Ilościowe profilowanie spektrometryczne mas proteomów komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych

Podsumowanie

Dogłębne analizy proteomów komórek nowotworowych ułatwiają identyfikację nowych celów leków i biomarkerów diagnostycznych. Opisujemy eksperymentalny przepływ pracy do analizy ilościowej (fosfo-)proteomów w subpopulacjach komórek nowotworowych pochodzących z guzów płynnych i litych. Osiąga się to poprzez połączenie strategii wzbogacania komórek z ilościową spektrometrią mas opartą na Super-SILAC.

Streszczenie

Dogłębne analizy proteomów komórek nowotworowych są potrzebne do wyjaśnienia onkogennych patomechanizmów, a także do identyfikacji potencjalnych celów leków i biomarkerów diagnostycznych. Jednak w dużej mierze brakuje metod ilościowej charakterystyki proteomicznej nowotworów pochodzących od pacjentów, a w szczególności ich subpopulacji komórkowych. W tym miejscu opisujemy konfigurację eksperymentalną, która umożliwia analizę ilościową proteomów subpopulacji komórek rakowych pochodzących z guzów płynnych lub litych. Osiąga się to poprzez połączenie strategii wzbogacania komórek z ilościową spektrometrią mas opartą na Super-SILAC, a następnie analizą danych bioinformatycznych. Aby wzbogacić określone podzbiory komórkowe, płynne guzy są najpierw immunofenotypowane za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie sortowania FACS; W przypadku guzów litych mikrodysekcja wychwytu laserowego jest stosowana do oczyszczania określonych subpopulacji komórkowych. W drugim etapie białka są ekstrahowane z oczyszczonych komórek, a następnie łączone ze specyficznym dla nowotworu, znakowanym SILAC wzorcem kolca, który umożliwia kwantyfikację białka. Otrzymana mieszanina białek jest poddawana elektroforezie żelowej lub przygotowaniu próbki wspomaganej filtrem (FASP), a następnie trawieniu tryptycznym. Na koniec peptydy tryptyczne są analizowane za pomocą hybrydowego spektrometru mas kwadrupolowo-orbitrapowego, a uzyskane dane są przetwarzane za pomocą pakietów oprogramowania bioinformatycznego, w tym MaxQuant. Za pomocą przedstawionego tutaj przepływu pracy można zidentyfikować i określić ilościowo do 8 000 białek w próbkach pobranych od pacjentów, a uzyskane profile ekspresji białek można porównać między pacjentami w celu zidentyfikowania diagnostycznych sygnatur proteomicznych lub potencjalnych celów leków.

Wprowadzenie

Proteomika oparta na spektrometrii mas pojawiła się i jest obecnie powszechnie stosowaną dyscypliną w biologii komórki i translacyjnych badaniach biomedycznych. Postęp techniczny w tej dziedzinie umożliwił badanie złożonych procesów komórkowych w liniach komórkowych i modelach zwierzęcych, ponieważ w jednym eksperymencie spektrometrii mas można zidentyfikować tysiące białek^1,2. Podobny postęp poczyniono w przypadku analizy wielu modyfikacji potranslacyjnych, takich jak fosforylacja czy ubikwitynacja, chociaż zwykle wymaga to dostosowanych do potrzeb przepływów pracy w celu wzbogacenia i analizy danych dla każdego rodzaju modyfikacji^2,3. Co więcej, zastosowanie strategii znakowania chemicznego i metabolicznego, w tym SILAC, umożliwia dokładną względną kwantyfikację białek i PTM, co czyni tę metodę szczególnie atrakcyjną dla odkrywania podstawowych procesów komórkowych, biomarkerów diagnostycznych i potencjalnych celów leków w nowotworach u ludzi⁴.

Jednakże, kilka wyzwań musi zostać pokonanych w odniesieniu do analizy proteomicznej pierwotnych nowotworów człowieka⁵. Przede wszystkim próbki nowotworów u ludzi często wykazują wysoki stopień niejednorodności komórkowej, który wynika z obecności różnych typów komórek należących do mikrośrodowiska guza, w tym komórek odpornościowych i fibroblastów. Po drugie, ewolucja klonalna prowadzi do różnorodności genetycznej w obrębie samych nowotworów, co skutkuje istnieniem kilku subpopulacji komórkowych o odrębnych właściwościach funkcjonalnych. Zgodnie z obecną koncepcją, zgodnie z którą kilka nowotworowych komórek macierzystych jest siłą napędową rozwoju i progresji raka, oczekuje się, że analiza proteomiczna takich (funkcjonalnie wysoce istotnych) subpopulacji komórkowych będzie miała zasadnicze znaczenie dla lepszego zrozumienia mechanizmów onkogennych istotnych dla zastosowania klinicznego⁶. Po trzecie, ilościowe profile ekspresji białek w dużych zestawach próbek są często wymagane do identyfikacji solidnych biomarkerów klinicznych; Nie można tego osiągnąć za pomocą znakowania chemicznego, takiego jak iTRAQ⁷, podczas gdy strategie znakowania metabolicznego – opierające się na proliferacji komórkowej⁴ – są również nieprzydatne. Po czwarte, większość dostępnych próbek guzów litych jest utrwalona formaliną, co komplikuje analizę proteomu metodą spektrometrii mas ze względu na tworzenie się wiązań krzyżowych białek⁸. Wreszcie, większość istniejących przepływów pracy związanych z proteomiką wymaga znacznych ilości przetwarzania próbek i pozyskiwania danych, co utrudnia analizę liczby próbek istotnych dla badań klinicznych i wymaga nowych paradygmatów przepływu pracy^9,10.

Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy eksperymentalną konfigurację, która łączy sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej¹¹ lub mikrodysekcję^{laserową 12,13} w celu wzbogacenia komórek ze strategią Super-SILAC¹⁴ w celu wprowadzenia globalnego wewnętrznego standardu dla kompleksowej analizy spektrometrii mas. Korzystając z opisanej tutaj metody, możliwe jest ilościowe oznaczenie do 8 000 białek w pojedynczych próbkach ludzkich guzów pochodzących z nowotworów płynnych lub stałych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na ludzkich tkankach lub próbkach krwi muszą być zatwierdzone przez komisję etyki i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi podanymi w głosowaniu etycznym.

1. Wzbogacanie komórkowe

1. Płynne guzy/Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją.
   1. Wyizolować komórki jednojądrzaste ze szpiku kostnego lub próbki krwi, wykonując lizę erytrocytów przy użyciu chlorku amonu lub wirując w gradiacji gęstości Ficoll.
      1. W celu lizy erytrocytów połączyć 1 ml próbki z 4 ml roztworu chlorku amonu. Inkubować roztwór na lodzie przez 5 - 10 minut. Dodać 40 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) + 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i wirować przez 5 minut w temperaturze 400 x g i 4 °C.
      2. W przypadku wirowania gradientowego Ficoll należy nałożyć 10 ml próbki na 15 ml Ficoll-Hypaque, aby utworzyć 2 odrębne warstwy (należy uważać, aby nie naruszyć warstw). Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (15 - 25 °C) ostrożnie i zebrać komórki jednojądrzaste, które zbierają się w interfazie.
      3. Zakręć ogniwami i zbierz je w PBS + 2% FCS. Wirować przy 400 x g przez 5 minut i wchłonąć do 1 ml PBS + 2% FCS. Przyjąć jedną podwielokrotność jako kontrolę ujemną i jedną podwielokrotność dla każdego barwnika fluorescencyjnego użytego w barwieniu końcowym.
   2. Inkubować z przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie, przydatnymi do izolowania populacji komórek białaczkowych w rozcieńczeniu zgodnie z instrukcjami producenta na lodzie przez 30 minut. Podwielokrotności używane do kompensacji należy również zabarwić indywidualnie każdym przeciwciałem. Umyć dwukrotnie PBS + 2% FCS.
      UWAGA: Użyte przeciwciała były mysie przeciwciała przeciwko człowiekowi przeciwko CD117-PE (klon 95C3), CD34-FITC (klon 8G12) i CD33-PE (klon P67.6).
   3. Filtruj komórki przez sitko o średnicy 35 μm, najlepiej za pomocą probówek z sitkiem komórkowym zintegrowanym w nasadce.
   4. Dodaj barwienie żywotności komórek (np. 7-AAD). Posortuj komórki za pomocą odpowiedniego sortera komórek¹¹ (Rysunek 2). Zbierz komórki w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco (IMDM) Iscove'a zawierającej 10% FCS.
2. Guzy lite/Mikrodysekcja wychwytu laserowego.
   1. Do opisanych eksperymentów wykorzystano próbki FFPE z wycinka raka płuca. W tym celu tkankę raka płuc natychmiast po resekcji chirurgicznej utrwalono w 4% buforowanej formalinie, a następnie zatopiono w parafinie w celu dalszej analizy.
   2. Wyciąć odcinki o grubości 5 - 10 μm z próbki zatopionej w parafinie (FFPE) utrwalonej w formalinie za pomocą mikrotomu. Zamontuj sekcje na pokrytych folią szkiełkach membranowych i susz w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Odparafinować i ponownie uwodnić zamontowane sekcje przez kolejną inkubację w ksylenie, absolutnym etanolu, 70% i wodzie, każda przez 1 minutę.
   3. Barwić skrawki hematoksyliną przez 20 sekund, a następnie spłukać wodą z kranu. Zbierz interesującą populację komórek za pomocą systemu mikrodysekcji z wychwytem laserowym (patrz również ¹²).

