Model ex vivo do badania działania hormonów w ludzkiej piersi

Podsumowanie

Opracowaliśmy nowatorski model ex vivo do badania działania hormonów w ludzkiej piersi. Opiera się na mikrostrukturach tkankowych wyizolowanych z chirurgicznych próbek tkanki piersi, które zachowują architekturę tkanki, interakcje międzykomórkowe i sygnalizację parakrynną.

Streszczenie

Badania nad działaniem hormonów w ludzkiej piersi zostały utrudnione przez brak odpowiednich systemów modelowych. W hodowli in vitro pierwotne komórki nabłonka sutka mają tendencję do utraty ekspresji receptorów hormonalnych. Szeroko stosowane linie komórkowe raka piersi z dodatnim receptorem hormonalnym mają ograniczone znaczenie w sytuacji in vivo. W tym miejscu opisujemy model ex vivo do badania działania hormonów w ludzkiej piersi. Świeże próbki tkanki piersi ludzkiej z materiału chirurgicznego, takiego jak mammoplastyka redukcyjna lub mammektomia, są trawione mechanicznie i enzymatycznie w celu uzyskania fragmentów tkanek zawierających przewody i zraziki oraz wiele typów komórek zrębu. Te mikrostruktury tkankowe utrzymywane w podłożu podstawowym bez czynników wzrostu zachowują swoje kontakty międzykomórkowe, architekturę tkanki i pozostają wrażliwe na hormony przez kilka dni. Są one łatwo przetwarzane w celu ekstrakcji RNA i białek, analizy histologicznej lub przechowywane w pożywce zamrażającej. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) może być stosowane do wzbogacania określonych populacji komórek. Protokół ten zapewnia proste, standardowe podejście do badań translacyjnych z bardzo złożonymi, zróżnicowanymi próbkami ludzkimi.

Wprowadzenie

Informacje na temat krajobrazu mutacji w raku piersi rosną w szybkim tempie. Mniej uwagi poświęcono czynnikom ogólnoustrojowym, które wpływają na rozwój raka piersi. Narażenie na hormony rozrodcze ma duży wpływ na postęp choroby^1-3. Jednak mechanizmy, za pomocą których hormony rozrodcze oddziałują na ludzką pierś, są słabo poznane. Prace z genetycznie zmodyfikowanymi modelami myszy ujawniły, że obejmują one wewnętrzną i parakrynną sygnalizację komórkową za pośrednictwem kilku efektorów⁴.

Ograniczona wiedza na temat działania hormonów w ludzkiej piersi jest w dużej mierze spowodowana brakiem odpowiednich modeli. Większość prac nad mechanizmami sygnalizacji receptora estrogenowego (ER) i receptora progesteronowego (PR) przeprowadzono z liniami komórkowymi raka piersi z dodatnim receptorem hormonalnym, takimi jak MCF-7 i T47D. Pochodziły one z wysięku opłucnowego u pacjentek z zaawansowanym rakiem piersi, które otrzymały już wiele metod leczenia⁵. Biologiczne znaczenie wyników takich prostych modeli in vitro ludzkiej piersi jest wątpliwe, a geny docelowe zidentyfikowane w tych modelach in vitro różnią się od genów docelowych zidentyfikowanych w modelach zwierzęcych⁶. Kiedy pierwotne ludzkie komórki nabłonka piersi są hodowane in vitro, mają tendencję do utraty ekspresji receptorów hormonalnych, a tym samym odpowiedzi hormonalnej^7,8. Problem ten można obejść dzięki wyrafinowanym metodom 3D z wykorzystaniem matrigelu. W ten sposób C. Clarke i współpracownicy odnieśli sukces w tworzeniu komórek nabłonka piersi, które utrzymywały ekspresję receptorów hormonalnych i wykazywały proliferacyjną odpowiedź na stymulację progesteronem⁹. Jednak dwa ważne geny docelowe receptora progesteronu in vivo, Wnt-4 i RANKL, nie zostały indukowane po stymulacji progesteronem w tym systemie⁹. Podejście to zostało niedawno rozszerzone poprzez wstępne leczenie hormonami in vitro i osiągnięto indukcję RANKL¹⁰. Pozostaje zastrzeżenie, że matrigel ma działania, które są zależne od partii, jest drogi i wymaga eksperymentalnego projektu, który jest odpowiedni tylko dla małych liczb komórek.

