Wykrywanie biomarkera egzosomalnego za pomocą uwalniania i pomiaru wywołanego polem elektrycznym (EFIRM)

Podsumowanie

Egzosomy to mikropęcherzykowe struktury znajdujące się w biopłynach, które potencjalnie przenoszą ważne biomarkery dyskryminujące choroby. W tym przypadku zastosowano nowatorską metodę do specyficznej ekstrakcji egzosomów i szybkiego przetestowania ładunku egzosomalnego dla obu celów RNA/białka po rozerwaniu egzosomów za pomocą niejednorodnych elektrycznych cyklicznych fal prostokątnych.

Streszczenie

Egzosomy to struktury mikropęcherzykowe, które odgrywają rolę pośredniczącą w komunikacji międzykomórkowej. Interesujące jest zbadanie wewnętrznego ładunku egzosomów w celu ustalenia, czy przenoszą one biomarkery dyskryminujące chorobę. Do przeprowadzenia analizy egzosomalnej konieczne jest opracowanie metody ekstrakcji i analizy egzosomów z docelowych płynów biologicznych bez uszkadzania zawartości wewnętrznej.

Uwalnianie i pomiar wywołane polem elektrycznym (EFIRM) to metoda specyficznego wydobywania egzosomów z biopłynów, rozładowywania ich ładunku i testowania ich wewnętrznej zawartości RNA/białka. Za pomocą mikrocząstki magnetycznej przeciwciała specyficznego dla przeciwciała anty-ludzkiego, egzosomy są najpierw wytrącane z płynów biologicznych. Po ekstrakcji stosuje się niskonapięciowe elektryczne cykliczne fale prostokątne (CSW) w celu przerwania błony pęcherzykowej i spowodowania rozładunku ładunku. Zawartość egzosomu jest hybrydyzowana ze starterami DNA lub przeciwciałami unieruchomionymi na powierzchni elektrody w celu ilościowego określenia zawartości molekularnej.

Metoda EFIRM jest korzystna do ekstrakcji egzosomów i rozładunku ładunku do analizy bez buforu do lizy. Metoda ta jest w stanie przeprowadzić specyficzne wykrywanie zarówno RNA, jak i docelowych biomarkerów białkowych w egzosomie. EFIRM ekstrahuje egzosomy specjalnie na podstawie ich markerów powierzchniowych, w przeciwieństwie do technik opartych na rozmiarze.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) i test demonstrują funkcjonalność metody wychwytywania i analizy egzosomów. Metodę EFIRM zastosowano do analizy egzosomalnej 9 myszy, którym wstrzyknięto ludzkie komórki H640 raka płuc (linia komórkowa transfekowana w celu ekspresji markera egzosomu ludzkiego CD63-GFP) w celu przetestowania ich profilu egzosomu w porównaniu z 11 myszami otrzymującymi kontrolę soli fizjologicznej. Podwyższone poziomy biomarkerów egzosomalnych (gen referencyjny GAPDH i marker powierzchniowy białka ludzkiego CD63-GFP) stwierdzono u myszy, którym wstrzyknięto H640 zarówno w próbkach surowicy, jak i śliny. Ponadto wykazano, że próbki śliny i surowicy mają liniowość (R = 0,79). Wyniki te sugerują żywotność biomarkerów egzosomów śliny do wykrywania chorób dystalnych.

