Opracowanie inhibitorów oddziaływań białko-białko poprzez REPLACE: zastosowanie do projektowania i rozwoju konkurencyjnych inhibitorów CDK niebędących ATP

Summary

Opisujemy implementację strategii REPLACE do celowania w interakcje białko-białko. REPLACE to iteracyjna strategia obejmująca podejścia syntetyczne i obliczeniowe w celu przekształcenia zoptymalizowanych inhibitorów peptydowych w cząsteczki podobne do leków.

Abstract

REPLACE to unikalna strategia opracowana w celu skuteczniejszego zwalczania interakcji białko-białko (PPI). Jego celem jest poszerzenie dostępnej przestrzeni docelowej leków poprzez zapewnienie ulepszonej metodologii identyfikacji inhibitorów dla takich miejsc wiązania, które stanowią większość potencjalnych celów leków. Głównym celem niniejszego artykułu jest przedstawienie metodologicznego przeglądu stosowania i zastosowania strategii REPLACE, która obejmuje podejścia oparte na chemii obliczeniowej i syntetycznej. Przykładem REPLACE jest jego zastosowanie do rozwoju inhibitorów konkurencyjnych kinaz zależnych od cyklin (CDK) niebędących ATP jako leków przeciwnowotworowych. CDK są często rozregulowane w nowotworach i dlatego są uważane za ważne cele w opracowywaniu leków. Doniesiono, że hamowanie CDK2 / cykliny A w fazie S sprzyja selektywnej apoptozie komórek rakowych w sposób niezależny od p53 poprzez szlak E2F1. Ukierunkowanie na interakcję białko-białko w rowku wiążącym cyklinę (CBG) jest podejściem, które pozwoli na specyficzne hamowanie cyklu komórkowego nad transkrypcyjnymi CDK. CBG rozpoznaje się na podstawie sekwencji konsensusu pochodzącej z substratów CDK i białek supresorowych nowotworu, zwanych motywem wiążącym cyklinę (CBM). CBM został wcześniej zoptymalizowany do oktapeptydu z p21Waf (HAKRRIF), a następnie okrojony do pentapeptydu zachowującego wystarczającą aktywność (RRLIF). Peptydy na ogół nie przenikają przez komórki, są metabolicznie niestabilne, dlatego też zastosowano strategię REPLACE (REplacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment) w celu wygenerowania większej liczby inhibitorów podobnych do leków. Strategia rozpoczyna się od zaprojektowania peptydów hamujących ligowanych fragmentami (FLIP), które selektywnie hamują cykl komórkowy kompleksów CDK/cykliny. FLIP zostały wygenerowane przez iteracyjne zastępowanie reszt HAKRRLIF/RRLIF małymi cząsteczkami przypominającymi fragmenty (grupy capping), zaczynając od N-końca (Ncaps), a następnie zastępując je na C-końcu. Związki te są punktami wyjścia do wytwarzania kompetycyjnych inhibitorów CDK nie-ATP jako leków przeciwnowotworowych.