Na podstawie stwierdzenia, że w sygnalizacji in vivo ER i PR pośredniczą głównie interakcje parakrynne¹¹, stwierdziliśmy, że interakcje międzykomórkowe muszą być utrzymane. Innym ważnym czynnikiem, który jest tracony, gdy tkanki są dysocjowane na pojedyncze komórki do hodowli in vitro, są interakcje komórek nabłonkowych z macierzą zewnątrzkomórkową; Są one jednak krytyczne dla różnicowania nabłonka, a ich przerwanie jest ważne w nowotworzeniu¹². Mając to na uwadze, opracowaliśmy metodę izolowania mikrostruktur tkanki piersi ze świeżego materiału chirurgicznego¹³. Miąższ piersi, składający się z dwuwarstwowego nabłonka z wewnętrznymi komórkami luminalnymi i zewnętrznymi mioepitelialnymi, jest wycinany z tkanki tłuszczowej i poddawany dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej. Po umyciu i odwirowaniu uzyskuje się fragmenty przewodów mlecznych, które zachowują bliskie interakcje z wieloma komórkami zrębu. Te mikrostruktury tkankowe pozostają wrażliwe na hormony. Model został zweryfikowany w próbkach klinicznych¹³. W związku z tym obecna procedura może pomóc w badaniu działania hormonów w piersi w kontekście biologicznym i klinicznym.

Protokół

Uwagi ogólne: Zawczasu ustal protokół etyczny, przygotuj kwestionariusze dla pacjentów i dopilnuj szkolenia personelu klinicznego. Przed użyciem materiału z operacji mammoplastyki redukcyjnej należy uzyskać autoryzacje i uzyskać zgodę pacjenta. Tkanka może być zakaźna i należy się z nią odpowiednio obchodzić. Protokół ten został zatwierdzony przez komisję etyczną ISREC - Szwajcarskiego Instytutu Eksperymentalnych Badań nad Rakiem.

1. Odzyskiwanie, przetwarzanie i biobankowanie tkanek

Aby zapewnić optymalną jakość próbki do biobankowania, w szpitalu przeprowadza się szereg kroków przed transportem do laboratorium.

W szpitalu:

1. Pobrać ludzkie tkanki piersi w sterylnych warunkach z operacji mammoplastyki redukcyjnej i próbek krwi, jeśli jest to wymagane. Tkanka musi zostać zbadana przez patologa, który pobierze próbkę, aby wykluczyć obecność zmian złośliwych.
2. Umieść tkankę piersi pod kapturem na sterylnej desce i przygotuj nożyczki, skalpel chirurgiczny i kleszcze, które są już wysterylizowane sterylizatorem parowym. Wykonaj głębokie nacięcie w różnych miejscach tkanki sutkowej za pomocą skalpela, aby ją otworzyć. W tkance piersi ludzkiej szukaj białych pasm składających się z kanalików i zrazików, które są osadzone w żółtej tkance tłuszczowej.
   UWAGA: Stosunek białej tkanki tłuszczowej do żółtej jest różny u kobiet; Zazwyczaj młodsze kobiety mają więcej tkanki nabłonkowej.
3. Zbierz kawałki białego materiału i przytrzymaj je kleszczami, a następnie delikatnie oddziel je od tkanki tłuszczowej nożyczkami. Unikaj przyjmowania naczyń krwionośnych.
4. Opłucz kawałki tkanki w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,2, aby usunąć krew. Przenieś tkankę do plastikowych butelek o pojemności 250 ml zawierających pożywkę F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium F12) bez czerwieni fenolowej z 2% penicyliną/streptomycyną (w tym 5 000 jednostek/ml penicyliny i 5 000 g/ml streptomycyny) i 1% antybiotyku/amfoterycyny B (w tym 10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B). Przechowywać tkanki w pożywce w celu transportu do laboratorium.
5. Przygotuj kawałki o średnicy 3 - 5 mm do ekstrakcji RNA i białek i błyskawicznie zamroź je w kriowiach z zimnym (suchym lodem) izopentanem. Przenieś je do pojemnika na suchy lód w celu transportu do laboratorium.
6. Kawałki o grubości 3 - 5 mm wkładamy do formy i przykrywamy warstwą optymalnej temperatury cięcia (OCT), a następnie umieszczamy formę na płaskim dnie pudełka wypełnionego zimnym izopentanem. Po całkowitym zamrożeniu przenieś formę do pojemnika na suchy lód.
7. Utrwalić 5 kawałków o średnicy 3 - 5 mm w paraformaldehydzie (PFA) 4% i kolejne 5 kawałków w formaldehydzie (FA) 4% w PBS podczas późniejszej analizy histologicznej RT. Zalecane są dwa różne utrwalacze, ponieważ niektóre przeciwciała działają lepiej z jednym lub drugim z nich.