Wprowadzenie

Badania nad egzosomami to rozwijająca się dziedzina nauki, która zajmuje się analizą lipidowych mikropęcherzyków przenoszących ładunek w postaci RNA¹, DNA² oraz białek³. Poprzednie badania nad biologią egzosomów doprowadziły do ich zidentyfikowania w płynach ustrojowych, takich jak krew⁴, mocz⁵, mleko kobiece⁶ oraz ślina⁷. Wykazano, że egzosomy odgrywają rolę w różnych szlakach komórkowych, pośrednicząc zdalnie w komunikacji między różnymi układami organizmu⁸. Ze względu na rolę egzosomów w komunikacji międzykomórkowej wysunięto hipotezę, że mogą one pakować biomolekuły docelowe (białka, RNA i DNA) skorelowane ze stanami chorobowymi. Badania in vitro³ oraz na modelach zwierzęcych⁹ zdają się potwierdzać tę hipotezę. Aby badać zawartość egzosomów w celu odkrywania biomarkerów, konieczne jest opracowanie metodologii selektywnej izolacji egzosomów z płynów ustrojowych, indukowanego uwalniania ładunku z egzosomów oraz kwantyfikacji biomolekuł egzosomalnych. W ramach niniejszej pracy egzosomy będą definiowane jako struktury o średnicy około 70-100 nm posiadające marker powierzchniowy CD63.

Badacze zazwyczaj najpierw oczyszczają egzosomy za pomocą ultrawirowania¹⁰, a następnie przetwarzają zawartość egzosomalną przy użyciu zestawów z buforami do lizy. Stosowanie metod z buforami do lizy wymaga czasu inkubacji wynoszącego od kilku minut do kilku godzin. Proces ten może potencjalnie uszkodzić ładunek egzosomów i prowadzić do degradacji próbki. Na przykład RNA z egzosomów ślinowych, uwolnione za pomocą buforu do lizy do otaczającego środowiska zewnątrzkomórkowego, ma okres półtrwania krótszy niż 1 min, co sprawia, że pomiar RNA egzosomalnego po zastosowaniu buforu do lizy jest zadaniem szczególnie trudnym bez dodania reagentów stabilizujących¹¹. Skumulowany efekt dodawania różnych reagentów do lizy i stabilizacji może wprowadzić substancje, które komplikują i utrudniają analizę zawartości egzosomalnej. Alternatywne podejście może być pomocne w szybkim uwalnianiu zawartości egzosomów i bezpiecznym przechowywaniu ładunku w celu jego charakterystyki.

W niniejszej pracy proponujemy zastosowanie niejednorodnego pola elektrycznego do uwalniania zawartości egzosomów. Znane jest, że pola elektryczne posiadają zdolność polaryzacji i rozrywania dwuwarstwy lipidowej tworzącej błony komórkowe. Nasze prace eksperymentalne badają wykorzystanie niejednorodnych cyklicznych fal prostokątnych (CSW) do rozrywania struktury mikropęcherzykowej egzosomów i uwalniania transportowanego ładunku. Metoda ta wykorzystuje napięcia rzędu kilkuset miliwoltów, co oznacza, że większość biomolekuł nie zostanie uszkodzona. Wykazujemy, że zastosowanie cyklicznej fali prostokątnej pozwala na zainicjowanie uwalniania mRNA z egzosomów ślinowych do otaczającego środowiska płynnego. Uwalnianie to jest płynnie zintegrowane z systemem elektrod, który może być wykorzystany do ilościowego oznaczania poziomów ekspresji biomarkerów^12,13. Zaproponowana metoda umożliwia szybką, czułą i wolną od buforu lizującego analizę zawartości egzosomów.

Rycina 1. Przegląd przepływu pracy EFIRM. ^.Metoda EFIRM jest podzielona na trzy główne fazy niezbędne do oczyszczania i analizy egzosomów.

Ta metoda uwalniania i analizy zawartości egzosomów oparta na CSW jest stosowana w połączeniu z magnetycznymi mikrokulkami specyficznymi dla CD63 w celu izolacji egzosomów. Kulki z powinowactwem do CD63 umożliwiają selektywną izolację egzosomów z próbek śliny (oraz innych płynów ustrojowych). Po inkubacji i ekstrakcji egzosomów za pomocą namagnesowanych kulek, są one przenoszone do elektrochemicznego systemu sensorowego w celu przeprowadzenia części eksperymentu dotyczącej uwalniania i analizy zawartości opartej na CSW. Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat przepływu pracy w metodzie EFIRM.

