Artykuł metodologiczny

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/52428

⸱

16 lutego 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulowana degradacja białek jest kluczowa dla praktycznie każdej funkcji komórkowej. Wiele z tego, co wiemy o mechanizmach molekularnych i wymaganiach genetycznych dotyczących degradacji białek eukariotycznych, zostało początkowo ustalone u Saccharomyces cerevisiae. Klasyczne analizy degradacji białek opierały się na metodologiach biochemicznej pogoni za impulsem i cykloheksymidu. Chociaż techniki te zapewniają czułe środki do obserwacji degradacji białek, są pracochłonne, czasochłonne i mało wydajne. Podejścia te nie są podatne na szybkie lub zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe w kierunku mutacji, które zapobiegają degradacji białek. W tym miejscu opisano test oparty na wzroście drożdży w celu łatwej identyfikacji wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek. W tym teście enzym reporterowy wymagany do wzrostu w określonych warunkach selektywnych jest łączony z niestabilnym białkiem. Komórki pozbawione endogennego enzymu reporterowego, ale wykazujące ekspresję białka fuzyjnego, mogą rosnąć w warunkach selektywnych tylko wtedy, gdy białko fuzyjne jest ustabilizowane (tj. gdy degradacja białka jest zagrożona). W opisanym tutaj teście wzrostu seryjne rozcieńczenia komórek drożdży typu dzikiego i zmutowanych zawierających plazmid kodujący białko fuzyjne są wykrywane na pożywce selektywnej i nieselektywnej. Wzrost w warunkach selektywnych jest zgodny z upośledzeniem degradacji przez daną mutację. Zwiększona zasobność w białko powinna być potwierdzona biochemicznie. Przedstawiono również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży w postaci odpowiedniej do elektroforezy i western blot. Oparty na wzroście odczyt stabilności białek, w połączeniu z prostym protokołem ekstrakcji białek do analizy biochemicznej, ułatwia szybką identyfikację wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek. Techniki te można zaadaptować do monitorowania degradacji różnych krótkożyciowych białek. W przedstawionym przykładzie enzym His3, który jest niezbędny do biosyntezy histydyny, został połączony z Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 jest przeznaczony do degradacji po nieprawidłowym zaangażowaniu translokonu retikulum endoplazmatycznego. Komórki zawierające Deg1-Sec62-His3 były w stanie rosnąć w selektywnych warunkach, gdy białko było ustabilizowane.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selektywna degradacja białek jest niezbędna dla życia eukariotycznego, a zmieniona degradacja białek przyczynia się do wielu schorzeń, w tym kilku rodzajów raka, chorób neurodegeneracyjnych, chorób sercowo-naczyniowych i mukowiscydozy1-5. Układ ubikwityna-proteasom (UPS), który katalizuje selektywną degradację białek, jest nowym celem terapeutycznym dla tych schorzeń6-10. Ligazy ubikwityny kowalencyjnie przyłączają polimery 76-aminokwasu ubikwityny do białek11. Białka, które zostały oznaczone łańcuchami poliubikwityny, są rozpoznawane i proteolizowane przez proteasom12 ~2,5 megadaltonu 26S. Badania rozpoczęte na modelowym organizmie eukariotycznym Saccharomyces cerevisiae (pączkujące drożdże) miały fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia mechanizmów degradacji białek w komórkach eukariotycznych. Pierwszym zademonstrowanym fizjologicznym substratem UPS był drożdżowy represor transkrypcyjny MATα213,14, a wiele wysoce konserwatywnych składników UPS zostało po raz pierwszy zidentyfikowanych lub scharakteryzowanych w drożdżach (np. 15-26). Odkrycia dokonane w tym wszechstronnym i genetycznie podatnym organizmie modelowym prawdopodobnie nadal dostarczą ważnych informacji na temat konserwatywnych mechanizmów degradacji za pośrednictwem ubikwityny.

