Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52428

⸱

16 lutego 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Streszczenie

Regulowana degradacja białek jest kluczowa dla praktycznie każdej funkcji komórkowej. Wiele z tego, co wiemy o mechanizmach molekularnych i wymaganiach genetycznych dotyczących degradacji białek eukariotycznych, zostało początkowo ustalone u Saccharomyces cerevisiae. Klasyczne analizy degradacji białek opierały się na metodologiach biochemicznej pogoni za impulsem i cykloheksymidu. Chociaż techniki te zapewniają czułe środki do obserwacji degradacji białek, są pracochłonne, czasochłonne i mało wydajne. Podejścia te nie są podatne na szybkie lub zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe w kierunku mutacji, które zapobiegają degradacji białek. W tym miejscu opisano test oparty na wzroście drożdży w celu łatwej identyfikacji wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek. W tym teście enzym reporterowy wymagany do wzrostu w określonych warunkach selektywnych jest łączony z niestabilnym białkiem. Komórki pozbawione endogennego enzymu reporterowego, ale wykazujące ekspresję białka fuzyjnego, mogą rosnąć w warunkach selektywnych tylko wtedy, gdy białko fuzyjne jest ustabilizowane (tj. gdy degradacja białka jest zagrożona). W opisanym tutaj teście wzrostu seryjne rozcieńczenia komórek drożdży typu dzikiego i zmutowanych zawierających plazmid kodujący białko fuzyjne są wykrywane na pożywce selektywnej i nieselektywnej. Wzrost w warunkach selektywnych jest zgodny z upośledzeniem degradacji przez daną mutację. Zwiększona zasobność w białko powinna być potwierdzona biochemicznie. Przedstawiono również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży w postaci odpowiedniej do elektroforezy i western blot. Oparty na wzroście odczyt stabilności białek, w połączeniu z prostym protokołem ekstrakcji białek do analizy biochemicznej, ułatwia szybką identyfikację wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek. Techniki te można zaadaptować do monitorowania degradacji różnych krótkożyciowych białek. W przedstawionym przykładzie enzym His3, który jest niezbędny do biosyntezy histydyny, został połączony z Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 jest przeznaczony do degradacji po nieprawidłowym zaangażowaniu translokonu retikulum endoplazmatycznego. Komórki zawierające Deg1-Sec62-His3 były w stanie rosnąć w selektywnych warunkach, gdy białko było ustabilizowane.

Wprowadzenie

Selektywna degradacja białek jest niezbędna dla życia eukariotycznego, a zmieniona degradacja białek przyczynia się do wielu schorzeń, w tym kilku rodzajów raka, chorób neurodegeneracyjnych, chorób sercowo-naczyniowych i mukowiscydozy1-5. Układ ubikwityna-proteasom (UPS), który katalizuje selektywną degradację białek, jest nowym celem terapeutycznym dla tych schorzeń6-10. Ligazy ubikwityny kowalencyjnie przyłączają polimery 76-aminokwasu ubikwityny do białek11. Białka, które zostały oznaczone łańcuchami poliubikwityny, są rozpoznawane i proteolizowane przez proteasom12 ~2,5 megadaltonu 26S. Badania rozpoczęte na modelowym organizmie eukariotycznym Saccharomyces cerevisiae (pączkujące drożdże) miały fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów degradacji białek w komórkach eukariotycznych. Pierwszym zademonstrowanym fizjologicznym substratem UPS był drożdżowy represor transkrypcyjny MATα213,14, a wiele wysoce konserwatywnych składników UPS zostało po raz pierwszy zidentyfikowanych lub scharakteryzowanych w drożdżach (np. 15-26). Odkrycia dokonane w tym wszechstronnym i genetycznie podatnym organizmie modelowym prawdopodobnie nadal dostarczą ważnych informacji na temat konserwatywnych mechanizmów degradacji za pośrednictwem ubikwityny.

Rozpoznawanie i degradacja większości substratów UPS wymaga skoordynowanego działania wielu białek. Dlatego ważnym celem w scharakteryzowaniu regulowanej degradacji danego niestabilnego białka jest określenie wymagań genetycznych dla proteolizy. Klasyczne podejścia (np. eksperymenty z pościgiem impulsowym i cykloheksymidem27) do monitorowania degradacji białek w komórkach ssaków lub drożdży są pracochłonne i czasochłonne. Chociaż tego typu metodologie zapewniają bardzo czułe środki do wykrywania degradacji białek, nie nadają się do szybkiej analizy degradacji białek ani do badań przesiewowych na dużą skalę w kierunku mutacji, które zapobiegają degradacji białek. W tym miejscu przedstawiono test oparty na wzroście drożdży do szybkiej identyfikacji wymagań genetycznych dotyczących degradacji niestabilnych białek.

