnienia różnych mechanizmów synaptycznych i funkcji sieci neuronowych, a także mechanizmów chorobowych.

Reakcje świetlne w neuronach siatkówki są rejestrowane od dziesięcioleci. We wczesnych badaniach wykorzystano ostre elektrody do wykonywania wewnątrzkomórkowych zapisów z neuronów siatkówki błotnych¹. W latach osiemdziesiątych XX wieku wynaleziono technikę zaciskania krosowego² i wkrótce stała się popularną metodą wśród badaczy wzroku^3,4. Zapisy pojedynczych komórek od niższych kręgowców, w tym neuronów siatkówki błotnej i ryb, były popularnymi metodami, które przyczyniły się do wyjaśnienia mechanizmów przetwarzania sygnałów wzrokowych^5,6.

Po opracowaniu technik mutacji genetycznych, siatkówka myszy stała się bardziej popularnym modelem dla badaczy wzroku^7-9. Siatkówka ssaków jest bardziej atrakcyjna niż siatkówka niższych kręgowców, ponieważ jest ewolucyjnie bliższa ludzkiej siatkówce i istnieje możliwość wykorzystania modeli chorób. Jednak komórki siatkówki myszy są małe i delikatne¹⁰, a przygotowanie siatkówki i przeprowadzanie nagrań patch clamp w ciemnym pomieszczeniu jest wyzwaniem. Wraz z postępem technologii dostępne stały się różne podejścia do badania mechanizmów sygnalizacji wzrokowej, takie jak badania obrazowe¹¹ i elektroretinogram (ERG)¹². Niemniej jednak nagrywanie pojedynczych komórek metodą patch clamp jest nadal ważne, ponieważ jest wysoce czułe czasowo i przestrzennie w porównaniu z innymi metodami. W związku z tym stale prowadziliśmy zapisy z użyciem plastrów i ulepszaliśmy nasze metody badania przetwarzania sygnału wzrokowego w preparatach plastrów siatkówki myszy^13-15.

W tym filmiku instruktażowym przedstawiono protokoły z ważnymi wskazówkami. Dobre nagrania można osiągnąć tylko przy dobrym przygotowaniu. Ćwiczenie sekcji zwierząt i zbudowanie solidnego zestawu do zacisków punktowych umożliwi większości badaczy osiągnięcie udanych nagrań.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Wayne.

1. Przygotowanie eksperymentalnego roztworu

1. Przygotuj roztwór preparacyjny od 1 dnia do 1 tygodnia przed właściwym eksperymentem. Do rozwarstwienia siatkówki należy użyć roztworu buforowego HEPES ze względu na jego silną zdolność buforowania w niższych temperaturach¹⁶. Wymieszaj wszystkie chemikalia w następujący sposób (w mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl₂, 1,0 MgCl₂, 10 HEPES, 28 glukozy. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Roztwór należy przechowywać w lodówce do 1 tygodnia.
2. Roztworem do nagrywania jest pożywka Amesa, która jest sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) przeznaczonym do preparatów siatkówki¹⁷. W dniu eksperymentu odważyć proszek Amesa (4,4 g na 500 ml roztworu) w probówce. Odważyć również NaHCO₃ (0,95 g na 500 ml roztworu) i wymieszać z proszkiem Amesa.
3. Przygotować roztwór pipety wewnątrzkomórkowej do zapisów z użyciem zacisku krosowego do dnia eksperymentu. Wymieszaj wszystkie chemikalia w następujący sposób (w mM): 111 K-glukonian, 1,0 CaCl₂, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 NaCl, 1,0 MgCl₂, 5 ATP-Mg i 1,0 GTP-Na. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą KOH. Przefiltrować roztwór pipety za pomocą konwencjonalnego filtra strzykawkowego. Przygotuj ~500 μl porcji i przechowuj je w zamrażarce lub głębokiej zamrażarce.