Rozpoznawanie i degradacja większości substratów UPS wymaga skoordynowanego działania wielu białek. Dlatego ważnym celem w scharakteryzowaniu regulowanej degradacji danego niestabilnego białka jest określenie wymagań genetycznych dla proteolizy. Klasyczne podejścia (np. eksperymenty z pościgiem impulsowym i cykloheksymidem27) do monitorowania degradacji białek w komórkach ssaków lub drożdży są pracochłonne i czasochłonne. Chociaż tego typu metodologie zapewniają bardzo czułe środki do wykrywania degradacji białek, nie nadają się do szybkiej analizy degradacji białek ani do badań przesiewowych na dużą skalę w kierunku mutacji, które zapobiegają degradacji białek. W tym miejscu przedstawiono test oparty na wzroście drożdży do szybkiej identyfikacji wymagań genetycznych dotyczących degradacji niestabilnych białek.

W metodzie analizy degradacji białek opartej na wzroście drożdży, niestabilne białko będące przedmiotem zainteresowania (lub sygnał degradacji) jest łączone w ramce z białkiem, które jest wymagane do wzrostu drożdży w określonych okolicznościach. Rezultatem jest sztuczny substrat, który może służyć jako potężne narzędzie do określania genetycznych wymagań degradacji niestabilnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Dla wygody, najczęściej stosowane szczepy drożdży laboratoryjnych zawierają panel mutacji w genach kodujących enzymy metaboliczne biorące udział w biosyntezie poszczególnych aminokwasów lub zasad azotowych (np. 20,28-30). Enzymy te są niezbędne do proliferacji komórkowej przy braku egzogennie dostarczanych metabolitów, w syntezie których enzymy uczestniczą. Takie enzymy metaboliczne mogą zatem funkcjonować jako reportery oparte na wzroście dla degradacji niestabilnych białek, z którymi są połączone. Genetyczne wymagania dotyczące degradacji białek można łatwo wyjaśnić, ponieważ mutacje, które zapobiegają proteolizie, pozwolą komórkom zawierającym reporter degradacji rosnąć w selektywnych warunkach.

Przewaga wzrostu jest pośrednią wskazówką, że dana mutacja zwiększa obfitość interesującego nas białka. Wymagana jest jednak bezpośrednia analiza biochemiczna, aby potwierdzić, że mutacja umożliwia wzrost poprzez zwiększony poziom białka, a nie poprzez przyczyny pośrednie lub sztuczne. Wpływ mutacji na obfitość białka może być potwierdzony przez analizę western blot poziomów białka w stanie stacjonarnym w komórkach, które są nosicielami danej mutacji i nie są jej nosicielami. Przedstawiono również metodę szybkiej i efektywnej ekstrakcji białek drożdży (sekwencyjna inkubacja komórek drożdży z wodorotlenkiem sodu i buforem próbki) w postaci nadającej się do analizy metodą western blot31. Łącznie eksperymenty te ułatwiają szybką identyfikację potencjalnych regulatorów degradacji białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Test wzrostu drożdży w celu identyfikacji potencjalnych mutantów wadliwych w degradacji białek