2. Ekstrakcja białka

1. Płynne guzy.
   1. Odwirować zawiesinę komórkową z etapu 1.1.5 w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 4 minuty i odrzucić supernatant. Przemyć dwukrotnie 500 μl zimnego PBS i odwirować przez 5 minut w temperaturze 400 x g i 4 °C
   2. Dodać 40 μl buforu do lizy na^10-6 komórek i inkubować przez 15 minut na lodzie (10-5 komórek (ok. 10 μg białka całkowitego) powinno być minimalną liczbą komórek). Odwirować lizat w temperaturze 14 000 x g, w temperaturze 4°C przez 10 minut i przenieść supernatant (oczyszczony lizat komórkowy) do nowej probówki reakcyjnej. Wyrzuć granulkę.
2. Guzy lite.
   1. Dodać 60 μl buforu do lizy tkanek do mikrowypreparowanej tkanki i inkubować przez 15 minut na lodzie, zebrać płyn przez krótkie odwirowanie i przenieść zawiesinę do nowej probówki reakcyjnej. Sonikować lizat na lodzie przez 3 minuty.
   2. Dodać 15 μl 20% dodecylosiarczanu sodu (SDS), aby osiągnąć końcowe stężenie SDS 4%. Mikrowypreparowaną tkankę inkubować w temperaturze 99 °C w bloku grzewczym przez 1 godzinę i mieszać z prędkością 600 obr./min. Odwirować lizat w temperaturze 16 000 x g, 18 °C przez 10 minut i przenieść supernatant do nowej probówki.

3. Ustanowienie standardu kwantyfikacji skoków SILAC (standard Super-SILAC)

UWAGA: Standard kwantyfikacji składa się z mieszanki białek znakowanych SILAC, pochodzących z 4 - 6 linii komórek, które pasują do typu nowotworu będącego przedmiotem zainteresowania. Aby osiągnąć maksymalne nakładanie się proteomu referencyjnego znakowanego SILAC i proteomu pochodzącego z nowotworu, należy przeprowadzić analizę głównych składowych przed wybraniem linii komórkowych do wzorca kwantyfikacji¹⁴.

1. Analiza głównych składowych (PCA).
   1. Aby określić wzorce ekspresji białek w liniach komórkowych, hoduj około dziesięciu różnych linii komórkowych w odpowiednich pożywkach do hodowli komórkowych. Poddać komórki lizie zgodnie z opisem w kroku 2.1. Przygotować lizaty komórkowe do spektrometrii mas zgodnie z opisem w kroku 6.1.
   2. Przeanalizuj wzorzec ekspresji białek w każdej linii komórkowej na spektrometrze masowym sprzężonym z chromatografią cieczową o wysokiej rozdzielczości (nanoLC-MS/MS).
   3. Przeanalizuj wynikowe dane surowe za pomocą bezpłatnego oprogramowania MaxQuant i przeprowadź analizę składowych głównych za pomocą powiązanego oprogramowania, takiego jak Perseus^16,17.
   4. Wybierz 4 - 6 linii komórkowych, które wykazują największą różnorodność między profilami ekspresji białek i użyj ich do wygenerowania standardu Super-SILAC spike-in.
2. Etykietowanie SILAC i kontrola etykiet.
   1. Hodować wybrane linie komórkowe przez co najmniej pięć cykli komórkowych w odpowiednim pożywce do hodowli komórkowych SILAC, w której arginina i lizyna są znakowane stabilnymi izotopami węgla i azotu (pożywka SILAC)⁴.
   2. Poddać komórki lizie zgodnie z opisem w kroku 3.1 i przygotować lizaty komórkowe do spektrometrii mas zgodnie z opisem w kroku 6.1. Zmierz efektywność inkorporacji etykietowania SILAC za pomocą nanoLC-MS/MS. Przeanalizuj wynikowe surowe dane MS za pomocą MaxQuant i określ wydajność znakowania SILAC. Osiąga się to poprzez zliczenie liczby peptydów zidentyfikowanych w ich znakowanej (ciężkiej) i endogennej formie (lekkiej) oraz obliczenie stosunku (ciężkie)/(ciężkie+lekkie). Skuteczność etykietowania powinna przekraczać 98%.
3. Połączenie proteomów SILAC i walidacja.
   1. Hoduj i rozwijaj wybrane linie komórkowe zgodnie z instrukcjami producenta w odpowiednim podłożu SILAC. Poddać komórki lizie zgodnie z opisem w kroku 2.1 w przypadku guzów płynnych lub zgodnie z opisem w kroku 3.2 w przypadku guzów litych i określić stężenie białka dla każdego lizatu komórkowego.
   2. Wymieszać równomolowe ilości białka z każdej linii komórkowej i podzielić mieszaninę na podwielokrotności. Zamrozić porcje i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu pomiaru. Do jednego eksperymentu potrzeba 20 - 50 μg wzorca Super-SILAC. Należy uważać, aby przygotować normę w nadmiarze, ponieważ należy unikać zmiany normy w serii eksperymentów.

