Integracja plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozonu ze strefą podkomorową noworodków myszy w celu wygenerowania nowych modeli glejaka

Podsumowanie

Tutaj opisujemy skuteczny i wszechstronny protokół do indukcji, monitorowania i analizy nowych glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o histopatologicznej charakterystyce ludzkiego GBM.

Streszczenie

Istnieje pilna potrzeba przetestowania udziału nowych genów w patogenezie i progresji ludzkich glejaków (GBM), najczęstszego pierwotnego guza mózgu u dorosłych z ponurymi rokowaniami. Szybko pojawiają się nowe potencjalne terapie, które wymagają systematycznego testowania na modelach eksperymentalnych, które ściśle odwzorowują istotne cechy choroby ludzkiej. W tym artykule szczegółowo opisujemy metodę indukowania nowych modeli GBM z transpozonową integracją plazmidowego DNA z komórkami strefy podkomorowej noworodków myszy. Przedstawiamy prosty sposób klonowania nowych transpozonów nadających się do integracji genomowej za pomocą systemu transpozonów Sleeping Beauty oraz ilustrujemy, jak monitorować wychwyt plazmidu i postęp choroby za pomocą bioluminescencji, histologii i immunohistochemii. Opisujemy również metodę tworzenia nowych pierwotnych linii komórkowych GBM. Idealnie byłoby, gdyby raport ten umożliwił dalsze rozpowszechnianie systemu transpozonów Sleeping Beauty wśród badaczy nowotworów mózgu, prowadząc do dogłębnego zrozumienia patogenezy i progresji GBM oraz do terminowego projektowania i testowania skutecznych terapii dla pacjentów.

Wprowadzenie

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym (60%) pierwotnym guzem mózgu u dorosłych, z medianą przeżycia 15-21 miesięcy podczas leczenia chirurgicznego, radioterapii i chemioterapii¹. Konieczne są nowatorskie terapie GBM. Terapie eksperymentalne wymagają testowania na modelach zwierzęcych, które odpowiednio odtwarzają istotne cechy choroby u człowieka. Strategie indukcji GBM u gryzoni obejmują mutagenezę chemiczną z czynnikami alkilującymi, zmiany genetyczne w linii zarodkowej lub somatyczne lub przeszczep przy użyciu linii komórkowych glejaka². Najczęściej stosowane modele wykorzystują implantację linii komórkowych glejaka, ortotopowo, do mózgu lub podskórnie przy użyciu komórek syngenicznych u zwierząt o identycznym genotypie; lub komórki ksenogeniczne, najczęściej ludzkie linie komórkowe GBM, wszczepione myszom z obniżoną odpornością³. Ksenoprzeszczepy oferują wiele korzyści w badaniu guzów wewnątrzczaszkowych: wygodę odtwarzalności, standaryzowane tempo wzrostu, czas zgonu i lokalizację guza. Modele te mają jednak ograniczenia ze względu na sztuczne, inwazyjne podejście chirurgiczne stosowane do implantacji oraz ograniczoną zdolność do dokładnego odtworzenia cech histologicznych charakterystycznych dla ludzkiego GBM (IV stopień wg WHO): martwicę pseudo-pallisadową, atypię jądrową, inwazję rozlaną, proliferację mikronaczyniową i powstawanie nieprawidłowości naczyniowych kłębuszków nerkowych^4-7. Indukcja GBM poprzez zmianę genomu komórek somatycznych z onkogennym DNA, albo z wektorami wirusowymi^8-12, albo z integracją za pośrednictwem transpozonów¹³, wierniej odtwarza etiologię choroby człowieka i podsumowuje histutopatologiczne cechy ludzkiego GBM.