2. Przygotowanie do Dnia Eksperymentu

1. W noc poprzedzającą eksperyment umieść mysz w klatce (C57BL/6J lub podobne tło, 4-8 tygodni, samiec) w ciemnym pomieszczeniu w celu adaptacji do ciemności O/N.
2. Przygotowanie do sekcji:
   1. Napełnij roztwór preparacyjny (100 - 200 ml) szklaną zlewką, umieść go na lodzie i bąbelkuj tlenem przez co najmniej 10 minut.
   2. Rozpocznij natlenianie ciemnego pudełka w celu przechowywania preparatu siatkówkowego.
   3. Przygotuj plastikowe szkiełka nakrywkowe z natłuszczonymi szynami do przygotowania plastrów siatkówki i umieść każde z nich w plastikowym naczyniu o średnicy 35 mm.
   4. Przymocuj nową żyletkę do rozdrabniacza (krajalnicy do chusteczek).
   5. Przetnij membranę filtracyjną na dwie połowy. To jest do krojenia siatkówki.
   6. Ustaw narzędzia preparacyjne i przenieś pipety w pobliżu mikroskopu preparacyjnego. Obszar roboczy musi być dobrze zorganizowany, aby każde narzędzie było łatwo dostępne w ciemności.
3. Przygotowanie do nagrań z użyciem zacisków krosowych:
   1. Rozpuścić proszek Amesa i NaHCO₃ w wodzie destylowanej (Ames 4,4 g i NaHCO₃ 0,95 g/500 ml ddH₂O). Bąbelkować pożywkę Amesa zmieszanym tlenem (95%_O2 i 5% CO₂) przez co najmniej 30 minut, podgrzewając do zarejestrowanego poziomu temperatury (~35 °C). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaHCO₃, nadal bulgocząc.
   2. Rozmrozić roztwór pipety wewnętrznej podczas sekcji. Po rozmrożeniu dodaj 0,01% sulforodaminy B do barwienia wewnątrzkomórkowego.