Protokół

1. Wyodrębnianie egzosomów z wykorzystaniem kulek magnetycznych

1. Do probówki do mikrocentryfugi pipetuj dobrze wymieszany roztwór 5 µl magnetycznych mikrocząsteczek powlekanych streptawidyną do 495 µl buforu fosforanowo-solnego (PBS), aby resuspendować kuleczki. Trzykrotnie przemyj i resuspenduj kuleczki w 500 µl PBS, używając statywu magnetycznego. Statyw ten stanowi układ magnesów znajdujących się po bokach obudowy, w której można umieścić probówki do mikrocentryfugi z próbkami.
   1. Podczas każdego płukania pozostaw najpierw probówki na statywie na 1 min, a następnie za pomocą końcówki pipety ostrożnie usuń nadsącz z buforem, nie naruszając kuleczków.
   2. Umieść probówki na zwykłym statywie bez magnesów bocznych. Dodaj do probówek 500 µl PBS i za pomocą pipety wymieszaj roztwór z kuleczkami. Następnie umieść probówki ponownie na statywie magnetycznym, aby ponownie oddzielić kuleczki od roztworu.
   3. Powtórz usuwanie buforu poprzez namagnesowanie i resuspensję w PBS łącznie trzy razy. Wykonuje to wstępne przemycie cząsteczek magnetycznych.
2. Resuspenduj kuleczki w 490 µl buforu PBS, umieściwszy probówkę na nieumagnesowanej części statywu magnetycznego. Do mieszaniny kuleczków pipetuj 5 µl biotynylowanego przeciwciała mysiego przeciwko ludzkiemu CD63 o stężeniu roztworu stokowego 1,0 mg/ml. Za pomocą pipety wymieszaj kuleczki i przeciwciało w roztworze.
3. Umieść probówki do mikrocentryfugi z mieszaniną kuleczków i biotynylowanego przeciwciała na rotatorze do próbek. Ustaw parametry rotatora na obrót zwrotny przy nachyleniu 90° przez 5 sec i wibracje przy 5° przez 1 sec. Rotuj probówki z mieszaniną próbek i kuleczków przy tych parametrach przez 30 min w RT.
4. Usuń nieprzypisane przeciwciała po koniugacji.
   1. Po 30 min rotacji w RT umieść probówki ponownie w statywie magnetycznym na 5 min.
   2. Przeprowadź trzykrotne przemycie kuleczków, usuwając fazę ciekłą za pomocą mikropipety i płucząc w 500 µl PBS. Po trzykrotnym przemyciu resuspenduj kuleczki w 490 µl kazeiny-PBS i umieść je na nieumagnesowanej części statywu.
5. Ekstrakcja egzosomów przy użyciu kuleczków powlekanych przeciwciałami.
   1. Oznacz każdą probówkę odpowiednim identyfikatorem próbki. Do probówki do mikrocentryfugi pipetuj 10 µl próbki surowicy lub śliny. Za pomocą pipety wymieszaj próbkę z kuleczkami magnetycznymi, pipetując kilkakrotnie.
   2. Umieść probówki z próbką i kuleczkami z przeciwciałem przeciwko ludzkiemu CD63 na rotatorze i rotuj przez 2 hr w RT. Użyj tych samych parametrów rotatora, które opisano w kroku 1.2.
   3. Po 2 hr rotacji próbki przeprowadź trzykrotne przemycie poprzez namagnesowanie w celu oddzielenia kuleczków od roztworu, usunięcie fazy ciekłej mikropipetą i resuspensję kuleczków w 500 µl buforu Tris-HCl. Otrzymane kuleczki są teraz związane z egzosomami i są gotowe do uwalniania w polu elektrycznym oraz pomiaru.