Introduction

W tym^{artykule opisano studium} przypadku zastosowania strategii REPLACE (Replacement with partial ligand alternatives using computational enrichment) do przekształcania peptydowych inhibitorów interakcji białko-białko w cząsteczki o większym znaczeniu farmaceutycznym. Chociaż IPP stanowią bogate, ale niedostatecznie wykorzystywane źródło potencjalnych celów dla leków, istniejące metodologie są w dużej mierze niewystarczające, aby zapewnić ich szeroki dostęp. Obecne strategie^{, w} tym projektowanie oparte na fragmentach4, wysokoprzepustowe badania^przesiewowe5 i zszywane peptydy6, przyniosły postępy, jednak w wielu przypadkach są one nieskuteczne. W związku z tym potrzebne są większe postępy i skuteczniejsze podejścia. Projekt REPLACE został w pełni przetestowany pod kątem rozwoju inhibitorów kinaz, które mają ulepszone właściwości podobne do leków i mają potencjał do dalszego rozwoju jako terapie przeciwnowotworowe. Strategia ta jest zilustrowana w rozwoju nie-ATP inhibitorów CDK cyklu komórkowego i obejmuje w następujący sposób: 1) uzyskanie 3D informacji strukturalnych na temat interakcji HAKRRLIF/RRLIF z rowkiem wiążącym cyklinę; 2) określenie ważnych determinantów wiązania dla interakcji peptydowej; 3) skrócenie N-końca peptydu zawierającego jeden lub więcej determinantów wiążących; 4) obliczeniowa identyfikacja potencjalnych alternatyw dla małych cząsteczek (częściowe alternatywy ligandów, PLA) dla skróconej części peptydu, które zachowują kluczowe interakcje peptydu macierzystego; 5) synteza lub komercyjne pozyskiwanie PLA, co do których przewiduje się, że będą się zachłannie wiązać z podmiejscem poprzednio zajmowanym przez usuniętą resztę peptydową; 6) synteza FLIPs poprzez ligację najlepszych PLA do skróconego peptydu z wykorzystaniem syntezy w fazie stałej; 7) testowanie FLIPs w teście wiązania in vitro lub teście funkcjonalnym (polaryzacja fluorescencyjna w kontekście CDK/cyklina), a następnie dalsza charakterystyka w teście żywotności komórki. Schematyczne przedstawienie strategii REPLACE pokazano na rysunku 1. W tym artykule omówiono iteracje strategii REPLACE oraz szczegółowo opisano zastosowanie do CDK2/cykliny A. Uważa się, że CDK są bezpośrednio lub pośrednio rozregulowane w większości nowotworów i dlatego są uważane za odpowiednie cele dla leków przeciwnowotworowych⁷. CDK wymagają asocjacji z cyklinami w celu pełnej aktywacji, a następnie fosforylacji kluczowych białek biorących udział w regulacji cyklu komórkowego⁸. Dwie główne grupy CDK to izotypy, które kontrolują punkty kontrolne cyklu komórkowego [G1 / S (CDK4 / cyklina D, CDK6 / cyklina D i CDK4 / cyklina E), faza S (CDK2 / cyklina A) i G2 / M (CDK1 / cyklina B)] oraz regulatory polimerazy RNA poprzez fosforylację (CDK7 / cyklina H, CDK8 / cyklina C, CDK9 / cyklina T). Kluczowy etap progresji fazy S następuje, gdy czynnik transkrypcyjny E2F1 tworzy kompleks z białkiem DP, który następnie wiąże się z DNA i inicjuje transkrypcję genu. CDK2 / cyklina A jest wymagana do neutralizacji aktywności transkrypcyjnej E2F1 poprzez fosforylację, co prowadzi do uwolnienia kompleksu E2F1-DP i jego późniejszej degradacji. Uważa się, że hamowanie CDK2 / cykliny A utrzymuje E2F1 w stanie związanym z DNA, co prowadzi do trwałej aktywacji. Wynikowy poziom aktywności E2F-1 przekroczy próg wymagany do indukcji apoptozy niezależnej od p53, co sugeruje strategię terapeutyczną. Ze względu na rozregulowane szlaki p53 i pRb, wysokie poziomy E2F-1 często występują w komórkach nowotworowych, a hamowanie CDK2 / cykliny A powinno prowadzić do selektywnej apoptozy w nowotworach i może być uważane za zwalidowany cel raka⁷.