4. Pomiar stężenia białka i skoku

1. Płynne guzy.
   1. Za pomocą testu ilościowego białka należy określić stężenia białek w odpowiednich lizatach komórkowych i wzorcu Super-SILAC.
   2. Wymieszać równe ilości oczyszczonego lizatu komórkowego i wzorca Super-SILAC, a następnie dodać bufor dodecylosiarczanu litu (LDS) (25% objętości próbki) i środek redukujący (10% objętości próbki).
   3. Otrzymany roztwór podgrzewać w bloku grzewczym w temperaturze 72 °C przez 10 minut. Opcjonalnie przechowywać powstałe zdenaturowane białka w temperaturze -80°C.
2. Guzy lite.
   1. W celu pomiaru stężenia białka na czytniku płytkowym należy zmieszać serię roztworów do rozcieńczania albuminy surowicy bydlęcej (BSA), lizat i odpowiedni wzorzec Super-SILAC z dostępnym w handlu testem białkowym na 96-dołkowej płytce i wstrząsać przez 1 minutę, inkubować przez wskazany czas i mierzyć absorbancję zgodnie ze wskazaniami producenta.
      UWAGA: Wysokie stężenie SDS i ditiotreitolu (DTT) w lizacie stanowi problem dla większości dostępnych testów do oznaczania stężenia białka.
   2. Zmieszać równe ilości oczyszczonego lizatu i wzorca Super-SILAC z 200 μl mocznika w jednostce filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 30 minut w temperaturze 20 °C. Nie należy stosować więcej niż 50 μl oczyszczonego lizatu i wzorca Super-SILAC. Unikać temperatur poniżej 15 °C, aby mocznik nie uległ krystalizacji.

5. Separacja próbek i trawienie białka

1. Płynne guzy.
   1. Oddziel 30 - 100 μg białka całkowitego na linię na żelu SDS-PAGE o nachyleniu 4 - 12%. Zabarwić białka za pomocą Coomassie Blue O/N. Usuń nadmiar plamy Coomassie przez dwa kolejne mycia wodą.
   2. Odetnij każdą pasję z żelu i podziel ją na 23 równej wielkości plastry, niezależnie od wzoru barwienia żelu. Plastry żelu należy rozpatrywać oddzielnie, każdy w fiolce polipropylenowej o pojemności 0,6 ml.
   3. Umyć plastry żelu wodą i metanolem/wodą (50:50, v/v), zredukować za pomocą 10 mM DTT, inkubując przez 30 minut w temperaturze 56 °C. Alkilować plastry żelu 55 mM jodoacetamidem (IAA) przez inkubację w ciągu 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
   4. Pomiędzy etapami obchodzenia się z próbką należy myć plastry acetonitrylem przez 15 minut i suszyć w odkurzaczu SpeedVac, aby usunąć nadmiar rozpuszczalnika i poprawić wchłanianie roztworu odczynnika.
   5. Rozszczepienie proteazy należy przeprowadzić poprzez ponowne nawodnienie wysuszonych plastrów żelu minimalną ilością roztworu trypsyny świńskiej (12,5 ng/μl w 0,025 M wodnym roztworze wodorowęglanu amonu) przez 16 godzin w temperaturze 37°C.
   6. Dodać 10 μl wody do plastra żelu i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 80 μl acetonitrylu i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Wirować przy 15 800 x g przez 1 min. Zebrać supernatant i przechowywać w oddzielnej probówce o pojemności 0,6 ml.
   7. Dodać 65 μl 5% roztworu kwasu mrówkowego, odwirować i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 65 μl acetonitrylu i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Odwirować przy 15 800 x g przez 1 min. Zebrać supernatant i dodać go do supernatantu z poprzedniego etapu. Odparować połączony supernatant do sucha w koncentratorze próżniowym.
2. Guzy lite.
   1. Aby usunąć SDS z lizatu tkankowego, należy użyć następującego protokołu FASP, opisanego również jako w odnośniku¹⁵.
   2. Po pierwszym odwirowaniu opisanym w kroku 5.2.3 dodać kolejne 200 μl 8 M mocznika na filtr i dalej wirować przy 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C. Odrzucić przepływowy filtrat.
   3. Dodać 100 μl IAA i mieszać w termomikserze z prędkością 600 obr./min przez 1 min. Inkubować filtr przez 20 minut w temperaturze 20 °C w ciemności. Odwirować filtr przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C.
   4. Dodać 100 μl mocznika do filtra i odwirować przy 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 20 °C. Powtórz ten krok jeszcze raz.
   5. Dodać 100 μl NH₄HCO₃ do filtra i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Powtórz ten krok dwukrotnie.
   6. Dodać 40 μl NH₄HCO₃ + 1 μl (= 0,4 μg) trypsyny i wymieszać w termomikserze w temperaturze 20 °C przez 600 obr./min, 1 min. Inkubować filtr O/N w mokrej komorze w temperaturze 37 °C. Przenieść filtr do nowych probówek zbiorczych.
   7. Odwirować filtr przy 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Dodać 50 μl NH₄HCO₃ i odwirować filtr przy 14 000 g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Powstałe peptydy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu pomiaru spektrometrii mas.
   8. W celu pomiaru stężenia peptydów należy dozować 50 μl powstałego przepływu i serię odpowiednich rozcieńczeń czystego tryptofanu do 96-dołkowej płytki. Zmierz fluorescencję tryptofanu. Przelicz wynikowe stężenie tryptofanu na stężenie peptydu, ponieważ 0,1 μg tryptofanu odpowiada 9 μg białka.