2. Wyzwalanie zawartości egzosomów indukowane polem elektrycznym i jej pomiar

1. Wstępne powlekanie elektrody starterem GAPDH
   1. Nałóż plastikową płytkę z dołkami na matrycę elektrod, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym poszczególnych elektrod. W tym eksperymencie należy użyć matrycy elektrod z 16 czujnikami, gdzie każda jednostka elektrodowa w matrycy składa się z elektrody roboczej, pomocniczej i referencyjnej wykonanych z czystego złota.
   2. Przygotuj roztwór stokowy zawierający 100 nM sondy DNA, 0,3 M KCl i 10 mM pirrolu, pipetując odczynniki stokowe do probówki z ultraczystą wodą destylowaną. Wymieszaj dokładnie za pomocą wortexa.
      UWAGA: W badaniu tym wybrano sondę DNA odpowiadającą genowi referencyjnemu GAPDH, który występuje w egzosomach. Użyta sekwencja sondy to: 5'-Biotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3'. Użyj tej mieszaniny na wszystkich elektrodach.
   3. Nanieś pipetą 60 µl mieszaniny monomeru i sondy DNA na powierzchnię każdej złotej elektrody. Sprawdź elektrody, aby upewnić się, że ciecz odpowiednio pokrywa elektrody roboczą, pomocniczą i referencyjną.
   4. Przeprowadź elektropolimeryzację mieszaniny monomeru i sondy, aby utworzyć warstwę polimeru przewodzącego na powierzchni elektrody, przykładając do jej powierzchni profil pola elektrycznego w postaci cyklicznej fali prostokątnej (CSW). Pole elektryczne to polega na przyłożeniu napięcia +350 mV przez 9 s i natychmiastowym przełączeniu na +950 mV przez 1 s. Zastosuj ten profil cyklicznej fali prostokątnej do elektrody przez 10 cykli, co daje łącznie 100 s działania pola elektrycznego.
   5. Przepłucz powierzchnię czujnika 3 razy wodą destylowaną i wysusz azotem w celu usunięcia cieczy z powierzchni elektrody. Upewnij się, że ciecz została całkowicie usunięta z elektrody.
2. Uwalnianie zawartości egzosomów
   1. Dodaj 5 µl sondy detekcyjnej o stężeniu 1 µM do 495 µl mieszaniny kompleksów koralików i egzosomów i wymieszaj za pomocą pipety.
      UWAGA: Sonda detekcyjna to sekwencja startera DNA sprzężona z cząsteczką fluoresceiny na końcu 3'. Sekwencja sondy detekcyjnej użyta w tym badaniu odpowiada mRNA GAPDH znajdującemu się w egzosomach. Sekwencja sondy detekcyjnej sprzężonej z fluoresceiną to: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Fluorescein-3'.
   2. Nanieś pipetą 60 µl mieszaniny sondy i kompleksów koralików z egzosomami na powierzchnię złotej elektrody z umieszczoną pod nią matrycą magnesów. Matryca ta składa się z szesnastu magnesów neodymowych o średnicy 2,54 mm, ustawionych zgodnie z pozycją elektrod roboczych czujnika. Rycina 2A ilustruje rozmieszczenie magnesów i roztworu kompleksów koralików z egzosomami.
   3. Po naniesieniu próbki na powierzchnię elektrody zastosuj 20 cykli pola elektrycznego CSW z napięciem -300 mV przez 9 s i +200 mV przez 1 s (łącznie 200 s). Uwolniona zawartość egzosomów zhybrydyzuje ze starterami na powierzchni elektrody. Jeśli przedmiotem badania są markery powierzchniowe egzosomów, pomiń tę część eksperymentu. Rycina 2B ilustruje ten proces.
   4. Usuń niezwiązane anality z powierzchni elektrody, trzykrotnie płucząc ją wodą destylowaną. Wysusz elektrodę azotem.
3. Przeciwciało reporterowe i odczyt
   1. Dodaj 60 µl przeciwciała anty-fluoresceinowego o stężeniu 150 jednostek/ml sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP w rozcieńczeniu 1:1 000), rozcieńczonego w kazeinie/PBS.
   2. Użyj sprzęgania napędzanego polem elektrycznym, aby połączyć anty-fluoresceinową HRP z kanapką sondy. Przyłóż do powierzchni elektrody napięcie -200 mV przez 1 s i +500 mV przez 1 s przez 5 cykli. Rycina 2A przedstawia kompleksy sondy wychwytującej i detekcyjnej dla systemu białkowego oraz kwasów nukleinowych.
   3. Trzykrotnie przemyj powierzchnię czujnika wodą destylowaną i wysusz azotem.
   4. Po wypłukaniu nadmiaru niezwiązanego przeciwciała anty-fluoresceinowego dodaj 60 µl substratu 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB). Nanieś ten substrat na każdą powierzchnię czujnika za pomocą pipety wielokanałowej.
   5. Wykonaj amperometryczny odczyt prądu, mierząc prąd elektrody przy napięciu -200 mV przez 60 s przy użyciu potencjostatu elektrochemicznego zdolnego do jednoczesnego pomiaru z 16 kanałów. Rycina 2C przedstawia przykład profilu prądu podczas odczytu.