Klinicznie badane inhibitory CDK celują w wysoce konserwatywne miejsce wiązania ATP, prowadząc do reaktywności krzyżowej między ponad 500 kinazami białkowymi w ludzkim kinomie i potencjalnie powodując skutki uboczne i toksyczność⁹. Alternatywnym podejściem jest inhibicja kompetycyjna bez ATP poprzez ukierunkowanie rekrutacji substratu przez CBG obecny na podjednostce regulatorowej cyklinowo-dodatniej, a zatem odrębny i odległy od miejsca wiązania ATP^10,11. CBG jest przede wszystkim hydrofobowym rowkiem obecnym w cyklinie A, cyklinie D i cyklinie E i wykazano, że rozpoznaje sekwencję konsensusu znajdującą się w substratach i supresorach guza. Jako wyizolowany peptyd, motyw wiążący cyklinę (CBM) wiąże się z CBG i wykazano, że hamuje aktywność kinazy CDK cyklu komórkowego. CBM został zoptymalizowany do oktapeptydu (HAKRRLIF, CDK2/cyklina A IC₅₀ 0,07±0,02 μM, CDK4/cyklina D, IC₅₀ 0,88±0,34 μM), a ponadto skrócony do pentapeptydu stanowiącego dobry kompromis między masą cząsteczkową dla podobieństwa do leku a siłą działania (RRLIF, CDK2/cyklina A IC₅₀ 1,01±0,17 μM, CDK4/cyklina D, IC₅₀ 25,12±2,97 μM)^12,13. CBG składają się z dużej pierwotnej i mniejszej wtórnej kieszeni hydrofobowej, które są zmostkowane przez region kwaśny (zawiera Glu220, Glu224 i Asp283). Kluczowe determinanty wiązania HAKRRLIF obejmują oddziaływanie Ala2 z wtórną kieszenią hydrofobową, parowanie jonów i wiązania wodorowe Lys3, Arg 4 i Arg5 z regionem kwaśnym oraz wysoki stopień komplementarności Leu6 i Phe8 z pierwotnym miejscem lipofilowym. Ponadto liczne wiązania wodorowe są dostarczane ze szkieletu peptydowego, podczas gdy Ile7 działa jako reszta dystansowa, umożliwiając optymalny kontakt z kieszenią pierwotną. Tryb wiązania i interakcje HAKRRLIF z CBG pokazano na rysunku 2.

Ukierunkowanie na interakcję białko-białko CBM/CBG zahamuje aktywność kinazy CDK2/cykliny A, CDK2/cykliny E i CDK4/cykliny D, co powinno wywołać apoptozę komórek nowotworowych za pośrednictwem E2F1, nie wpływając na normalne komórki⁷. Chociaż peptydy pochodzące z CBM są skutecznymi inhibitorami CDK cyklu komórkowego, jest mało prawdopodobne, że będą przydatne jako leki ze względu na ich niestabilność metaboliczną i ogólny brak przepuszczalności komórek. W tym celu zastosowaliśmy strategię REPLACE w celu przekształcenia tych silnych inhibitorów peptydowych w związki bardziej podobne do leków w celu dalszego rozwoju terapii przeciwnowotworowych wykorzystujących rozregulowany E2F1 poprzez hamowanie CDK2 / cykliny A. Poniższy protokół podsumowuje prace, które zostały zakończone w zakresie zastosowania REPLACE do rowka cyklinowego. W pierwszej kolejności zidentyfikowano podobne do leków zamienniki grupy cappingowej dla N-końcowego tetrapeptydu HAKRRLIF. Ponadto poprawę w tych grupach zbadano w dodatkowym badaniu walidacyjnym dla REPLACE. Przedstawiono również reprezentatywne wyniki tych badań.

Protocol

1. Obliczeniowa identyfikacja potencjalnych grup ograniczających małe cząsteczki

Uwaga: Zasadniczo, różne metody dokowania lub wyszukiwania farmakoforów mogą być używane do przewidywania potencjalnych grup cappingowych. Głównym celem badań obliczeniowych w REPLACE jest identyfikacja małych cząsteczek, które zachowują cechy i interakcje podstawionych aminokwasów.

1. Walidacja protokołu dokowania LigandFit¹⁴

Uwaga: W poprzednich badaniach metoda dokowania (LigandFit¹⁵, moduł w pakiecie programów do modelowania molekularnego, Discovery Studio 3.0) została zweryfikowana, aby upewnić się, że ten algorytm jest wystarczający do odtworzenia trybów wiązania znanych Ncaps i pokazania, że wyniki uzyskane dla nieznanych związków są predykcyjne¹⁴.