W laboratorium:

8. Udokumentuj wszystkie informacje na temat mammoplastyki redukcyjnej, daty operacji oraz tego, czy próbki pochodzą z lewej, czy z prawej piersi.
9. Zamrożone próbki umieścić w temperaturze -80°C i po 2 godzinach od utrwalenia przenieść utrwalone tkanki do kaset histologicznych. Następnie umieść je w PBS lub 70% etanolu, w celu przechowywania O/N w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przenieś kasety histologiczne do zakładów histologicznych w celu zatopienia parafiny.

2. Trawienie tkanek i stymulacja hormonalna

1. Przenieść butelki zawierające próbki tkanek do komory z przepływem laminarnym w pomieszczeniu do hodowli komórkowych P2. Ułóż kawałki chusteczek na sterylnej desce do krojenia (29 x 19 cm). Przytrzymaj materiał kleszczami i zeskrob pozostały tłuszcz i naczynia z miąższu piersi (biała część) za pomocą skalpela. Umieść biały materiał w PBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.
2. Po usunięciu materiału tłuszczowego ze wszystkich kawałków i pozbyciu się ich zgodnie z zasadami bezpieczeństwa obowiązującymi w laboratorium, umieść białe części zawierające tkanki nabłonkowe z powrotem na desce do krojenia. Za pomocą przeciwstawnych skalpeli przetnij tkankę i posiekaj ją na kawałki o średnicy do 2 mm.
3. Rozdrobniony materiał umieścić w probówkach o odpowiedniej wielkości: do 1, 2,5 i 10 ml w probówkach o pojemności odpowiednio 5, 15 lub 50 ml. Zazwyczaj probówka o pojemności 5 ml dostarcza wystarczającą ilość materiału do zatapiania parafiny i stymulacji hormonalnej, a probówka o pojemności 15 ml zapewnia wystarczającą ilość materiału do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Większe probówki są używane do zamrażania podwielokrotności.
4. Przygotować główną mieszankę trawienia składającą się z pożywki (DMEM/F12 bez czerwieni fenolowej) z 1% penicyliną/streptomycyną/amfoterycyną B i kolagenazą A (Clostridiopeptidaza A z Clostridium histolyticum). Dawkowanie kolagenazy zależy od czasu trawienia.
   1. Przez 12, 24 i 36 godzin inkubacji należy stosować końcowe stężenie kolagenazy wynoszące odpowiednio 1,5 mg/ml, 1,0 mg/ml i 0,5 mg/ml. Dodać mieszankę główną mineralizacji do 4 razy większą od objętości strawionego materiału, aby zapewnić odpowiednie mieszanie i napowietrzenie.
      UWAGA: W zależności od projektu eksperymentu i czasu trwania stymulacji hormonalnej, dodaj hormony w trakcie lub po etapie trawienia enzymatycznego i odzyskiwania mikrostruktury.
5. Dodać hormon(-y) o pożądanym stężeniu do badania próbek i nośnika do kontroli. Do stymulacji 17-β-estradiolem i promegestonem (R5020) należy użyć końcowego stężenia 20 nM.
   UWAGA: R5020 jest syntetycznym agonistą receptora progesteronu, który jest bardziej stabilny niż naturalny progesteron w pożywce.
   1. Umieścić probówki na mieszalniku rolkowym w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 40 obr./min O/N. Przed umieszczeniem próbek w mieszalniku należy je bardzo dobrze zawiesić, aby upewnić się, że cały materiał rozprowadzi się wzdłuż probówek wirówkowych.
6. Ponieważ trawienie trwa co najmniej 12 godzin (O/N), w przypadku stymulacji hormonalnej krótszych niż 12 godzin, dodaj hormony po odzyskaniu mikrostruktur (szczegółowo w kroku 3). Dodaj hormony podczas ponownego zawieszania mikrostruktur i umieść zawiesinę na bardzo niskich płytkach mocujących. Mikrostruktury tkankowe mogą być przechowywane na płytkach o bardzo niskim przyleganiu do 7 dni w podłożu wolnym od czynników wzrostu, zachowując około 70% żywotności.
7. W celu analizy RNA i białek należy pobrać mikrostruktury tkankowe przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut i błyskawiczne zamrożenie w probówkach wirówkowych.