3. Rozwarstwienie siatkówki

1. W ciemnym pokoju poddaj mysz eutanazji za pomocą dwutlenku węgla i obustronnej odmy opłucnowej. Po 2 - 3 minutach stosowania dwutlenku węgla mysz straci przytomność.
2. Kiedy mysz nie reaguje już na uszczypnięcie ogona, szybko wyłuszczej oczy i umieść je w zimnym roztworze preparacyjnym w plastikowym naczyniu. Wykonaj obustronną odmę opłucnową, aby zapewnić śmierć zwierzęcia. Szybko przechowuj oko w naczyniu w ciemnym pudełku. Użyj przeglądarki podczerwieni, aby przeprowadzić procedurę w ciemności.
   UWAGA: Alternatywnie do eutanazji można zastosować izofluran, dekapitację lub zwichnięcie szyjki macicy. Metoda eutanazji powinna być zgodna z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) i/lub Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt.
3. W ciemnym pomieszczeniu wyreguluj mikroskop preparacyjny i oświetlenie w podczerwieni. Pod mikroskopem przenieś oko z naczynia do 10 cm plastikowego naczynia ze schłodzonym roztworem preparacyjnym. Stale bąbelkuj tlen przez rurki umieszczone na dnie plastikowego naczynia. Dostosuj objętość przepływu tak, aby nie była zbyt niska, ale upewnij się, że nie jest wystarczająco wysoka, aby zakłócić rozwarstwienie.
4. Usuwanie rogówki i soczewek:
   1. Wykonaj nacięcie na górze rogówki za pomocą noża mikrochirurgicznego. Trzymanie nerwu wzrokowego na drugim końcu gałki ocznej zapobiega ruchowi oka. Przedłuż cięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych. Wytnij rogówkę z odrobiną twardówki wokół niej.
   2. Chwyć obiektyw cienkimi kleszczami i powoli wyciągnij obiektyw. Jeśli ciało szkliste jest zbyt lepkie, aby usunąć soczewkę, odetnij ciało szkliste nożyczkami.
   3. Po wykonaniu muszli ocznej delikatnie wlej zimny, natleniony roztwór preparacyjny do muszli ocznej za pomocą małej pipety transferowej.
      UWAGA: Gałka oczna szybko opróżnia się po wykonaniu nacięcia w rogówce. Ważne jest, aby zachować kształt oka, ponieważ deformacja oka podczas tego zabiegu spowoduje uszkodzenie siatkówki i odwarstwienie siatkówki.
5. Identyfikacja grzbietowej i brzusznej strony siatkówki:
   UWAGA: Ze względu na nierównomierny rozkład stożków zielonych i ultrafioletowych (UV)¹⁸, identyfikacja określonego obszaru siatkówki jest ważna dla zapisów odpowiedzi na światło.
   1. Zidentyfikuj linię biegnącą przez muszlę oczną siatkówki przechodzącą w pobliżu głowy nerwu wzrokowego. Linia ta przechodzi głównie przez brzuszną stronę nerwu wzrokowego; Strona obejmująca nerw wzrokowy jest stroną grzbietową, podczas gdy druga jest brzuszna ¹⁹. Zobacz ten punkt orientacyjny wyraźnie pod okularami w podczerwieni.
   2. W zależności od celu eksperymentu wykonaj nacięcie po niepotrzebnej stronie. Będzie to przydatne po odizolowaniu siatkówki od muszli ocznej.
6. Usuwanie ciała szklistego:
   1. Opcjonalnie inkubować muszlę oczną z hialuronidazą (0,5 mg/ml) przez 15 minut.
   2. Usuń ciało szkliste za pomocą bardzo drobnych kleszczy. Ciało szkliste jest przymocowane głównie do dolnej i zewnętrznej krawędzi muszli ocznej. Delikatnie usuń go, nie dotykając ani nie szturchając siatkówki. Ponieważ ciało szkliste może być ściśle przylegające do muszli ocznej, należy ją delikatnie wyjąć, aby uniknąć oderwania siatkówki od muszli ocznej. Kontynuuj ciągnięcie, aż nie będzie odczuwalne napięcie.
      UWAGA: Ten krok jest szczególnie ważny w przypadku preparowania siatkówki myszy; Nie stanowi to jednak problemu dla siatkówki innych gatunków, takich jak szczur czy salamandra.
7. Odizoluj siatkówkę od muszli ocznej. Chwyć twardówkę i delikatnie oderwij siatkówkę za pomocą tylnej strony kleszczy.
   UWAGA: Preparaty siatkówki w całości można wykonać z izolowanej siatkówki. Wykonaj trzy do czterech nacięć na krawędziach i spłaszcz siatkówkę lub pokrój siatkówkę na kilka części.
8. Przyciąć siatkówkę i wyrzucić niepotrzebną połowę siatkówki (krok 3.5). W tym samym plastikowym naczyniu pokrój pozostałą siatkówkę na dwie części. Dla każdego kawałka siatkówki odetnij krawędzie, aby utworzyć płytę siatkówki i przytnij zagięte krawędzie.
9. Przenieś płytę siatkówki na szklaną płytkę za pomocą dużej pipety do przenoszenia (~2 ml). Zassaj nadmiar roztworu małą pipetą, użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby spłaszczyć płytę, a następnie szybko umieść kawałek membrany filtracyjnej na wierzchu tkanki.
   1. Za pomocą małej pipety transferowej umieść kroplę roztworu preparacyjnego na membranie filtracyjnej. Odczekaj ~15 sekund, aż roztwór rozleje się po membranie. W tym czasie tkanka siatkówki przyklei się do membrany filtracyjnej.
   2. Wlej więcej zimnego roztworu preparacyjnego pod filtrem i wokół niego. Tkanka siatkówki z membraną filtracyjną będzie unosić się na wodzie. Chwyć membranę filtracyjną za pomocą kleszczyków i umieść ją w komorze krojenia. Na tkankę wlać roztwór preparacyjny i przechowywać preparat w ciemnym pudełku.
      UWAGA: Opisana tutaj procedura ma kluczowe znaczenie. Ważne jest, aby wykonać te czynności szybko, aby upewnić się, że tkanka siatkówki przylega do membrany filtracyjnej i nie wysycha.
10. Za pomocą siekacza pokrój tkankę siatkówki na plasterki. Grubość około 200 μm jest możliwa do przeprowadzenia w przypadku badań z zaciskiem krosowym.
11. Umieść plastikowe szkiełko nakrywkowe z szynami smarowymi w komorze krojenia. Przenieś plaster siatkówki na szyny smarowe na plastikowym szkiełku nakrywkowym. Obróć plasterek o 90°, tak aby przekrój poprzeczny był widoczny. Dociśnij membranę filtracyjną do szkiełka nakrywkowego, a następnie przykryj boki bibuły filtracyjnej smarem.
    1. Po unieruchomieniu plastra na plastikowym szkiełku nakrywkowym, chwyć szkiełko nakrywkowe i przenieś je do plastikowego naczynia o średnicy 35 mm. Wlać zimny roztwór preparacyjny na preparat siatkówki i zanurzyć preparat. Przechowuj każde naczynie w ciemnym pudełku, które powinno być stale natleniane.
       UWAGA: Całą procedurę należy wykonać ostrożnie, aby membrana filtra nie uległa deformacji. W przeciwnym razie plaster siatkówki łatwo oddziela się od membrany filtracyjnej.