1. Wykonując następujące kroki (1.2 – 1.5), zidentyfikuj optymalne parametry dla LigandFit w następujący sposób: sieć energetyczna PLP1 do generowania póz, minimalizacja generowanych pozycji i funkcja punktacji PLP1 do analizy póz.
2. W celu ograniczenia otrzymanych konformacji i odpowiedniego rozmieszczenia ligandów do tworzenia wiązań kowalencyjnych w peptydzie z czapeczką, należy ustawić atomy azotu indolowego i azotu amidowego odpowiednio Trp217 i Gln254 jako filtry oddziaływań dla wiązań wodorowych.
3. Zaprojektuj i zadokuj bibliotekę alternatywnych fragmentów do receptora CDK2/cykliny A (2UUE). Nadaj priorytet potencjalnym grupom ograniczającym do syntezy i pozyskiwania komercyjnego w oparciu o punktację PLP1, interakcje z filtrami interakcji i komplementarność z CBG. Poszczególne kroki wymagane do dokowania LigandFit są następujące.

2. Przygotowanie miejsca wiązania receptora¹⁴
   1. Zaimportuj strukturę krystaliczną CDK2/cykliny A (identyfikator pdb: 2UUE) do okna wizualizacji w oprogramowaniu. Struktura ta zawiera wcześniej zidentyfikowany FLIP 5-metylo-1-fenylo-1H-1,2,4-triazol-3-karboksyamido(3,5-DCPT)RLIF związany z rowkiem cykliny (ryc. 3).
   2. Usunąć lub pozostawić na miejscu pozostałości RLIF (C-koniec). Gdy sekwencja peptydowa zostanie zachowana, użyj N-końcowej grupy aminowej peptydu jako filtra interakcji dla liganda. Z narzędzi "Interakcje receptor-ligand" utwórz sferę wokół N-cap 3,5-DCPT ze sfery Pokaż/Ukryj miejsce. Kula jest tworzona w celu zdefiniowania aktywnego regionu w miejscu wiązania, w którym podczas wiązania mogą zachodzić interakcje ligand-receptor
   .
   3. Zdefiniuj miejsce wiązania dalej od "znajdź miejsce jako objętość wybranego liganda" i usuń ligand 3,5-DCPT z białka. Wykonaj ten krok, aby zdefiniować objętość wiązania w utworzonej sferze.
   4. Ustaw atomy azotu indolowego i azotu amidowego reszt Trp217 i Gln254 jako filtry interakcji dla wiązań wodorowych. Ustaw filtry interakcji w taki sposób, aby tylko te ułożenia, które oddziałują z atomami osadzonych reszt, były filtrowane podczas procesu dokowania, zachowując w ten sposób ważne interakcje w zadokowanych pozycjach.
3. Przygotowanie ligandów¹⁴
   1. Zaprojektuj bibliotekę 100 potencjalnych grup ograniczających w oparciu o kryteria, w tym masę cząsteczkową mniejszą niż 500, obecność grupy karboksylowej do ligacji ze skróconym peptydem i włączenie odpowiednich grup hydrofobowych (podstawiona grupa fenylowa) dla interakcji van der Waalsa w kieszeni wtórnej, jak pokazano w tabeli 1.
   2. Wybierz pierścienie heterocykliczne do naśladowania oddziaływań wiązań wodorowych peptydów z Trp217 i podstawniki zawarte do wymiany oddziaływań parowania jonów podstawowych łańcuchów bocznych HAKRRLIF. Zadokuj ligandy jako odpowiednie cząsteczki aldehydu, tak aby tlen karbonylowy mógł oddziaływać z atomem azotu amidowego Gln254, podobnie jak szkielet peptydu w peptydzie macierzystym (tabela 1).