W metodzie analizy degradacji białek opartej na wzroście drożdży, niestabilne białko będące przedmiotem zainteresowania (lub sygnał degradacji) jest łączone w ramce z białkiem, które jest wymagane do wzrostu drożdży w określonych okolicznościach. Rezultatem jest sztuczny substrat, który może służyć jako potężne narzędzie do określania genetycznych wymagań degradacji niestabilnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Dla wygody, najczęściej stosowane szczepy drożdży laboratoryjnych zawierają panel mutacji w genach kodujących enzymy metaboliczne biorące udział w biosyntezie poszczególnych aminokwasów lub zasad azotowych (np. 20,28-30). Enzymy te są niezbędne do proliferacji komórkowej przy braku egzogennie dostarczanych metabolitów, w syntezie których enzymy uczestniczą. Takie enzymy metaboliczne mogą zatem funkcjonować jako reportery oparte na wzroście dla degradacji niestabilnych białek, z którymi są połączone. Genetyczne wymagania dotyczące degradacji białek można łatwo wyjaśnić, ponieważ mutacje, które zapobiegają proteolizie, pozwolą komórkom zawierającym reporter degradacji rosnąć w selektywnych warunkach.

Przewaga wzrostu jest pośrednią wskazówką, że dana mutacja zwiększa obfitość interesującego nas białka. Wymagana jest jednak bezpośrednia analiza biochemiczna, aby potwierdzić, że mutacja umożliwia wzrost poprzez zwiększony poziom białka, a nie poprzez przyczyny pośrednie lub sztuczne. Wpływ mutacji na obfitość białka może być potwierdzony przez analizę western blot poziomów białka w stanie stacjonarnym w komórkach, które są nosicielami danej mutacji i nie są jej nosicielami. Przedstawiono również metodę szybkiej i efektywnej ekstrakcji białek drożdży (sekwencyjna inkubacja komórek drożdży z wodorotlenkiem sodu i buforem próbki) w postaci nadającej się do analizy metodą western blot31. Łącznie eksperymenty te ułatwiają szybką identyfikację potencjalnych regulatorów degradacji białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Test wzrostu drożdży w celu identyfikacji potencjalnych mutantów z defektem degradacji białek