6. Chromatografia cieczowa i analiza spektrometryczna mas

1. Ponownie rozpuść peptydy w 30 μl buforu ładującego przez 5 minut w kąpieli sonizacyjnej. Wirować w wirówce przy 15 800 x g przez 1 minutę i odpipetować klarowny roztwór do fiolki z automatycznym samplerem próbek MS.
2. Wstrzyknąć 5 μl próbki na analizę za pomocą automatycznego podajnika próbek systemu nanoLC-MS/MS. Zagęścić i odsolić peptydy online na kolumnie wstępnej C18 z odwróconą fazą (0,15 mm ID x 20 mm z materiałem C18 o wielkości porów 5 μm) zamontowanej w układzie kolumny wentylowanej lub konfiguracji przełączającej przed kolumną.
3. Oddziel peptydy na mikrokolumnie C18 z odwróconą fazą (0,075 mm ID x 200 mm samopakowane materiałem C18 o wielkości porów 3 μm lub mniejszej w samopakującej się kolumnie nanorozpylającej, takiej jak PicoFrit, używając 90-minutowego gradientu 5>35% acetonitrylu w porównaniu z 0,1% wodnym kwasem mrówkowym przy 300 nl/min. Przenieś eluent do hybrydowego spektrometru mas kwadrupol/orbitrap za pomocą źródła jonów w sprayu.
4. Analiza peptydów przy użyciu metody akwizycji zależnej od danych Top15 (zakres MS m/z 350 - 1600, docelowa rozdzielczość 70 000 FWHM, tarcza AGC 1 x 10⁶, maksymalny czas napełniania 60 ms. Masa początkowa MS/MS 100, docelowa rozdzielczość 17.500 FWHM, tarcza AGC 2 x 10⁵, maksymalny czas napełniania 60 ms. Próg MS/MS 3 x 10⁴, obejmują stany naładowania 2 - 5, znormalizowaną energię zderzenia NCE 25%, wykluczenie dynamiczne 15 sekund).

7. Analiza danych

1. Do analizy danych należy użyć ogólnodostępnego oprogramowania MaxQuant¹⁶. Szczegółowy protokół analizy danych bioinformatycznych opisano w^16,17. Na potrzeby analizy połącz pliki danych pierwotnych ze wszystkich wycinków z toru SDS-PAGE w jeden eksperyment¹⁷.

Wyniki

Profilowanie proteomiczne płynnych i litych guzów od pacjentów jest obiecującym podejściem do odkrywania nowych biomarkerów diagnostycznych i predykcyjnych. Jednak procedura przygotowania próbki i analiza spektrometrii mas są trudne ze względu na złożoność próbek i potrzebę dokładnej kwantyfikacji białek w dużych zestawach próbek. Opisana powyżej procedura eksperymentalna rozpoczyna się od izolacji komórek będących przedmiotem zainteresowania, albo przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, albo przez mikrodysekcję laserową.

W tym celu, komórki z aspiratów szpiku kostnego pochodzących od pacjenta lub próbek krwi są barwione przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie przeciwko określonym markerom powierzchniowym przed sortowaniem i lizą komórek na podstawie FACS.

Aby wzbogacić podzbiory komórkowe z wycinków tkanek, najpierw muszą one zostać zamontowane na odpowiednich szkiełkach, aby umożliwić laserowe mikrodysekcja. W tym celu należy zamontować skrawki tkanek na odpowiednich szkiełkach membranowych i użyć mikrodyparownika laserowego zgodnie z instrukcjami producenta. Wybór interesujących nas obszarów i komórek wymaga odpowiedniej wiedzy na temat histomorfologii tkanki zdrowej i nowotworowej. Wyekstrahowane komórki są następnie przenoszone do odpowiedniej probówki zbiorczej. Należy przeprowadzić wstępne doświadczenia w celu określenia ilości tkanki niezbędnej do ekstrakcji wystarczającej ilości białka (minimum 10 μg białka całkowitego) dla każdej nowej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Każda mikrowypreparowana próbka jest traktowana 60 μl buforu do lizy tkanek. Aby uzyskać efektywną lizę, komórki z próbek tkanek muszą być sonikowane przez 3 minuty, a po dodaniu 15 μl próbek SDS są inkubowane w termomikserze w temperaturze 99 °C przez 1 godzinę w celu usunięcia wiązań krzyżowych białkowych wywołanych formaliną. Wirowanie ostatecznie ułatwi zbieranie oczyszczonego lizatu komórkowego.