   3. Przed dokowaniem należy zminimalizować zaprojektowane ligandy do konformacji niskoenergetycznej i przygotować w odpowiednim stanie jonizacji przy użyciu protokołu "Przygotuj ligandy". Narysuj i wyeksportuj te potencjalne N wersalików w formacie pliku .sdf w ChemDraw dla arkusza kalkulacyjnego przed zaimportowaniem do oprogramowania.
      Uwaga: Protokół przygotowania ligandów służy do zminimalizowania wszystkich ligandów, które mają być zadokowane do ich najniższych stanów energetycznych, a ładunki jonizacji zostały zastosowane do odpowiednich atomów. W tym kroku używane są parametry domyślne.
4. Dokowanie ligandów w rowku cykliny A¹⁴
   1. Wybierz procedurę LigandFit z zestawu protokołów interakcji receptor-ligand w oprogramowaniu. Użyj receptora i przygotowanych ligandów jako danych wejściowych dla tego protokołu.
   2. Dla tych przebiegów wybierz PLP1 jako sieć energetyczną, określ, że upozy mają być zminimalizowane, a liczba wygenerowanych póz jako 10. Pozostaw wszystkie inne parametry z wartościami domyślnymi.
      Uwaga: LigandFit to metoda dokowania, która może identyfikować i generować pozy o wysokiej komplementarności i potencjalnym powinowactwie do miejsca aktywnego białka za pomocą filtra porównawczego opartego na kształcie, który jest połączony z algorytmem wyszukiwania konformacyjnego Monte Carlo. Sieć energetyczna wykorzystywana przez program dokowania jest polem siłowym do generowania oddziaływań ligand-receptor i potencjalnych pozycji. PLP1 to odcinkowy potencjał liniowy, który w szczególności nadaje priorytet oddziaływaniom wiązań wodorowych i gdzie typ atomu PLP jest przypisywany do każdego atomu liganda niebędącego wodorem lub atomu receptora niewodorowego.
5. Analiza wyników
   1. W pierwszej kolejności wyświetl pozy w programie wizualizatora, a następnie posortuj według malejących wartości wyniku PLP1. Użyj funkcji oceniania, takich jak PLP1, aby oszacować powinowactwo wiązania zadokowanego liganda na podstawie geometrii pozycji liganda kandydującego i interakcji niekowalencyjnej ze strukturą receptora docelowego.
      Uwaga: W tym przypadku stwierdzono, że funkcja punktacji PLP1 daje najlepsze wyniki, ponieważ obejmuje oszacowanie wiązań wodorowych.
   2. Przeanalizuj wizualnie górne 25% ocenianych póz pod kątem 1) nakładalności ze znaną grupą ograniczającą (o względnej wartości średniego odchylenia kwadratowego (RMSD) mniejszej niż 2 A), 2) spełnionych filtrów interakcji i 3) komplementarności wizualnej z rowkiem cykliny. Przyjmuje się, że prawidłowo zadokowana pozycja (w porównaniu ze strukturą eksperymentalną) ma wartość RMSD < 2 A.
   3. Zbadaj pozy pod kątem komplementarności wizualnej, która jest definiowana jako skuteczne wypełnienie kieszeni wiążącej w sposób zgodny ze znanymi relacjami struktura-aktywność. Filtry interakcji są ustawione tak, aby zawierały ograniczenia atomów, które wymagają kontaktów międzycząsteczkowych, o których wiadomo, że są krytyczne dla wiązania i/lub są wymagane do umieszczenia potencjalnej grupy ograniczającej w odpowiedniej geometrii dla tworzenia wiązania amidowego. Na rysunku 4 przedstawiono trzy przykłady zadokowanych pozycji potencjalnych grup N-cappingowych tworzących wiązania wodorowe z filtrami oddziaływań.