  1. Przekształć dzikie i zmutowane komórki drożdży za pomocą plazmidu kodującego niestabilne białko połączone w ramce z reporterowym enzymem metabolicznym.
  2. Zaszczepić transformanty w 5 ml syntetycznego zminimalizowanego podłoża zdefiniowanego (SD), które jest selektywne dla komórek zawierających cząsteczki plazmidu. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C, obracając się.
  3. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) każdej nocnej hodowli.
    UWAGA: Po całonocnej inkubacji komórki w hodowli mogą znajdować się w logarytmicznej lub stacjonarnej fazie wzrostu, ale powinny osiągnąć minimalny OD600 wynoszący 0,2. Bardzo wolno rosnące szczepy drożdży mogą wymagać inkubacji dłuższej niż jedna noc lub inokulacji większej liczby komórek, jak określono empirycznie.
  4. Przygotować sześciokrotne seryjne rozcieńczenia przekształconych komórek drożdży na sterylnej 96-dołkowej płytce, zaczynając od komórek rozcieńczonych do OD600 0,2. Umieść każdy transformator drożdżowy do oznaczenia w innym rzędzie na 96-dołkowej płytce.
    1. Dla każdego transformantu obliczyć objętość hodowli przez noc potrzebną do rozcieńczenia komórek do OD600 0,2 w końcowej objętości 200 μl. Dodać tę objętość hodowli przez noc do odpowiedniego dołka w kolumnie 1. Dodać odpowiednią ilość sterylnej wody, aby doprowadzić objętość do 200 μl.
    2. Na każdy rząd drożdży dodaj 125 μl sterylnej wody do studzienek w kolumnach 2, 3 i 4.
      UWAGA: Pojedynczo pakowane sterylne płytki 96-dołkowe mogą być pakowane ze sterylnymi pokrywkami. Pokrywki mogą być używane jako zbiorniki na sterylną wodę, która jest rozprowadzana na tym etapie. Pozwala to na jednoczesny transfer sterylnej wody do wszystkich studzienek w danej kolumnie za pomocą pipetora wielokanałowego.
    3. Wymieszać zawartość pierwszej kolumny (drożdże rozcieńczone do średnicy zewnętrznej600 0,2) pipetując w górę i w dół za pomocą pipetora wielokanałowego.
    4. Przenieść 25 μl drożdży z kolumny 1 do kolumny 2 za pomocą pipetora wielokanałowego. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Przenieść 25 μl z kolumny 2 do kolumny 3 i 25 μl z kolumny 3 do kolumny 4 (dobrze mieszając na każdym etapie).
  5. Wymieszać każdą próbkę za pomocą pipetora wielokanałowego. Przechodząc od najbardziej rozcieńczonych do najmniej rozcieńczonych kolumn drożdży, odpipetować 4 μl każdej próbki na dwie płytki zawierające odpowiednie selektywne podłoże. Użyj jednej płytki z pożywką, która utrzymuje selekcję plazmidu (ta płytka służy jako plamienie drożdży i kontrola wzrostu). Użyj drugiej płytki z pożywką, która wybiera utrzymanie plazmidu i ekspresję niestabilnego białka połączonego z enzymem reporterowym. Ponieważ drożdże szybko się osadzają, mieszaj komórki, pipetując w górę i w dół w regularnych odstępach czasu.
    UWAGA: Suche płytki łatwiej wchłaniają płyn niż świeżo przygotowane talerze i dlatego są zalecane do tych eksperymentów. Wilgotne płytki można suszyć przez inkubację w temperaturze pokojowej w niskiej wilgotności przez 1 – 2 dni lub krótsze inkubacje w okapie z przepływem laminarnym. Płyty mogą schnąć nierównomiernie, jeśli laminarny przepływ powietrza jest równoległy do stołu. Zastosowanie szablonu ułatwia dostrzeżenie komórek drożdży w regularnych odległościach. Na rysunku 1 przedstawiono dwa przykładowe szablony. Mogą one być wydrukowane, wycięte i przymocowane do wewnętrznej strony pokrywy szalki Petriego.
  6. Pozostaw talerze do wyschnięcia na blacie stołu.
  7. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2 – 6 dni.
  8. Sfotografować każdą płytkę po inkubacji.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Szablony do nakrapiania komórek drożdży na 100-milimetrowe płytki agarowe. Szablony te mogą być używane do ułatwienia wykrywania drożdży w regularnych odległościach za pomocą pipetora wielokanałowego. Szablony mogą być drukowane, wycinane i umieszczane po wewnętrznej stronie pokrywy szalki Petriego. Umieść szalkę Petriego z pożywką wzrostową wewnątrz pokrywki z przymocowanym szablonem. Szablony są oznaczone wycięciem do orientacji ścieżki. Zaleca się, aby płytki stosowane w testach wzrostu były podobnie oznaczone wycięciem w celu śledzenia orientacji. Dostarczane są szablony do wykrywania czterech (A) lub pięciu (B) seryjnych rozcieńczeń komórek drożdży. Kliknij tutaj, aby zobaczyć wersję do druku tego rysunku z szablonami 100 mm.