  1. Przeprowadzić transformację komórek drożdży typu dzikiego oraz mutantów plazmidem kodującym niestabilne białko połączone, w odpowiedniej ramce odczytu, z reporterowym enzymem metabolicznym.
  2. Zaszczepić transformanty w 5 ml syntetycznego medium zdefiniowanego (SD), które jest selektywne dla komórek zawierających cząsteczki plazmidu. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C przy jednoczesnym rotowaniu.
  3. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) dla każdej hodowli nocnej.
    UWAGA: Po nocnej inkubacji komórki w hodowli mogą znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego lub stacjonarnego, ale powinny osiągnąć minimalną wartość OD600 równą 0,2. Bardzo wolno rosnące szczepy drożdży mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji niż jedna noc lub zaszczepienia większej liczby komórek, co należy ustalić empirycznie.
  4. Przygotować sześciokrotne rozcieńczenia seryjne transformowanych komórek drożdży w sterylnej płytce 96-dołkowej, zaczynając od rozcieńczenia komórek do OD600 0,2. Każdego badanego transformanta drożdży należy umieścić w osobnym rzędzie płytki 96-dołkowej.
    1. Dla każdego transformanta obliczyć objętość hodowli nocnej wymaganą do rozcieńczenia komórek do OD600 0,2 w końcowej objętości 200 µl. Dodać tę objętość hodowli nocnej do odpowiedniego dołka w kolumnie 1. Dodać odpowiednią ilość sterylnej wody, aby uzyskać objętość 200 µl.
    2. Dla każdego rzędu drożdży dodać 125 µl sterylnej wody do dołków w kolumnach 2, 3 i 4.
      UWAGA: Indywidualnie pakowane sterylne płytki 96-dołkowe mogą być dostarczone ze sterylnymi pokrywkami. Pokrywki mogą służyć jako zbiorniki dla sterylnej wody rozprowadzanej w tym kroku. Pozwala to na jednoczesny transfer sterylnej wody do wszystkich dołków w danej kolumnie za pomocą pipety wielokanałowej.
    3. Wymieszać zawartość pierwszej kolumny (drożdże rozcieńczone do OD600 0,2) poprzez wielokrotne pobieranie i wydawanie cieczy pipetą wielokanałową.
    4. Przenieść 25 µl drożdży z kolumny 1 do kolumny 2 za pomocą pipety wielokanałowej. Wymieszać poprzez wielokrotne pobieranie i wydawanie cieczy. Przenieść 25 µl z kolumny 2 do kolumny 3 oraz 25 µl z kolumny 3 do kolumny 4 (dokładnie mieszając na każdym etapie).
  5. Wymieszać każdą próbkę pipetą wielokanałową. Przechodząc od kolumn z najbardziej do najmniej rozcieńczonych drożdży, nanieść 4 µl każdej próbki na dwie płytki zawierające odpowiednie medium selektywne. Użyć jednej płytki z medium utrzymującym selekcję plazmidu (płytka ta służy jako kontrola naniesienia i wzrostu drożdży). Użyć drugiej płytki z medium selekcjonującym utrzymanie plazmidu i ekspresję niestabilnego białka połączonego z enzymem reporterowym. Ponieważ drożdże szybko osiadają, należy mieszać komórki poprzez wielokrotne pobieranie i wydawanie cieczy w regularnych odstępach czasu.
    UWAGA: Płytki bardziej wysuszone chłoną ciecz łatwiej niż świeżo przygotowane, dlatego są zalecane do tych eksperymentów. Wilgotne płytki można suszyć poprzez inkubację w temperaturze pokojowej przy niskiej wilgotności przez 1–2 dni lub krócej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Płytki mogą wysychać nierównomiernie, jeśli laminarny przepływ powietrza jest równoległy do blatu. Użycie szablonu ułatwia nanoszenie komórek drożdży w regularnych odstępach. Dwa przykładowe szablonu przedstawiono na Rysunku 1. Można je wydrukować, wyciąć i przymocować do wnętrza pokrywki szalki Petriego.
  6. Pozostawić płytki do wyschnięcia na blacie.
  7. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2–6 dni.
  8. Wykonać zdjęcie każdej płytki po inkubacji.

Schematy projekcji stereograficznej A i B ilustrujące koncepcje transformacji matematycznej.
Rysunek 1. Szablony do nanoszenia komórek drożdży na 100-mm płytki agarowe. Szablony te mogą być wykorzystane w celu ułatwienia nanoszenia drożdży w regularnych odstępach za pomocą pipety wielokanałowej. Szablony można wydrukować, wyciąć i przymocować do wewnętrznej strony pokrywki szalki Petriego. Należy umieścić szalkę Petriego z pożywką wewnątrz pokrywki z przymocowanym szablonem. Szablony są oznaczone nacięciem w celu śledzenia orientacji. Zaleca się, aby płytki stosowane w testach wzrostu były w podobny sposób oznaczone nacięciem w celu śledzenia orientacji. Przedstawiono szablony do nanoszenia czterech (A) lub pięciu (B) rozcieńczeń seryjnych komórek drożdży. Kliknij tutaj, aby wyświetlić wersję tego rysunku do druku z szablonami 100-mm.