2. Synteza i charakterystyka potencjalnych grup N-cappingu

1. Synteza grup N-cappingowych.
2. Do syntezy należy użyć wszystkich dostępnych na rynku materiałów wyjściowych, rozpuszczalników i odczynników w takiej postaci, w jakiej zostały uzyskane. Zsyntetyzuj potencjalne grupy N-cappingowe za pomocą konwencjonalnej syntetycznej chemii organicznej (na przykład rysunek 5^12,13).
3. Przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową (TLC) na żelu krzemionkowym w celu monitorowania reakcji.
   1. Rozpuścić materiał wyjściowy i mieszaninę reakcyjną (1 mg) w fazie ruchomej i umieścić je na płytce TLC za pomocą kapilarnek.
   2. Umieścić płytkę TLC w komorze zawierającej fazę ruchomą (octan etylu i heksan w stosunku 35:65). Gdy faza ruchoma osiągnie 90% powierzchni płytki TLC, wyjmij ją i wysusz na powietrzu.
   3. Użyj światła UV, aby wykryć materiał wyjściowy i mieszaniny reakcyjne jako widoczne plamy. Obliczyć R_f wszystkich plamek (stosunek odległości przebytej przez plamkę do fazy ruchomej).
      Uwaga: Reakcja jest zakończona, gdy nie widać plamki w R_f materiału wyjściowego.
4. Po zakończeniu reakcji rozprowadzić mieszaninę reakcyjną, umieszczając ją w rozdzielaczu i przemłukując odpowiednio wodnym roztworem kwasu lub zasady. Zebrać rozpuszczalnik organiczny, odparować go w wyparce obrotowej i wysuszyć otrzymany w próżni surowy produkt.
5. Rozpuścić 500 mg produktu surowego w 3-5 ml odpowiedniego rozpuszczalnika i dodać do 1 g próbki krzemionki lub RP18 i wysuszyć pod powietrzem. Umieścić próbkę zawierającą produkt surowy we wkładach flash z krzemionką/RP SNAP i oczyścić surowy materiał za pomocą zautomatyzowanej wysokosprawnej chromatografii flash (zgodnie z protokołem producenta) przy użyciu kolumny SNAP 100 g z gradientem rozpoczynającym się od 6% octanu etylu: 94% heksanów do 50% octanu etylu i 50% heksanów w 15 objętościach kolumn.
6. Oczyszczony produkt zebrany w rozpuszczalniku z chromatografii błyskawicznej wysuszyć za pomocą wyparki obrotowej, odparowując cały rozpuszczalnik do sucha, a następnie wysuszyć produkt w próżni w celu usunięcia wszystkich pozostałości rozpuszczalników. Wykonać charakterystykę oczyszczonego produktu za pomocą NMR, MS i analitycznej HPLC.
   1. Dla ¹H NMR i ¹³C NMR zważyć około 10 mg oczyszczonej próbki, rozpuścić ją w odpowiednim rozpuszczalniku deuterowanym i przenieść zawartość do suchej probówki NMR w celu zarejestrowania widm NMR^2,14.
   2. Rejestruj widma ¹H NMR i ¹³C NMR za pomocą spektrometru NMR o wysokim polu (minimum 300 MHz). Pomiar widm masowych za pomocą spektrometru masowego QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), jonizacji elektrorozpylającej (ESI) lub VG 70S (spektrometr masowy z podwójnym ogniskowaniem sektora magnetycznego, EI)^2,14.
   3. Analizować czystość produktów za pomocą HPLC za pomocą detektora diodowo-matrycowego i wyposażonego w kolumnę C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 μm do analizy. Użyj gradientu, zaczynając od 100% wody (0,1% kwasu trifluorooctowego) do 60% acetonitrylu (0,1% kwasu trifluorooctowego) przez 30 minut i utrzymuj gradient przez 4 minuty. Ekstrahować chromatogramy przy 226 i 254 nm^2,14,
      Uwaga: Czystość analityczna ocenianych związków wynosiła > 95%.