3. Odzyskiwanie mikrostruktur tkanek

1. Odwirować probówkę (probówki) o masie 400 x g przez 5 minut. Odessać tłuszcz z górnej części probówki wirówkowej i przenieść supernatant pozostałego wodnego supernatantu, który jest wzbogacony w fibroblasty, do nowej probówki wirówkowej i wirować przy 1,250 x g przez 5 min.
   UWAGA: Ponieważ mikrostruktury tkanki piersi są bardzo lepkie, na wszystkich kolejnych etapach należy ponownie zawiesić granulkę, delikatnie mieszając rurkę. Pipetowanie nie jest zalecane ze względu na ryzyko utraty materiału.
2. Zawiesić granulki wzbogacone w mikrostruktury i fibroblasty pochodzące z wodnego supernatantu w PBS, 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Następnie obracać obie probówki w temperaturze 1 250 x g przez 5 minut, a następnie wyrzucić supernatanty.
3. Ponownie zawiesić granulki w 3 - 5 ml buforu do lizy krwi czerwonokrwinkowej i przenieść je do czystych probówek. Inkubuj je przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Dodać 2x objętość PBS, 2% FCS i odwirować je przy 1.250 x g przez 5 min. Umyć granulki PBS, 2% FCS i odwirować przy 1.250 x g przez 5 min. Powtórz ten krok dwukrotnie.

4. Próbki do cytometrii przepływowej

1. Dodaj 1 - 2 ml trypsyny 0,25% do osadu i wymieszaj go, pipetując bardzo delikatnie w górę i w dół przez 2 minuty za pomocą pipetara o pojemności 1 000 μl, aby zdysocjować komórki.
2. Hamuj aktywność trypsyny, dodając 9 ml PBS, 2% FCS. Wirować przy 450 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 10 ml PBS, 2% FCS.
3. Przenieść zawiesinę komórkową na sitko o wielkości 40 μm umieszczone na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w celu przygotowania pojedynczych komórek. Jeśli na górze filtra pozostanie kilka mikrolitrów zawiesiny komórek, pomóż im przejść przez filtr, zasysając je z drugiej strony sitka za pomocą pipety i dodaj je do przefiltrowanych mikrostruktur.
4. Oddziel komórki odpornościowe, fibroblasty i komórki śródbłonka od mikrostruktur za pomocą koktajlu przeciwciał anty-CD45, anty-FAP i anty-CD31, a następnie posortuj je za pomocą FACS, w oparciu o marker pan-nabłonkowy EpCAM i CD10, aby oddzielić odpowiednio komórki luminalne i podstawne¹⁰.

5. Próbki do badania histologicznego

1. Po umyciu materiału strawionego mechanicznie i enzymatycznie, jak opisano powyżej, utrwalić granulki z 1,5 ml materiału wyjściowego w 1 ml 4% PFA w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 min.
2. Wirować przy 1 250 x g przez 5 minut i dwukrotnie przemyć 1 - 2 ml PBS.
3. Wirować przy 16 000 x g przez 10 min. W tym czasie przygotuj 1% wielozadaniowej agarozy w buforze Tris-Acetate-EDTA (TAE) i podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej, aż roztwór się zagotuje.
   1. Wyjąć roztwór z kuchenki mikrofalowej i delikatnie zakręcić kolbą, aby wymieszać roztwór i ponownie zawiesić pozostałe cząstki agarozy. Schłodzić roztwór agarozy do temperatury 50 °C i wlać 1 ml do formy na bazie parafinowej o rozmiarach 31 × 23 × 13,5 mm.
4. Odrzucić supernatant i umieścić granulki na zestalonej warstwie (1 - 3 mm) agarozy za pomocą szpatułki z płaskim końcem. Przykryj je wszystkie dodatkową warstwą agarozy (40 °C).
5. Po zastygnięciu agarozy, zwykle w ciągu 5 minut, umieść bloki agarozy w kasetach histologicznych w celu zatopienia parafiny. Wraz z próbkami agarozy umieść w kasecie białą kartkę biurową ze wszystkimi informacjami na temat liczby mammoplastyki redukcyjnej, warunkami eksperymentu i datą napisanymi małymi literami ołówkiem; To pismo wytrzymuje wszystkie kolejne etapy leczenia.
6. Umieść kasety w PBS O/N lub w 70% etanolu do przechowywania przez weekend, w temperaturze 4 °C. Nie zauważyliśmy żadnej różnicy między tymi dwoma rozwiązaniami pamięci masowej. Następnie przenieś kasety histologiczne do urządzeń histologicznych w celu zatopienia parafiny.