4. Nagrania z zacisku krosowego z przygotowania plastrów siatkówki

1. Przygotowanie nagrania:
   1. Zagruntować rurki perfuzyjne pożywką Amesa. Pozwól, aby wszystkie pęcherzyki przeszły przez niego podczas napełniania rurki.
   2. Wykonaj pipety rejestrujące z zaciskiem krosowym za pomocą ściągacza. Aby napełnić pipetę roztworem pipety, zanurz ją w tylnej części pipety na 1 minutę, aż końcówka pipety zostanie wypełniona. Następnie napełnij ~1/3 pipety za pomocą napełniacza do mikropipet. Każdą pipetę należy przechowywać w wilgotnym pudełku na pipety.
   3. Włącz sprzęt do nagrywania z użyciem zacisku krosowego, w tym komputer, wzmacniacz, kamerę CCD i mikroskop.
2. Wyłącz światło w pokoju. Umieść preparat plastra siatkówki w komorze stolika mikroskopu za pomocą wizjera na podczerwień. Po unieruchomieniu rozpocznij ciągłą perfuzję. Ustawić temperaturę perfuzji na 33 do 37 °C.
3. Wyświetl powierzchnię przekroju za pomocą kamery CCD. Skoncentruj się na lokalizacji docelowej, w której znajdują się typy komórek docelowych. Wybierz zdrowo wyglądającą komórkę do nagrywania z zaciskiem krosowym (tj. powinna mieć gładką powierzchnię i dobry kształt komórki).
4. Umieść pipetę rejestrującą w uchwycie na pipety. Przesunąć pipetę do preparatu plastrów. Gdy znajdzie się w pobliżu miejsca przygotowania plastra (~2 mm powyżej), znajdź końcówkę pipety za pomocą mikroskopu. Gdy końcówka pipety będzie widoczna pod mikroskopem, przesuń końcówkę w dół w kierunku komórki docelowej.
5. Ustaw wzmacniacz. Wyreguluj pipetę na 0 mV/0 pA (zerowanie) i rozpocznij ciągły impuls elektryczny o napięciu ~5 mV przy ~10 Hz. Sprawdź rezystancję pipety; idealna rezystancja wynosi od 5 do 10 MΩ dla większości neuronów siatkówki.
6. Zacznij wydmuchiwać od końcówki. Użyj ustnika lub strzykawki, aby wywrzeć nadciśnienie, gdy pipeta zanurza się w roztworze do kąpieli. Ciągle wydmuchuj roztwór wewnętrzny, aż końcówka znajdzie się na powierzchni komórki docelowej.
   1. Gdy nadciśnienie utworzy małe wgłębienie na powierzchni komórki, lekko przesuń końcówkę i przestań wydmuchiwać. Sprawdź rezystancję pipety, która powinna wzrosnąć. Jeśli stale rośnie, pozostaw go i monitoruj rezystancję, aż osiągnie >1 GΩ (gigaseal). Jeśli opór nie wzrasta spontanicznie, delikatnie zastosuj podciśnienie, aż stanie się gigasealem.
7. Po osiągnięciu gigaseal zmień potencjał utrzymywania na -70 mV. Następnie należy stosować okresowe podciśnienie, aby rozerwać membranę wewnątrz końcówki pipety. Po wykonaniu konfiguracji całej kuwety rezystancja pipety może wynosić od 500 MΩ do 1 GΩ, a prąd pojemnościowy jest widoczny. Czasami można zaobserwować spontaniczne prądy postsynaptyczne.
8. Zapisz zależność I-V od -80 do +40 mV. W zależności od typu ogniwa aktywowane są różne typy kanałów bramkowanych napięciem.
9. Rejestruj prądy lub napięcia synaptyczne wywołane światłem.