3. Synteza fazy stałej do generowania FLIPów ²

1. Synteza N-rdzeniowych FLIP
   1. Złożyć N-osłonowe związki peptydowe za pomocą standardowych metod syntezy w fazie stałej, wykonując następujące kroki.
      1. Aktywuj 5 równoważników C-końcowego aminokwasu (Fmoc-Phe) w 4,4 równoważnikach O-benzotriazola-N,N,N',N',N'--tetrametylo-uronowo-heksafluoro-fosforanu (HBTU, 221,93 mg) w 2 ml DMF przez 5 min. Załaduj mieszaninę Fmoc-Phe HBTU na żywicę lodowiska, używając 6 równoważników diizopropyloetyloaminy (DIPEA, 103,13 mg) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      2. Usunąć grupę ochronną Fmoc z pozostałości C-końcowej za pomocą 20% piperydyny w 3 ml DMF przez 10 min. Połącz kolejne aminokwasy (np. Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-pmc) krok po kroku. Na każdym etapie połącz 5 ekwiwalentów następnego aminokwasu za pomocą 6 równoważników DIPEA (103,13 mg) i 4,4 równoważników HBTU (221,93 mg) w 2 ml DMF przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      3. Stosować cykle mycia (5 x 10 ml DMF + 5 x 10 ml DCM) po opisanych powyżej etapach sprzęgania aminokwasów i deprotekcji Fmoc. Po złożeniu peptydów połącz grupy N-cappingowe za pomocą 6 równoważników DIPEA (103,13 mg) i 4,4 równoważników HBTU (221,93 mg) w 2 ml DMF przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      4. Po zakończeniu składania peptydów należy potraktować mieszaninę reakcyjną 2 ml mieszaniny rozszczepialnej (90:5:5 TFA/H₂O/KOŃCÓWKI) O/N, aby usunąć grupy chroniące łańcuch boczny i rozszczepić FLIPy z żywicy. Otrzymany produkt należy rozcierać zimnym eterem dietylowym w celu wytrącenia i, jeśli to konieczne, zagęścić w wyparce obrotowej.
2. Synteza FLIP z N-capped-C-cap
   1. Zważyć i rozpuścić N-końcowy i chroniony peptyd Arg-Leu (16,1 mg, 0,02 mmol) w dichlorometanie i dodać [4-(3-chlorofenoksy)pirydyn-2-ylo]metanaminę (C-kap) wraz z Heksafluorofosforanem O-benzotriazolu (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) i N,N-diizopropyloetyloaminą (DIPEA; 6,5 mg, 0,02 mmol).
   2. Wymieszać i monitorować reakcję w temperaturze pokojowej do momentu, gdy TLC/HPLC wskaże całkowite zużycie materiału wyjściowego. Po zakończeniu reakcji należy zagęścić surową mieszaninę reakcyjną za pomocą wyparki obrotowej, a następnie rozdzielić octan etylu na wodę.
   3. Oddzielić warstwę wodną od organicznej; przemyć warstwę organiczną 1 N NaOH, 1 N HCl i solanką. Wysuszyć warstwę organiczną około 1 g siarczanu sodu i zagęścić produkt w wyparce obrotowej. Na koniec potraktuj produkt O/N mieszaniną rozszczepienia (95:2,5:2,5 kwas trifluorooctowy/_H2O/KOŃCÓWKI) w celu odprotekcji.
   4. Otrzymany produkt należy rozcierać zimnym eterem dietylowym i, jeśli to konieczne, zagęścić w wyparce obrotowej do całkowitego wysuszenia w celu usunięcia całego rozpuszczalnika. Dalej suszyć produkt w próżni, aby usunąć wszystkie pozostałości rozpuszczalników.
3. Oczyszczanie i charakterystyka FLIP
   1. Oczyszczać surowe FLIP za pomocą półpreparatywnych metod HPLC z odwróconymi fazami. Liofilizować oczyszczone FLIP i scharakteryzować ich masę cząsteczkową za pomocą spektrometrii^{mas 2,14}.
   2. Oznaczyć czystość analityczną FLIP metodą HPLC za pomocą detektora diodowego i wyposażonego w kolumnę C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 μm. Stosować metodę gradientową zaczynając od 95%_H2O(0,1% kwasu trifluorooctowego)/5% acetonitrylu (0,1% kwasu trifluorooctowego) do 35%_H2O(0,1% kwasu trifluorooctowego)/65% acetonitrylu (0,1% kwasu trifluorooctowego) przez 30 minut i utrzymywać gradient przez 4 minuty. Ekstrahować chromatogramy przy długości fali 226 i 254 nm.

4. Test wiązania polaryzacji fluorescencji do oznaczania wiązania konkurencyjnego ^2,14

1. Przeprowadzić test na czarnych płytkach 384-dołkowych (138 μl), stosując następującą procedurę.
2. Rozcieńczyć próbki, peptydy znacznikowe (4 nM) i kompleksy kinaz (CDK2 / cyklina A - 18 μg / ml, CDK4 / cyklina D - 37 μg / ml) do wymaganych stężeń w buforze testowym (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM ditiotreitol (DTT).
3. Do każdego dołka płytki 384-dołkowej dodać: 5 μl CDK4D1 lub CDK2CA (0,3 μg/dobrze oczyszczony rekombinowany kompleks kinazy ludzkiej), 5 μl roztworu złożonego, 5 μl peptydu znacznikowego 30 nM (fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-(3ClPhe)-Gly lub peptyd znacznikowy fluoresceinylo-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly). Użyj 5 μl każdego DMSO (6%), buforu, znacznika i 5 μl DMSO (6%), kompleksu kinazy, znacznika jako studzienek kontrolnych
4. Po dodaniu wszystkich składników, odwirować płytkę z prędkością 500 obr./min przez 1 minutę (41,16 x g) w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować płytkę z mieszaniem przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą wielomodowego czytnika płytek i detektora wyposażonego w filtry wzbudzenia/emisji 485 nm/535 nm i lustro dichroiczne odczytać intensywność fluoresceiny w każdym dołku w płytce.
5. Obliczyć względną średnią polaryzację (mp) dla wszystkich badanych próbek, korzystając z równania pokazanego poniżej. Określ wartości IC₅₀ za pomocą regresji logarytmicznej, korelując względne mps i testując stężenia.