2. Biochemiczne potwierdzenie testu wzrostu drożdży

  1. Wzrost komórek drożdży i ekstrakcja białek po traktowaniu zasadą (zmodyfikowano na podstawie 31)
    1. Przetransformuj komórki drożdży typu dzikiego oraz mutanty plazmidem kodującym niestabilne białko.
    2. Zaszczep transformanty w 5 ml pożywki SD selektywnej dla komórek zawierających cząsteczki plazmidu. Inkubuj przez noc w 30 °C w rotacji.
    3. Zmierz OD600 każdej kultury nocnej.
      UWAGA: Po inkubacji nocnej komórki mogą znajdować się w fazie wzrostu logarytmicznego lub stacjonarnego, ale powinny osiągnąć wartość OD600 pozwalającą na rozcieńczenie do OD600 wynoszącej 0,2 w 10 ml świeżej pożywki selektywnej (krok 2.1.4). Szczepy drożdży o bardzo wolnym wzroście mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji niż jedna noc lub zaszczepienia większej liczby komórek, co należy określić empirycznie.
    4. Rozcieńcz komórki drożdży do OD600 wynoszącej 0,2 w 10 ml świeżej pożywki selektywnej.
    5. Kontynuuj inkubację komórek w 30 °C w rotacji lub wytrząsaniu, aż kultury osiągną OD600 w zakresie od 0,8 do 1,2 (t.j. znajdą się w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego).
      UWAGA: Jeśli badane niestabilne białko znajduje się pod kontrolą promotora regulowanego, optymalny czas indukcji ekspresji białka i zbioru komórek może się różnić w zależności od wcześniejszych badań lub obserwacji empirycznych.
    6. Zbierz 2,5 jednostek OD600 kultury do 15-ml probówki stożkowej poprzez wirowanie przy 5,000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Usuń nadosad za pomocą pipety lub aspiracji.
      UWAGA: Jedną jednostkę OD600 definiuje się jako ilość drożdży obecną w 1 ml kultury przy OD600 wynoszącej 1,0. Objętość kultury (w ml) wymaganą do zebrania 2,5 jednostek OD600 (V) można wyznaczyć za pomocą następującego równania: V = 2,5 jednostek OD600 / zmierzona wartość OD600
    7. Resuspenduj komórki w 1 ml wody destylowanej. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki do mikrocentryfugi.
    8. Osadź komórki przez wirowanie przy 6,500 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej. Usuń nadosad za pomocą pipety lub aspiracji.
    9. Resuspenduj komórki w 100 µl wody destylowanej poprzez pipetowanie w górę i w dół lub mieszanie w wortexie, a następnie dodaj 100 µl 0,2 M NaOH. Wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół. Inkubuj próbki przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    10. Osadź komórki (z których większość nie uwolniła jeszcze białek i jest nadal żywa) przez wirowanie przy 18,000 x g przez 5 min. Usuń nadosad za pomocą pipety lub aspiracji.
    11. Resuspenduj osad w 50 – 100 µl 1x buforu do próbek Laemmli, który zlizuje komórki, poprzez pipetowanie w górę i w dół lub mieszanie w wortexie.
      UWAGA: Usunięcie zasadowego nadosadu po wirowaniu i późniejsza resuspensja komórek w buforze do próbek Laemmli pozwala na ekstrakcję białek przy pH kompatybilnym z elektroforezą w żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-PAGE) z użyciem systemu buforu do rozdziału Tris-glicyna oraz z analizą western blot.
    12. Aby całkowicie zdenaturować białka, inkubuj lizaty w 95 °C przez 5 min.
      UWAGA: Białka podatne na agregację (np. białka z kilkoma segmentami transbłonowymi) mogą stać się nierozpuszczalne podczas inkubacji w 95 °C. W związku z tym, w analizie takich białek lizaty należy inkubować w niższych temperaturach (np. 37 °C – 70 °C) przez 10 – 30 min, zgodnie z ustaleniami empirycznymi.
    13. Ochłodź lizaty, umieszczając je na lodzie przez 5 min.
    14. Wiruj lizaty przy 18,000 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej, aby osadzić materiał nierozpuszczalny. Rozdziel nadosad (rozpuszczone wyekstrahowane białko) za pomocą SDS-PAGE przed późniejszą analizą western blot (sekcja 2.2). Alternatywnie przechowuj lizaty w -20 °C.
  2. Reprezentatywny protokół analizy Western Blot
    1. Naniesie empirycznie określoną objętość lizatów na żel SDS-PAGE.
    2. Prowadź elektroforezę przy 200 V, aż front barwnika dotrze do dołu żelu.
    3. Przenieś białka z żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) poprzez transfer mokry przy 20 V przez 60 – 90 min w 4 °C.
    4. Zablokuj membranę, inkubując ją w 5% odtłuszczonym mleku w soli buforowanej trisem (TBS), w rotacji, przez 1 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
    5. Odlej roztwór blokujący.
    6. Inkubuj membranę z przeciwciałem pierwotnym specyficznym dla badanego białka (lub jego znacznika epitopowego) w 1% odtłuszczonym mleku w TBS z 0,1% Tween-20 (TBS/T) przez 1 h w temperaturze pokojowej, w rotacji.
    7. Odlej roztwór przeciwciał i przemyj membranę 3 x 5 min w TBS/T w temperaturze pokojowej, w rotacji.
    8. Inkubuj membranę z odpowiednim wtórnym przeciwciałem sprzężonym z fluorophorem w 1% odtłuszczonym mleku w TBS/T przez 1 h w temperaturze pokojowej, w rotacji.