6. Zamrażanie mikrostruktur (Hodowla Przyszłości)

1. Zawiesić mikrostruktury tkankowe w pożywce zamrażającej składającej się z FCS z 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) i zamrozić 1 ml podwielokrotności w kriowialach. Liczba otrzymanych kriowiali zależy od ilości materiału pierwotnego uzyskanego z mammoplastyki redukcyjnej.
2. Zamrozić kriowia zawierające mikrostruktury tkankowe za pomocą zamrażarki o kontrolowanej szybkości z następującym programem: 5 minut przebywania w temperaturze 4 °C, obniżenie temperatury do -7 °C z szybkością 6 °C/min, obniżenie temperatury do -12 °C z szybkością 6 °C/min, 10 minut przebywania, obniżenie temperatury do -40 °C z szybkością 6 °C/min, spadek temperatury do -80 °C z szybkością 6 °C/min. Następnie przenieś kriowiale do zamrażarki o temperaturze -80°C.
3. Następnego dnia przenieś kriowiale z temperatury -80°C do zbiornika z ciekłym azotem w celu długiego przechowywania.

Wyniki

Aby zbadać rolę estrogenów i progesteronu oraz lepiej zrozumieć ich funkcje molekularne w ludzkiej piersi, pobieramy świeże próbki tkanki piersi od pacjentek poddawanych redukcyjnej mamoplastyce (Rysunek 1) po uzyskaniu ich świadomej zgody. Pozyskujemy również wywiad medyczny i reprodukcyjny pacjentek, a także próbkę krwi w celu oznaczenia poziomu progesteronu w surowicy w momencie operacji. Tkanka z redukcyjnych mamoplastyk jest dysocjowana mechanicznie i enzymatycznie. Powstałe mikrostruktury tkankowe ...

Dyskusja

Opisana tutaj hodowla ex vivo zapewnia mikrostruktury tkanki piersi zawierające nienaruszone przewody i zraziki, wraz z innymi typami komórek normalnie występującymi w piersi ludzkiej kobiety. W przetwarzaniu ludzkiej tkanki piersi zwykle uzyskiwanej z mammoplastyki redukcyjnej, usuwania tkanki tłuszczowej, mechanicznego i enzymatycznego trawienia macierzy zrębu oraz lizy czerwonych krwinek wzbogaca się o fragmenty przewodów mlecznych i końcowe przewodowe jednostki zrazikowe. Delikatne trawienie enzymatyczne w o...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wirówka mikrolitrowa	Heraeus Biofuge Fresco	75005521
Wirówka 5810R	Eppendorf	5810 000.327
Cryobox	Nalgene	5100-0001
Zamrażarka z kontrolowaną szybkością EF600 Grant	Asymptote	EF600
Inkubator CO2	Mieszalnik rolkowy Hera Cell Heraeus	51022391
SRT9D	Sturt	SRT9D
	Medizintechnik	81-0021-00
Sitko do komórek	Falcon	352340
Ostrze chirurgiczne Strile	Aesculap	BB536
Skalpel	Aesculap	BB084R
Kleszcze	Aesculap	BD047R
Nożyczki	Aesculap	BC374R
Forma na bazie parafiny	SAKURA	4166
Optymalna temperatura cięcia (OCT) Cryomatrix	Thermoscientific	6769006
Penicylina/Streptomycyna	Life Technologies	15070-063
Antybiotyk/Antybiotyk	Technologie życia	15240-062
DMEM F/12	Life Technologies	11039-021	Podgrzewanie (37 ° C)
Kolagenaza	Roche	11 088 793 001	Podgrzewana (37 ° C)
Technologie życia	w surowicy bydlęcej	10270	w surowicy płodów cielęcych
	Sigma	R7757
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma	D2650
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
Agaroza	Invitrogen	16500-500
Formaldehyd	Sigma	F1635
Paraformaldehyd	Roth	335
Izopentan	Sigma	M32631
Etanol	Merck	1009831000
Fiolki kriogeniczne (5,0 ml)	VWR, International	479-0820
Naczynie hodowlane o bardzo niskim nasadce	Corning, NY 14831	3471

Kasety histologiczne płodu Można zastąpić buforem do lizy krwi