2. Biochemiczne potwierdzenie testu wzrostu drożdży

  1. Wzrost komórek drożdży i ekstrakcja białek po alkaliach (zmodyfikowana z 31)
    1. Przekształć dzikie i zmutowane komórki drożdży za pomocą plazmidu kodującego niestabilne białko.
    2. Zaszczepić transformanty w 5 ml pożywki SD, która jest selektywna dla komórek zawierających cząsteczki plazmidu. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C, obracając się.
    3. Zmierz OD600 w każdej nocnej kulturze.
      UWAGA: Po całonocnej inkubacji komórki mogą znajdować się w logarytmicznej lub stacjonarnej fazie wzrostu, ale powinny osiągnąć OD600, który pozwoli na rozcieńczenie do OD600 0,2 w 10 ml świeżej selektywnej pożywki (krok 2.1.4). Bardzo wolno rosnące szczepy drożdży mogą wymagać inkubacji dłuższej niż jedna noc lub inokulacji większej liczby komórek, jak określono empirycznie.
    4. Rozcieńczyć komórki drożdży do OD600 0,2 w 10 ml świeżej pożywki selektywnej.
    5. Kontynuować inkubację komórek w temperaturze 30 °C, obracając się lub wytrząsając, aż kultury osiągną OD600 między 0,8 a 1,2 (tj. znajdą się w średnim okresie wzrostu logarytmicznego).
      UWAGA: Jeśli niestabilne białko będące przedmiotem zainteresowania znajduje się pod kontrolą regulowanego promotora, optymalny czas indukcji ekspresji białka i zbioru komórek może się różnić w zależności od wcześniejszych badań lub obserwacji empirycznych.
    6. Zebrać 2,5 OD600 jednostek kultury w stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant przez pipetowanie lub aspirację.
      UWAGA: Jedna jednostka OD600 jest zdefiniowana jako ilość drożdży obecnych w 1 ml kultury przy OD600 1,0. Objętość kultury (w ml) wymagana do zebrania 2,5 OD600 jednostek (V) można określić za pomocą następującego równania: V = 2,5 OD600 jednostek / Zmierzona OD600
    7. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml wody destylowanej. Przenieś zawieszone komórki do probówki mikrowirówkowej.
    8. Komórki osadu przez odwirowanie przy 6 500 x g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant przez pipetowanie lub aspirację.
    9. Zawiesić komórki w 100 μl wody destylowanej, pipetując w górę i w dół lub wirując, i dodać 100 μl 0,2 M NaOH. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Próbki inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    10. Komórki osadkowe (z których większość nie uwolniła jeszcze białek i jest nadal żywotna) przez odwirowanie w sile 18 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant przez pipetowanie lub aspirację.
    11. Zawiesić osad w 50 – 100 μl 1x bufor próbki Laemmli, który spowoduje lizę komórek, poprzez pipetowanie w górę iw dół lub wirowanie.
      UWAGA: Usunięcie alkalicznego supernatantu po odwirowaniu, a następnie ponowne zawieszenie komórek w buforze próbki Laemmli powoduje ekstrakcję białek o pH zgodnym z elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE) przy użyciu systemu buforowego Tris-glicyna i western blot.
    12. Aby w pełni zdenaturować białka, inkubować lizaty w temperaturze 95 °C przez 5 min.
      UWAGA: Białka podatne na agregację (np. białka z kilkoma segmentami transbłonowymi) mogą stać się nierozpuszczalne podczas inkubacji w temperaturze 95 °C. W związku z tym lizaty powinny być inkubowane w niższych temperaturach (np. 37 °C – 70 °C) przez 10 – 30 minut, zgodnie z ustaleniami empirycznymi, w celu analizy takich białek.
    13. Schłodzić lizaty, umieszczając je na lodzie na 5 minut.
    14. Odwirować lizaty przy 18 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej do granulowania nierozpuszczalnego materiału. Oddzielić supernatant (rozpuszczone, wyekstrahowane białko) za pomocą SDS-PAGE przed kolejną analizą western blot (sekcja 2.2). Alternatywnie przechowywać lizaty w temperaturze -20 °C.
  2. Reprezentatywny protokół Western Blotting
    1. Załadować empirycznie wyznaczoną objętość lizatów do żelu SDS-PAGE.
    2. Uruchom żel pod napięciem 200 V, aż przód barwnika dotrze do dna żelu.
    3. Przenieść białka z żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) metodą transferu na mokro pod napięciem 20 V przez 60–90 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Zablokować błonę przez inkubację w 5% odtłuszczonym mleku w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS), kołysząc, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    5. Roztwór blokujący dekantację.
    6. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem specyficznym dla białka będącego przedmiotem zainteresowania (lub jego znacznikiem epitopu) w 1% odtłuszczonym mleku w TBS z 0,1% Tween-20 (TBS/T) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, kołysząc.
    7. Zdekantować roztwór przeciwciał i przemyć membranę 3 x 5 min TBS/T w temperaturze pokojowej, kołysząc.
    8. Inkubować błonę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem w 1% odtłuszczonym mleku w TBS/T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, kołysząc.