      UWAGA: Ponieważ fluorophore są światłoczułe, rozcieńczenia przeciwciał sprzężonych z fluorophore powinny być przygotowywane w ciemności. Dodatkowo inkubacja membran w obecności przeciwciał sprzężonych z fluorophore powinna odbywać się w pojemnikach światłoszczelnych. Można to osiągnąć poprzez owinięcie kuwet do inkubacji folią aluminiową.
    9. Odlej roztwór przeciwciał i przemyj membranę 3 x 5 min w TBS/T w temperaturze pokojowej, w rotacji.
    10. Wykonaj obrazowanie membrany przy użyciu urządzenia Li-Cor Odyssey CLx i oprogramowania Image Studio (lub porównywalnego sprzętu i oprogramowania do obrazowania), zgodnie z zaleceniami producenta.
    11. Po obrazowaniu membrany inkubuj ją z przeciwciałem pierwotnym specyficznym dla białka kontrolnego (loading control) w 1% odtłuszczonym mleku w TBS/T przez 1 h w temperaturze pokojowej, w rotacji.
    12. Odlej roztwór przeciwciał i przemyj membranę 3 x 5 min w TBS/T w temperaturze pokojowej, w rotacji.
    13. Inkubuj membranę z odpowiednim wtórnym przeciwciałem sprzężonym z fluorophore w 1% odtłuszczonym mleku w TBS/T przez 1 h w temperaturze pokojowej, w rotacji.
    14. Odlej roztwór przeciwciał i przemyj membranę 3 x 5 min w TBS/T w temperaturze pokojowej, w rotacji.
    15. Wykonaj obrazowanie membrany przy użyciu urządzenia Li-Cor Odyssey CLx i oprogramowania Image Studio (lub porównywalnego sprzętu i oprogramowania do obrazowania), zgodnie z zaleceniami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zilustrować tę metodologię, enzym His3 został połączony z końcem karboksylowym modelowego substratu degradacji związanej z retikulum endoplazmatycznym (ERAD), Deg1-Sec62 (Rysunek 2A), w celu utworzenia Deg1-Sec62-His3 (Rysunek 3). Deg1-Sec62 jest reprezentatywnym członkiem nowej klasy substratów ERAD, które są kierowane do degradacji po trwałym, aberrantnym powiązaniu z translokonem – kanałem odpowiedzialnym głównie za transport białek przez błonę ER32...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona metodologia pozwala na szybkie określenie i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek w komórkach drożdży. Eksperymenty te podkreślają użyteczność i moc drożdży jako modelowego organizmu eukariotycznego (kilka doskonałych przeglądów biologii drożdży i kompilacji protokołów obchodzenia się, przechowywania i manipulowania komórkami drożdży (np. 41-44) jest dostępnych dla badaczy nowych w organizmie). Techniki te mogą być z łatwością stosowane do badania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy obecnym i byłym członkom laboratorium Rubensteina za zapewnienie wspierającego i entuzjastycznego środowiska badawczego. Dziękujemy Ryanowi T. Gibsonowi za pomoc w optymalizacji protokołu. Dziękujemy Markowi Hochstrasserowi (Uniwersytet Yale) i Dieterowi Wolfowi (Universität Stuttgart) za szczepy drożdży i plazmidy. Dziękujemy naszym anonimowym recenzentom za pomoc w poprawie przejrzystości i użyteczności tego manuskryptu. Praca ta została wsparta nagrodą badawczą przyznaną przez oddział Sigma Xi na rzecz SGW na Uniwersytecie Stanowym Ball, grant National Institutes of Health (R15 GM111713) dla E.M.R., nagrodę badawczą ASPiRE Uniwersytetu Stanowego Ball dla E.M.R. oraz fundusze z Biura Rektora i Wydziału Biologii Uniwersytetu Stanowego Ball.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożądane szczepy drożdży, plazmidy, pożywka wzorcowa i składnikiSzczepy drożdży z pożądanymi mutacjami mogą być generowane w laboratorium badacza. Drożdże typu dzikiego i różne mutanty są również dostępne na rynku (np. firmy GE Healthcare). Plazmidy kodujące białka fuzyjne mogą być generowane w laboratorium badacza.
3-amino-1H-1,2,4-triazolFisher ScientificAC264571000Kompetycyjny inhibitor enzymu His3. Może być włączony do pożywki w celu zwiększenia rygorystyczności testu wzrostu przy użyciu konstruktów reporterowych His3.
Endoglikozydaza H (forma rekombinowana z Streptomyces plicatus)Roche11088726001Może być stosowana do oceny N-glikozylacji białek; zgodna ze stężeniami SDS i beta-merkaptoetanolu znajdującymi się w 1x buforze próbki Laemmli.
Jednorazowe probówki ze szkła borokrzemianowegoFisher Scientific14-961-32Dostępne u różnych producentów
Inkubator z regulacją temperatury (np. Inkubator Heratherm model IMH180)Dot Scientific51028068Dostępne u różnych producentów
New Brunswick Wymienny bęben do rur 18 mm (rolka rurowa)New BrunswickM1053-0450Wałek rurowy jest zalecany do utrzymywania przez noc kultur starterowych drożdży komórek drożdży w zawiesinie. Wytrząsarka platformowa lub rolka rurowa mogą być używane do utrzymywania większych kultur w zawiesinie.
New Brunswick TC-7 Bęben rolkowy 120V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004Do użytku z wałkiem rurowym
SmartSpec Plus SpektrofotometrBio-Rad170-2525Dostępne u różnych producentów
Sterylne 96-dołkowe płytki mikrotestowe z płaskim dnem z pokrywką pakowaną pojedynczoSarstedt82.1581.001Dostępne u różnych producentów
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & mu; lGilsonF14401Dostępne od różnych producentów
 