Historycznie rzecz biorąc, nowotwory OUN były klasyfikowane na podstawie postrzeganej komórki pochodzenia, która, jak zaobserwowano, byłaby czynnikiem predykcyjnym dla przeżycia¹⁴. GBM dzielą się na pierwotne i wtórne. Pojawiające się obecnie dowody wskazują na wysoce niejednorodny charakter glejaka pierwotnego¹⁵ . Wtórny GBM (15%), będący wynikiem złośliwej transformacji gwiaździaków o niskim stopniu złośliwości (stopień I wg WHO) i gwiaździaków anaplazyjnych (stopień II wg WHO), wiąże się z wcześniejszym wystąpieniem choroby, lepszym rokowaniem i "proneuralnym" wzorcem ekspresji genów, podczas gdy pierwotny GBM (85%) wykazuje późny początek, złe rokowanie i wzorce ekspresji glejowej (klasycznej), neuronalnej lub mezenchymalnej. To, czy te wzorce ekspresji genów korelują z rzeczywistą komórką, z której pochodzi guz, jest nadal aktywnie badane. Coraz więcej danych pokazuje, że kombinacja mutacji genetycznych związanych z GBM jest predyktorem przeżycia. Na przykład utrata heterozygotyczności (LOH) chromosomów 1p/19q, mutacje IDH1, amplifikacje PDGFRα są związane z wtórnymi GBM, proneuronalnym wzorcem ekspresji i lepszym rokowaniem, podczas gdy nadekspresja EGFR, aktywacja szlaku Notch i Sonic hedgehog, utrata Nf1 i PTEN oraz mutacje p53 są skorelowane z neuronalnym, klasycznym lub mezenchymalnym pierwotnym GBM i gorszym rokowaniem^16,17. Pojawienie się projektów sekwencjonowania na dużą skalę i nagromadzenie wielu próbek pacjentów dostępnych do badań przynosi bogactwo nowych informacji w odniesieniu do mutacji genetycznych i szlaków związanych z patogenezą i progresją GBM oraz możliwości zindywidualizowanej medycyny, w której terapie mogą być specjalnie dostosowane do nieprawidłowości genetycznych pacjenta. Ostatecznie, aby ocenić wartość predykcyjną tych mutacji i szlaków w sposób systematyczny oraz przetestować możliwe metody leczenia w każdym przypadku, potrzebne są modele zwierzęce GBM z wcześniej określonymi zmianami genetycznymi. Integracja genomowego DNA za pośrednictwem transpozonów oferuje wykonalne podejście.

System transpozonów Śpiąca Królewna, należący do klasy transpozonów Tc1/mariner, został "przebudzony" (skonstruowany) w wieloetapowym procesie mutagenezy specyficznej dla miejsca z genu transpozazy łososiowatych, który został uśpiony ponad 10 milionów lat temu^18,19. W istocie, transpozony DNA otoczone określonymi sekwencjami (powtórzenia odwrócone/powtórzenia bezpośrednie: IR/DR) mogą być zintegrowane z genomem w sposób "wytnij i wklej" za pomocą aktywności transpozazy Śpiącej Królewny. Transpozaza rozpoznaje końce miejsc IR, wycina transpozon i integruje go losowo z innym miejscem DNA między zasadami T i A, zasadami, które są duplikowane na każdym końcu transpozonu podczas transpozycji (ryc. 1a). Transpozaza Śpiącej Królewny składa się z trzech domen: domeny wiążącej transpozon, sekwencji lokalizacji jądrowej i domeny katalitycznej. Cztery cząsteczki transpozazy są wymagane, aby zbliżyć do siebie dwa końce transpozonu i umożliwić transpozycję, jednak jeśli obecnych jest zbyt wiele cząsteczek transpozazy, mogą one dimeryzować i tetrameryzować, aby zahamować reakcję transpozycji²⁰. Skuteczna reakcja transpozycji wymaga optymalnego stosunku transpozazy do transpozonów. DNA kodujące transpozazę może być dostarczane na tym samym plazmidzie z transpozonem (w cis) lub na innym plazmidzie (w trans). Aby zapewnić optymalny stosunek między transpozazą a transpozonami, można wybrać promotor o odpowiedniej aktywności do ekspresji transpozazy (dla modelu "cis") lub stosunek plazmidów w roztworze do wstrzykiwań może być zoptymalizowany (dla modelu "trans"). System transpozonów Sleeping Beauty może być z powodzeniem stosowany w genomice funkcjonalnej, mutagenezie insercyjnej, transgenezie i somatycznej terapii genowej²¹. Będąc syntetycznym konstruktem przeprojektowanym na funkcjonalną cząsteczkę z uśpionego wariantu łosmonoidu, transpozaza Śpiącej Królewny nie wiąże się z innymi transpozonami u ludzi lub innych^ssaków. Od czasu jego odkrycia, inżynieria molekularna zwiększyła skuteczność transpozycji systemu transpozonów SB poprzez zmiany w sekwencjach IR i dodanie dinukleotydów TATA flankujących transpozon, w wyniku czego powstały transpozony pT2. Transpozony te zoptymalizowały wiązanie SB z miejscem IR i zwiększyły skuteczność wycinania. Transpozaza SB również uległa znacznej poprawie; transpozaza stosowana w eksperymentach przedstawionych w niniejszym dokumencie to SB100X, nadpobudliwa transpozaza generowana przez strategię tasowania DNA, a następnie badanie genetyczne na dużą skalę w komórkach ssaków²².