Dla każdej choroby będącej przedmiotem zainteresowania (guzy płynne i lite) musi zostać ustalony odpowiedni standard kwantyfikacji Super-SILAC¹⁴. Odpowiedni wzorzec powinien reprezentować ponad 90% białek wyrażonych w próbkach będących przedmiotem zainteresowania. W celu przygotowania wzorca kwantyfikacji, linie komórkowe związane z typem nowotworu będącym przedmiotem zainteresowania należy najpierw przeanalizować za pomocą spektrometrii mas w celu określenia ich profili ekspresji białek, a następnie przeprowadzić analizę głównych składników. Należy wybrać 4 - 6 różnych linii komórkowych z różnymi wzorcami ekspresji białek i znakować SILAC "ciężką" argininą i lizyną. Skuteczność etykietowania powinna być sprawdzana za pomocą nanoLC-MS/MS i powinna być większa niż 98%. Następnie linie komórkowe powinny być poddawane lizie w taki sam sposób, jak odpowiednia próbka pobrana od pacjenta, a następnie równomolowe ilości białka w każdej próbce i wzorzec kolca SILAC powinny zostać wymieszane. Kluczowym krokiem dla dokładnej kwantyfikacji białek w próbkach klinicznych będących przedmiotem zainteresowania jest dokładne wymieszanie równomolowych ilości białka w próbkach pobranych od pacjenta i wzorcu kwantyfikacji SILAC ze skokowym skokiem. Aby określić stężenie białek w lizatach pochodzących z posortowanych komórek, można zastosować różne testy ilościowe białek. W przypadku lizatów komórkowych z komórek pochodzących z tkanek potrzebny jest test, który może poradzić sobie z wysokimi stężeniami SDS i DTT w lizacie. Stężenia białek w próbkach pobranych od pacjenta oraz wzorzec SILAC powinny być mierzone każdorazowo przed połączeniem z odpowiednimi próbkami klinicznymi w celu zapewnienia prawidłowej mieszanki, co ma kluczowe znaczenie dla porównywalności nawet setek próbek.

Po zmieszaniu równych ilości wzorca i lizatu, próbki uzyskane z płynnych guzów są mieszane z LDS, podgrzewane w termomikserze w temperaturze 72 °C przez 10 minut, a następnie poddawane trawieniu 1D-PAGE i w żelu oddzielonych białek za pomocą trypsyny. Próbki uzyskane z tkanek są uwalniane od SDS i trawione trypsyną przy użyciu metody FASP ustalonej przez Wiśniewskiego i wsp.¹⁵

Otrzymane peptydy tryptyczne można określić ilościowo, mierząc fluorescencję tryptofanu, co jest szczególnie interesujące dla próbek tkanek, ponieważ ilość peptydów uwalnianych z filtra różni się od 15% do 75% w porównaniu do ilości białka początkowo załadowanego do filtra. W tym celu mierzymy fluorescencję tryptofanu. Porównanie z odpowiednią serią rozcieńczeń tryptofanu pozwala na ilościowe określenie peptydów, ponieważ 1,1 μg tryptofanu odpowiada około 100 μg peptydu. W razie potrzeby próbki pochodzące głównie z przetwarzania FASP mogą być wstępnie oczyszczone na komercyjnych lub domowych końcówkach stolikowych wypełnionych materiałem o odwróconej fazie C18 (RP-C18) przed załadowaniem do systemu nanoLC/MS/MS¹⁸.

Analiza spektrometryczna mas jest wykonywana na systemie spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości i wysokiej czułości. Krótko mówiąc, próbki peptydów są odsalane i wstępnie zagęszczane na kolumnie wstępnej RP-C18, a następnie rozdzielane na kolumnie analitycznej RP-C18 sprzężonej bezpośrednio ze spektrometrem mas. Aby osiągnąć wystarczającą głębokość analizy, stosujemy kombinację prefrakcjonowania białek SDS-PAGE z 40-minutowymi gradientami RP-C18 (dla guzów płynnych) lub pojedyncze iniekcje z długimi 2-3 godzinnymi gradientami RP-C18 (dla guzów litych przetwarzanych przez FASP). Widma MS są pozyskiwane w rozdzielczości 70 000 FWHM lub lepszej, aby umożliwić dokładną kwantyfikację par SILAC poprzez integrację chromatograficznych profili pików. Do identyfikacji białek stosuje się metodę akwizycji zależnej od danych Top15 w celu wygenerowania dużej liczby widm peptydów MS / MS do identyfikacji peptydów i białek.