      UWAGA: Ponieważ fluorofory są wrażliwe na światło, rozcieńczenia przeciwciał sprzężonych z fluoroforem należy przygotowywać w ciemności. Dodatkowo inkubacja błon w obecności przeciwciał sprzężonych z fluoroforem powinna odbywać się w pojemnikach odpornych na światło. Można to osiągnąć, owijając tace inkubacyjne folią aluminiową.
    9. Zdekantować roztwór przeciwciał i przemyć membranę 3 x 5 min TBS/T w temperaturze pokojowej, kołysząc.
    10. Obraz membrany należy wykonać za pomocą oprogramowania Li-Cor Odyssey CLx i Image Studio (lub porównywalnego sprzętu i oprogramowania do obrazowania), zgodnie z zaleceniami producenta.
    11. Po zobrazowaniu błony inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem specyficznym dla białka kontrolnego obciążenia w 1% odtłuszczonym mleku w TBS / T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, kołysząc.
    12. Zdekantować roztwór przeciwciał i przemyć membranę 3 x 5 min TBS/T w temperaturze pokojowej, kołysząc.
    13. Inkubować błonę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem w 1% odtłuszczonym mleku w TBS/T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, kołysząc.
    14. Zdekantować roztwór przeciwciał i przemyć membranę 3 x 5 min TBS/T w temperaturze pokojowej, kołysząc.
    15. Obraz membrany należy wykonać za pomocą oprogramowania Li-Cor Odyssey CLx i Image Studio (lub porównywalnego sprzętu i oprogramowania do obrazowania), zgodnie z zaleceniami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować tę metodologię, enzym His3 został połączony z karboksylowym końcem substratu degradacji związanej z retikulum endoplazmatycznego (ER) (ERAD), Deg1-Sec62 (Rysunek 2A), aby utworzyć Deg1-Sec62-His3 (Rysunek 3). Deg1-Sec62 jest członkiem-założycielem nowej klasy substratów ERAD, które są celem w wyniku trwałego, nieprawidłowego związku z translokonem, kanałem odpowiedzialnym przede wszystkim za przemieszczanie białek przez błonę ER32-34...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona metodologia pozwala na szybkie określenie i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek w komórkach drożdży. Eksperymenty te podkreślają użyteczność i moc drożdży jako modelowego organizmu eukariotycznego (kilka doskonałych przeglądów biologii drożdży i kompilacji protokołów obchodzenia się, przechowywania i manipulowania komórkami drożdży (np. 41-44) jest dostępnych dla badaczy nowych w organizmie). Techniki te mogą być z łatwością stosowane do badania ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy obecnym i byłym członkom laboratorium Rubensteina za zapewnienie wspierającego i entuzjastycznego środowiska badawczego. Dziękujemy Ryanowi T. Gibsonowi za pomoc w optymalizacji protokołu. Dziękujemy Markowi Hochstrasserowi (Uniwersytet Yale) i Dieterowi Wolfowi (Universität Stuttgart) za szczepy drożdży i plazmidy. Dziękujemy naszym anonimowym recenzentom za pomoc w poprawie przejrzystości i użyteczności tego manuskryptu. Praca ta została wsparta nagrodą badawczą przyznaną przez oddział Sigma Xi na rzecz SGW na Uniwersytecie Stanowym Ball, grant National Institutes of Health (R15 GM111713) dla E.M.R., nagrodę badawczą ASPiRE Uniwersytetu Stanowego Ball dla E.M.R. oraz fundusze z Biura Rektora i Wydziału Biologii Uniwersytetu Stanowego Ball.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożądane szczepy drożdży, plazmidy, pożywka wzorcowa i składnikiSzczepy drożdży z pożądanymi mutacjami mogą być generowane w laboratorium badacza. Drożdże typu dzikiego i różne mutanty są również dostępne na rynku (np. firmy GE Healthcare). Plazmidy kodujące białka fuzyjne mogą być generowane w laboratorium badacza.
3-amino-1H-1,2,4-triazolFisher ScientificAC264571000Kompetycyjny inhibitor enzymu His3. Może być włączony do pożywki w celu zwiększenia rygorystyczności testu wzrostu przy użyciu konstruktów reporterowych His3.
Endoglikozydaza H (forma rekombinowana z Streptomyces plicatus)Roche11088726001Może być stosowana do oceny N-glikozylacji białek; zgodna ze stężeniami SDS i beta-merkaptoetanolu znajdującymi się w 1x buforze próbki Laemmli.
Jednorazowe probówki ze szkła borokrzemianowegoFisher Scientific14-961-32Dostępne u różnych producentów
Inkubator z regulacją temperatury (np. Inkubator Heratherm model IMH180)Dot Scientific51028068Dostępne u różnych producentów
New Brunswick Wymienny bęben do rur 18 mm (rolka rurowa)New BrunswickM1053-0450Wałek rurowy jest zalecany do utrzymywania przez noc kultur starterowych drożdży komórek drożdży w zawiesinie. Wytrząsarka platformowa lub rolka rurowa mogą być używane do utrzymywania większych kultur w zawiesinie.
New Brunswick TC-7 Bęben rolkowy 120V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004Do użytku z wałkiem rurowym
SmartSpec Plus SpektrofotometrBio-Rad170-2525Dostępne u różnych producentów
Sterylne 96-dołkowe płytki mikrotestowe z płaskim dnem z pokrywką pakowaną pojedynczoSarstedt82.1581.001Dostępne u różnych producentów
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & mu; lGilsonF14401Dostępne od różnych producentów
 