W tym raporcie prezentujemy szybką, wszechstronną i powtarzalną metodę indukowania wewnętrznego GBM u myszy z niewirusową, transpozonową integracją plazmidowego DNA z komórkami strefy podkomorowej noworodków^{myszy 23}. Przedstawiamy prosty sposób tworzenia transpozonów z nowymi genami podatnymi na integrację genomiczną przy użyciu transpozazy Śpiącej Królewny i pokazujemy, jak monitorować wychwyt plazmidu i postęp choroby za pomocą bioluminescencji. Charakteryzujemy również cechy histologiczne i immunohistochemiczne GBM odtworzonego za pomocą tego modelu. Ponadto przedstawiamy szybką metodę generowania pierwotnych linii komórkowych GBM z tych nowotworów. Model Śpiącej Królewny, w którym nowotwory są indukowane z komórek pierwotnych do zwierzęcia, pozwala na funkcjonalną ocenę roli genów kandydujących na GBM w indukcji i progresji nowotworów. System ten doskonale nadaje się również do testowania nowatorskich metod leczenia GBM, w tym terapii immunologicznych u myszy immunokompetentnych, bez konieczności inwazyjnych zapalnych zabiegów chirurgicznych, które mogą zmieniać lokalne mikrośrodowisko.

Protokół

UWAGA: Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Michigan (UCUCA).

1. Klonowanie interesującej sekwencji do nowych transpozonów Śpiącej Królewny

UWAGA: Aby wprowadzić geny lub elementy hamujące (jako shRNA) za pomocą systemu transpozazy Śpiącej Królewny, sklonuj interesującą sekwencję do szkieletu plazmidu pKT lub pT2. Skieruj klonowanie w taki sposób, aby elementy regulatorowe, gen będący przedmiotem zainteresowania i markery pozostały otoczone odwróconymi powtórzeniami (IR / DR). Przykład klonowania PDGFβ do szkieletu pKT jest szczegółowo opisany poniżej (patrz również rysunek 1b).

1. Trawić 5 μg wektora plazmidowego pKT-IRES-Katushka przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z 5-10 jednostkami enzymów restrykcyjnych XbaI/XhoI w 50 μl objętości reakcji.
2. Trawić cDNA mPDGFβ o wielkości 5 μg plazmidu pGEM-T- mPDGFβ przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z 5-10 jednostkami enzymów restrykcyjnych NcoI/SacI.
3. Wytrącić całkowite DNA, dodając 2,5 objętości 100% etanolu i 1/10 objętości octanu 3 M Na, pH 5,8 i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
4. Odwirować próbki o masie 13 800 x g przez 15 minut.
5. Przemyć osad DNA 500 μl 70% etanolu, odwirować przy 13 800 x g przez 1 minutę, powtórzyć raz i ponownie zawiesić w 19 μl sterylnej wody wolnej od DNaz.
6. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta zawartymi w zestawie do szybkiego tępienia, aby stępić końce zarówno wektora (pKT-IRES-Katushka), jak i wkładki (mPDGFβ).
7. Załaduj stępiony wektor i włóż 1,2% żel agarozowy barwiony bromkiem etydyny i uruchom pod napięciem 80 V przez 40 minut. Uwidocznij pasma, wytnij je czystą żyletką, a żel oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania żelu zgodnie z protokołem producenta.
8. Zwiąż wstawkę i DNA wektora oczyszczone w kroku 1.7, dodając je do probówki w stosunku molowym 4:1 (wstaw:wektor). Do tej probówki odpipetować 1 μl ligazy T4 i 2 μl buforu ligazy T4 (zawierającego ATP) i dostosować objętość do 20 μl sterylną wodą. Inkubować reakcję ligacji przez 18 godzin w temperaturze 16 °C.
9. Przekształć chemicznie kompetentne komórki bakteryjne DH5α za pomocą zligowanych produktów.
   1. Rozmrozić właściwe komórki na lodzie.
   2. Dodać całą objętość reakcji ligacji do 50 μl kompetentnych komórek, delikatnie wstrząsnąć probówką i inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut. Bakterie poddawać szokowi termicznemu przez 45 sekund w temperaturze 42 °C i natychmiast powrócić do lodu; inkubować na lodzie przez kolejne 2 minuty.
   3. Dodać 950 μl bulionu Luria do kultury i inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Odwirować bakterie przy 2 400 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić osad w 200 μl LB.
   4. Rozprowadzić przekształcone bakterie na szalce Petriego pokrytej LB-agarozą i odpowiednim antybiotykiem. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
   5. Na koniec zebrać 5-10 kolonii bakteryjnych i hodować je przez noc w temperaturze 37 °C w 5 ml pożywki LB z antybiotykiem.
   6. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą mini zestawu plazmidowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj diagnostyczny przegląd ograniczeń, aby zweryfikować prawidłowe włączenie wstawki do wektora i prześlij dodatnie klony do sekwencjonowania DNA, aby zapewnić właściwą orientację wstawki.
10. Wybierz odpowiednie kolonie i zwiększ produkcję DNA za pomocą wysokiej jakości zestawu do przygotowania plazmidu wolnego od endotoksyn.
11. Eluuj DNA w sterylnej wodzie lub 1 mM Tris-HCl. DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do wstrzyknięcia noworodkom.