Rysunek 2. Komponenty metody EFIRM. (A) Metoda ekstrahowania egzosomów z płynu biologicznego z wykorzystaniem magnetycznych mikrocząsteczek powlekanych przeciwciałami anty-human CD63, a następnie uwalnianie zawartości egzosomów poprzez zastosowanie cyklicznych fal prostokątnych do kompleksu cząsteczka-egzosom. (B) Schemat biosensora elektrodowego używanego do wykrywania celów RNA/DNA/białek z uwolnionych egzosomów. (C) Reprezentatywny przykład odczytu amperometrycznego z metodologii EFIRM, gdzie większa wartość prądu odpowiada wyższym poziomom biomolekuły. Ten rysunek pochodzi z pracy Wei et al.¹⁴ Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Walidacja wychwytu egzosomów przez koraliki za pomocą TEM

Izolację egzosomów ze śliny przy użyciu magnetycznych kuleczek anty-CD63 dla ludzi zwalidowano po protokole ekstrakcji, wykorzystując obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). TEM wykazuje kuleczki magnetyczne z ziarnistościami o wielkości 70-100 nm znajdującymi się bezpośrednio obok nich (patrz Rysunek 3A oraz 3B), co jest zgodne ze znanym profilem egzosomów. Nie zaobserwo...

Dyskusja

Jak wskazują wyniki, anty-ludzkie nanocząstki magnetyczne pokryte CD63 są w stanie specyficznie wychwytywać małe cząstki o rozmiarach od 70 do 100 nm. Ta przechwycona cząstka jest zgodna z wcześniej obserwowanym profilem egzosomów. Ponadto wykazano, że użycie niskonapięciowego CSW po wychwyceniu cząstek usuwa je z powierzchni kulki i powoduje profile degradacji DNA podobne do tradycyjnych metod uwalniania ładunku opartych na buforze do lizy. Dane te wskazują, że przepływ pracy uwalniania ładunku egzosomalnego można uproś...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16-kanałowy system czytników Helios z interfejsem chipowym	Genefluidics, Stany Zjednoczone&	nbsp; RS-1000-16
16x Sensor Chip, gołe złoto, zestaw 5 chipów	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
Biotynylowane przeciwciało anty-ludzkie CD63	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne Streptawidin T1	Invitrogen, USA	65601
Magnesy neodymowe (średnica 1/10" x grubość 1/32") K	& J Magnetics, Stany Zjednoczone	DH101
Ultraczysta woda destylowana	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toldeo 3 M KCl Solution	Fisher Scientific, USA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche, Niemcy	11426346910
Substrat 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB/H2O2, niska aktywność)	Neogen, USA	330175
Roztwor soli fizjologicznej buforowany fosforanem	Life Technologies, USA	10010023
Kazeina/PBS	Fisher Scientific, Stany Zjednoczone	37532