Results

Interakcje HAKRRLIF z rowkiem cykliny są pokazane na rysunku 2. Reszty peptydowe, które reprezentują kluczowe determinanty wiązania, obejmują Ala2, Arg4, Leu6 i Phe8 z innymi resztami zapewniającymi mniejszy wkład^12,13,18. W tym studium przypadku strategia REPLACE została wykorzystana w celu znalezienia alternatyw dla fragmentów dla reszt w N-końcowym tetrapeptydzie HAKRRLIF, przede wszystkim naśladując interakcje Ala2 i Arg4. Biblioteka potencjalnych fragmentów Ncap (Tabela 1...

Discussion

Celowanie w interakcje białko-białko (PPI) w odkrywaniu leków jest bardzo trudne, ponieważ zazwyczaj obejmują one duży, płytki interfejs kontaktowy składający się z licznych i rozproszonych kontaktów¹⁹. Ponadto związki peptydowe, które hamują IPP, które są podatne na odkrycie leków, są problematyczne ze względu na ich większą masę cząsteczkową, niestabilność metaboliczną i słabą biodostępność²⁰. Obecne strategie, które zostały zastosowane do opracowania inhibitorów IPP, obejmują projektowanie proteo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemia obliczeniowa
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex Workstations
Synthetic organic chemistry
Żel krzemionkowy (płytki GF-254) do TLC, Biotage (Uppsala, Szwecja) do chromatografii flash, Waters Alliance 2695 HPLC z 2996 detektor diodowo-matrycowy wyposażony w C18 (2) 100 A, 250 x 4,6  mm, 5  μ m kolumna (Phenomenox Luna) do oznaczania czystości, widma 1H NMR i 13C NMR zarejestrowano odpowiednio za pomocą spektrometru Varian Mercury 300 i 400. Widma masowe mierzono za pomocą spektrometru mas Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), jonizacji elektronrozpylanej (ESI) i VG 70S (spektrometr mas z podwójnym ogniskowaniem sektora magnetycznego, EI).
Test polaryzacji fluorescencji
384 płytki mikrodołkowe, mikropipety	Grenier Bio-one	110256602
CDK4D1 i CDK2CA (dobrze oczyszczony rekombinowany kompleks kinazy ludzkiej)	BPS Bio Sciences	40094(CDK4/Cyklina D), 41101(CDK2/Cyklina A)
Bufor testowy (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1  mM ditiotretol (DTT))25
nM HEPES	CALBIOCHEM
NaCl	Fisher	127838
Nonidet P-40	US Biological	N3500
DTT	Aldrich-70
° C zamrażarka	Revco (Ultima II)
Detektor wielomodowy DTX880 wyposażony w 485  nm/535  Filtry wzbudzenia/emisji nm i zwierciadło dichroiczne odpowiednie do fluoresceiny	Beckman Coulter, Brea, CA
Cell Culture
96 dołków	Fisher
Zamrożone zapasy linii komórkowych U2OS (kostniakomięsak) i DU145 (rak prostaty)	Surowica ATCC
NU, podłoże DMEM, trypsyna, PEN/STRIP, odczynnik	MTTFisher, technologia życia, Heamocytometr Alfa Aesar
	VWR-70
° C zamrażarka	: Revco (Ultima II)
Inkubator	Thermo electron corporation
Wirówka	: Eppendorf	5804 R
Lodówka: 4-8 ° C	Isotemp Fisher
DTX880 wyposażony w 595  nm filter	Beckman Coulter, Brea, CA