 
 

 
[nagłówek]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μ lGilsonF14403Pipetatory jednokanałowe i wielokanałowe są używane na różnych etapach protokołu. Podczas gdy pipety wielokanałowe zmniejszają obciążenie pipetowania na kilku etapach, pipety jednokanałowe mogą być używane w całym protokole. Dostępne od różnych producentów.
Wirówka 5430Eppendorf5427 000.216Rotor sprzedawany z urządzeniem zawiera probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 i 2,0 ml. Rotor można zamienić na taki, który mieści stożkowe probówki o pojemności 15 ml i 50 ml.
System obrazowania płytek (np. Gel Doc XR+ System)Bio-Rad170-8195Do obrazowania płytek można stosować różne systemy, w tym zaawansowane systemy obrazowania, skanery komputerowe i telefony z aparatem fotograficznym.
Rotor kątowy F-35-6-30 z pokrywą i adapterami do wirówki model 5430/R, 15/50 ml probówki stożkowe, 6-miejscoweEppendorfF-35-6-30
15 ml rurka z sitodrukiem 17 x 20 mm stożkowa, polipropylenowaSarstedt62.554.205Dostępne u różnych producentów
Elastyczna probówka 1,5 ml, PCR czysta, Naturalne probówki do mikrowirówekEppendorf22364120Dostępne w różnych rozmiarach producenci
Analogowy podgrzewacz Dri-BathFisher Scientific1172011AQWrząca łaźnia wodna z płytą grzejną może być również używana do denaturacji białek
SDS-PAGE i aparatury transferowej, zasilaczy i sprzętu do obrazowania lub ciemni dla SDS-PAGE i transferu do membranyBędzie się różnić w zależności od laboratorium i aplikacji
System obrazowania Western blot (np. skaner Li-Cor Odyssey CLx i oprogramowanie Image Studio)Li-Cor9140-01Różni się w zależności od laboratorium i zastosowania
Membrany transferowe EMD Millipore Immobilon PVDFIPFL00010 Fisher ScientificBędzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania
Przeciwciała pierwszorzędowe (np. Kinaza fosfoglicerynianowa (Pgk1) Przeciwciało monoklonalne, mysz (klon 22C5D8))LifeTechnologies459250Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania
Przeciwciała drugorzędowe (np. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))Life TechnologiesA-21065Będzie się różnić w zależności od laboratorium i zastosowania
buforowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11(2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093(2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791(2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test wzrostu dro d ybia ko fuzyjnepod o e selekcyjneekstrakcja bia kaanaliza Western blotrozcie czenia seryjneligaza ubikwitynybia ko niestabilne

Powiązane artykuły