Wyniki

Reprezentatywne przygotowanie plasterka jest pokazane na rysunku 1. Preparat plastrów odbywa się w pozycji prostej, pokazując fotoreceptory do komórek zwojowych na płaskiej powierzchni i bez odklejania się od bibuły filtracyjnej. Jeśli plasterek jest przechylony, tylko część preparatu jest ostra, co utrudnia zidentyfikowanie odpowiedniej komórki do zaciskania łaty. W przypadku nagrań ważne jest, aby wybrać dobrą somę, która zwykle ma błyszczącą powierzchnię, równomierny okrągły kształt i nie ma widocznyc...

Dyskusja

Dobre nagrania można osiągnąć tylko dzięki dobrym preparatom siatkówkowym i dobrze zaprojektowanym konfiguracjom patch clamp. Chociaż wszystkie opisane powyżej kroki są ważne, dyskusja podkreśla kilka krytycznych kroków zarówno dla sekcji, jak i nagrań.

W przypadku sekcji szczególnie ważne są dwie rzeczy: chłodzenie i natlenienie. Po wyłuszczeniu oka szybko wyjmij przednią część oka w komorze preparacyjnej z pęcherzykami tlenu, schłodzonym roztworem preparacyjnym i wlej zimny roztwór do muszl...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy (28-60 dni, samiec)	Laboratorium Jacksona	C57BL/6J
Ames' medium	Sigma	A1420	doskonały
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	SMZ745	doskonały
Narzędzie preparacyjne: kleszcze	Dumont	#4, #5, #55	doskonałe
Narzędzie preparacyjne: nożyczki	Roboz	RS-5605	doskonały
Narzędzie preparacyjne: nóż chirurgiczny	Surgistar	7514	doskonała
żyletka (do rozdrabniacza)	EMS	71970	doskonała
Chopper	ręcznie robiony
przeglądarka na podczerwień	Night Owl Optics	NOBG1	Pokazuje jasny widok. Ustawianie ostrości na małych obiektach jest problemem.
Ściągacz	Sutter	P-1000	doskonały; produkuje pipety o jednakowych rozmiarach.
Ciemne pudełko	Pelikan	ciemne pudełko	doskonałe
System zacisków krosowych	Scientifica	slice scope 2000	Doskonała konfiguracja. Większość kluczowych komponentów znajduje się w jednym pakiecie. Mikromanipulatory są doskonałe.
Wzmacniacz	Molecular Devices	multiclamp 700B	Doskonała i łatwa kontrola.
Nabywanie oprogramowania	Urządzenia molekularne	Oprogramowanie pClamp	Doskonała i łatwa kontrola.
Źródło światła (LED)	Fajny	4-kanałowy system LED pE-2	Doskonała
kamera CCD	Obrazowanie Q	Retiga 2000	Doskonała
klatka Faradaya	ręcznie robiona