Na podstawie uzyskanych surowych danych, identyfikacja i kwantyfikacja białek są osiągane poprzez przeszukiwanie bazy danych za pomocą oprogramowania MaxQuant w bazie danych sekwencji Human Complete Proteome UniProt Knowledgebase¹⁷. W oprogramowaniu MaxQuant (aktualna wersja 1.5.0.25) peptydy są identyfikowane na podstawie uzyskanych widm MS/MS poprzez dopasowanie fragmentów peptydów do widm pochodzących in silico z bazy danych sekwencji białek. W tym samym czasie profile izotopowe jonów prekursorowych są ekstrahowane wokół ich chromatograficznych czasów retencji, a ich zintegrowane obszary pików są wykorzystywane do względnej kwantyfikacji par peptydów światło-ciężki generowanych przez znakowanie SILAC. Tożsamości peptydów i względne intensywności są następnie przypisywane do odpowiednich właściwości białka. Oprogramowanie Perseus (aktualna wersja 1.5.0.15) jest następnie wykorzystywane do przeprowadzania dalszej oceny statystycznej wyników przetwarzania MaxQuant, w tym porównań między próbkami, PCA i grupowania hierarchicznego.

Korzystając z opisanego zestawu eksperymentalnego, zidentyfikowaliśmy i określiliśmy ilościowo do 8 000 białek z zaledwie 30 μg całkowitego białka pochodzącego z płynnych nowotworów.

Do 2,500 białek z próbek guzów litych może być zidentyfikowanych i oznaczonych ilościowo w proteomicznym podejściu typu shotgun z gradientem LC wynoszącym zaledwie 2 godziny, co pozwala na analizę setek próbek klinicznych w stosunkowo krótkim czasie.

Rysunek 1. Eksperymentalny przepływ pracy. Przedstawiono główne etapy wzbogacania podzbiorów komórkowych, izolacji białek, skokowego wzrostu standardu kwantyfikacji i analizy spektrometrycznej mas dla guzów płynnych i litych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Strategie wzbogacania komórek. Sortowanie FACS i LCM. (A) Przykładowa strategia bramkowania przedstawiająca bramkowanie na populacji komórek białaczkowych barwionych CD117 nabytej przez sorter komórek. (B) Mikrodysekcja wychwytu laserowego tkanki guza litego. Skrawki tkanek o grubości 5 - 10 μm przed barwieniem montowano na pokrytych folią szkiełkach membranowych. Obszar zainteresowania został wybrany ręcznie do mikrodysekcji laserowej. Pokazane są przekroje przed mikrodysekcją z obszarem zainteresowania oznaczonym na żółto oraz po mikrodysekcji. Na rysunku znajduje się podziałka o wielkości 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Analiza skupień ludzkich proteomów komórek nowotworowych. Nienadzorowaną analizę skupień profili ekspresji białek guzów płynnych i litych przeprowadzono przy użyciu platformy obliczeniowej Perseus. AC – Gruczolakorak, SCC – Rak płaskonabłonkowy, SCC-Met – Rak płaskonabłonkowy z przerzutami raka głowy i szyi, R – kontrpróba techniczna.

Dyskusja

Profilowanie spektrometryczne proteomów komórek nowotworowych pochodzących od pacjentów jest potrzebne do odkrycia nowych biomarkerów diagnostycznych/predykcyjnych, a także do lepszego zrozumienia biologii komórek nowotworowych, co z kolei może prowadzić do identyfikacji nowych potencjalnych celów leków. Jednak takie analizy spektrometrii mas są bardzo trudne, w szczególności dlatego, że aby uzyskać wiarygodne i biologicznie istotne wyniki, należy rozwiązać różne problemy przedanalityczne.

Opisany tutaj eksperymentalny przepływ pracy pozwala na ilościową charakterystykę proteomiczną proteomów pochodzących z subpopulacji komórkowych zarówno guzów płynnych, jak i litych. Początkowe wzbogacenie komórek nowotworowych za pomocą sortowania komórek opartego na FACS lub mikrodysekcji jest konieczne, aby uniknąć zanieczyszczenia przez komórki mikrośrodowiska guza. Co więcej, techniki te pozwalają na izolację subpopulacji komórkowych będących przedmiotem zainteresowania. Ostatnie badania komórkowo-biologiczne wykazały, że niektóre subpopulacje komórkowe mają właściwości inicjujące nowotwór, a zatem są bardzo istotne dla patogenezy raka^19,20. Ponieważ spektrometria mas stała się bardziej czuła w ostatnich latach, ilościowe analizy proteomiczne są wykonalne dla niewielkich ilości białka, które można uzyskać z kilku tysięcy komórek, co umożliwia skupienie się na funkcjonalnie istotnych populacjach komórek.