 
 

 
[nagłówek]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μ lGilsonF14403Pipetatory jednokanałowe i wielokanałowe są używane na różnych etapach protokołu. Podczas gdy pipety wielokanałowe zmniejszają obciążenie pipetowania na kilku etapach, pipety jednokanałowe mogą być używane w całym protokole. Dostępne od różnych producentów.
Wirówka 5430Eppendorf5427 000.216Rotor sprzedawany z urządzeniem zawiera probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 i 2,0 ml. Rotor można zamienić na taki, który mieści stożkowe probówki o pojemności 15 ml i 50 ml.
System obrazowania płytek (np. Gel Doc XR+ System)Bio-Rad170-8195Do obrazowania płytek można stosować różne systemy, w tym zaawansowane systemy obrazowania, skanery komputerowe i telefony z aparatem fotograficznym.
Rotor kątowy F-35-6-30 z pokrywą i adapterami do wirówki model 5430/R, 15/50 ml probówki stożkowe, 6-miejscoweEppendorfF-35-6-30
15 ml rurka z sitodrukiem 17 x 20 mm stożkowa, polipropylenowaSarstedt62.554.205Dostępne u różnych producentów
Elastyczna probówka 1,5 ml, PCR czysta, Naturalne probówki do mikrowirówekEppendorf22364120Dostępne w różnych rozmiarach producenci
Analogowy podgrzewacz Dri-BathFisher Scientific1172011AQWrząca łaźnia wodna z płytą grzejną może być również używana do denaturacji białek
SDS-PAGE i aparatury transferowej, zasilaczy i sprzętu do obrazowania lub ciemni dla SDS-PAGE i transferu do membranyBędzie się różnić w zależności od laboratorium i aplikacji
System obrazowania Western blot (np. skaner Li-Cor Odyssey CLx i oprogramowanie Image Studio)Li-Cor9140-01Różni się w zależności od laboratorium i zastosowania
Membrany transferowe EMD Millipore Immobilon PVDFIPFL00010 Fisher ScientificBędzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania
Przeciwciała pierwszorzędowe (np. Kinaza fosfoglicerynianowa (Pgk1) Przeciwciało monoklonalne, mysz (klon 22C5D8))LifeTechnologies459250Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania
Przeciwciała drugorzędowe (np. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))Life TechnologiesA-21065Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania
buforowe

Bibliografia

  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11(2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093(2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791(2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test wzrostu drożdżybiałko fuzyjnepodłoże selekcyjneekstrakcja białkaanaliza Western blotrozcieńczenia seryjneligaza ubikwitynybiałko niestabilne
Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.