Przedstawiona tutaj konfiguracja może być wykorzystana do identyfikacji i walidacji nowych biomarkerów diagnostycznych w próbkach FFPE. W związku z tym zapowiada się, że będzie użytecznym narzędziem do poprawy diagnostyki klinicznej, ponieważ do tej pory nadal brakuje biomarkerów molekularnych w odpowiedniej liczbie i jakości dla wielu typów nowotworów. Ważnymi przykładami trudnych rozpoznań różnicowych, dla których brakuje biomarkerów, są rozróżnienie między pierwotnym rakiem płuca a przerzutami do płuc, wewnątrztrzustkowym rakiem dróg żółciowych i gruczolakorakiem trzustki, a także różnicowanie łagodnego nerwiakowłókniaka od wysoce złośliwych guzów osłonki obwodowej nerwów. Co więcej, my i inni wykazaliśmy, że ilościowe wyjaśnienie sygnatur proteomicznych może być przydatne w badaniu biologii komórek nowotworowych w ogóle oraz w ujawnianiu predykcyjnych biomarkerów odpowiedzi terapeutycznej u pacjentów z rakiem²¹.

Dwie aktualne wady przedstawionej tutaj metody to wymóg rozległego ręcznego przetwarzania próbek oraz wymóg czasu akwizycji nanoLC-MS/MS. O ile pierwsze z tych problemów można rozwiązać, przenosząc przygotowanie próbek np. do formatów 96-dołkowych i stosując przetwarzanie zrobotyzowane, o tyle drugie będzie wymagało zmiany strategii akwizycji spektrometrii mas. Po zidentyfikowaniu podzbiorów białek docelowych, które mogą być powiązane np . z klasyfikacją nowotworów, przewidujemy zaprojektowanie ukierunkowanych metod spektrometrii mas, które zapewniają odczyty ilościowe dla tych podzbiorów przy znacznie zmniejszonym wysiłku separacji, a zatem przy odpowiednio skróconym czasie akwizycji. Gdyby wymagany czas akwizycji można było skrócić z 24 - 36 godzin (guzy płynne) lub 3 godzin (guzy lite) do np. 1 godziny przy użyciu ukierunkowanej spektrometrii mas i prostej jednowymiarowej separacji peptydów, wówczas uzyskany wzrost przepustowości można by wykorzystać do znacznego zwiększenia liczby badanych kontrprób biologicznych i technicznych, z odpowiednią poprawą znaczenia wyników kwantyfikacji. Wykazano już, że ukierunkowane podejścia oparte na spektrometrii mas są odpowiednim narzędziem do weryfikacji kandydatów na biomarkery białkowe związane z rakiem²² i zostały opracowane do punktu, w którym są obiecujące do walidacji, a nawet jako potencjalne narzędzie do rutynowego użytku klinicznego^23,24.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw 660 nm	Thermo scientific	22662
Pożywka do hodowli komórkowych zubożona w argininę i lizynę	Thermo Scientific	88421
Coomassie Brilliant Blue R-250 roztwór barwiący	Bio Rad	161-0436
Dializowana płodowa surowica cielęca (FCS)	PAA	A15-107
Nasadki dyfuzora do mikrodysekcji	MMI	50202
Sortownik FACS	BD	FACSAria III
Kompatybilność z detergentem jonowym Odczynnik	Thermo scientific	22663
Mikrodysektor wychwytywany laserowo	MMI	wycięcie komórki plus
bufor LDS	Life Technologies	NP0009
Szkiełka membranowe do mikrodysekcji	MMI	50103
Microcon YM-30	Millipore	MRCF0R030
NuPAGE 4-12% Bis-tris Mini żele	Life Technologies	NP0335PK2
Picofrit Kolumny samopakujące	Nowy obiektyw	PF360-75-15-N-5	Kolumna/emiter
spektrometrii masŚrodek redukujący	Life Technologies	NP0007
Reprosil-Pur LC/MS/MS Kolumna faza stacjonarna	Dr. Maisch	120 C18-AQ, 3 µ m
Reprosil-Pur LC/MS/MS Prekolumna faza stacjonarna	Dr. Maisch	120 C18-AQ, 5 &mikro; m
arginina znakowana SILAC	Eurisotop	CLM-2265-H-0,1
Lizyna znakowana SILAC	Eurisotop	DLM-2640-0,25
Trypsyna, klasa sekwencjonowania NB	Serva	3728301	do trawienia w żelu
Trypsyna, stopień sekwencjonowania	Promega	V5111	do trawienia w roztworze
Bufor i roztwory
Bufor do lizy komórek: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7,8, 5 mM NaF,  0,5% NP40, 0,1% laurylmaltozyd, kompletny inhibitor proteazy Roche, 1 mM Na3VO4
Bufor do lizy tkanek: 100 mM Tris/HCl pH 7,8, 0,1 M DTT
Mocznik: 8 M mocznik w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5			dla protokołu FASP
IAA: 0,05 M jodoacetamid, 8 M mocznik, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5			dla protokołu FASP
0,05 M NH4HCO3
10 mM ditiotreitol (DTT) w 0,1 M wodorowęglanie			do trawienia
w żelu55 mM jodoacetamidu (IAA) w 0,1 mM wodorowęglanu			do trawienia w żelu
5% wodny roztwór kwasu mrówkowego.