2. Zastrzyki dokomorowe u noworodków

1. Trzy do czterech tygodni przed eksperymentem ustaw klatkę hodowlaną myszy z jednym samcem i jedną samicą myszy oraz plastikowym kolorowym igloo. Zapewnia to wzbogacone środowisko i wspomaga proces krycia.
2. Gdy ciąża zostanie potwierdzona, przenieś samca do nowej klatki. Osiemnaście dni po kryciu codziennie monitoruj klatkę pod kątem porodu. Wykonaj zastrzyki dokomorowe w 1. dniu po urodzeniu (P1).
3. Przygotowanie roztworu do wstrzykiwań
   UWAGA: Roztwór do wstrzykiwań wytwarza się przez zmieszanie plazmidowego DNA z odczynnikiem do transfekcji w celu wytworzenia cząstek do transfekcji. Poniżej znajduje się przykład przygotowania roztworu do wstrzykiwań z użyciem plazmidu kodującego transpozazę Śpiącej Królewny i lucyferazy: pT2/SB100x-Luc oraz dwóch plazmidów transpozonowych: pT/CAGGS-NRASV12 i pT/CMV-SV40-LgT, w stosunku 1:2:2. Wszystkie plazmidy mają stężenie 2 μg/μl. Ważne szczegóły dotyczące przygotowania roztworu do wstrzykiwań przedstawiono w Dyskusji.
   1. Przygotować roztwór DNA, dodając: 4 μg (2 μl) pT2/SB100x-Luc, 8 μg (4 μl) pT/CAGGS-NRASV12 i 8 μg (4 μl) pT/CMV-SV40-LgT i 10 μl 10% glukozy do końcowej objętości 20 μl o stężeniu 1 μg/ml DNA i 5% glukozy.
   2. Przygotuj roztwór PEI, dodając 2,8 μl PEI in vivo jet, 7,2 μl sterylnej wody i 10 μl 10% glukozy do końcowego stężenia 5% glukozy.
   3. Dodać roztwór PEI do roztworu DNA, wymieszać i odstawić w temperaturze pokojowej (RT) na 20 minut. Roztwór jest teraz gotowy do wstrzyknięcia. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej trzymaj roztwór na lodzie.
   4. Włożyć do mikropompy czystą strzykawkę o pojemności 10 μl wyposażoną w igłę podskórną o rozmiarze 30 i skosie 12,5° (Rysunek 2 #1).
4. Aby sprawdzić prawidłowe działanie systemu iniekcyjnego, należy użyć automatycznego wstrzykiwacza (Rysunek 2 #1) w celu pobrania 10 μl wody do strzykawki, a następnie całkowicie opróżnić strzykawkę
5. Schłodzić stadium stereotaktyczne noworodka (Rysunek 2 #3) zawiesiną suchego lodu i alkoholu do temperatury 2-8°C.
6. Wywołaj znieczulenie, umieszczając szczenięta na mokrym lodzie na 2 minuty. Znieczulenie będzie kontynuowane na schłodzonej ramie stereotaktycznej przez pozostałą część zabiegu. Utrzymanie temperatury ramy powyżej zera, w zakresie 2-8 °C, zapobiegnie oparzeniom termicznym. Jako szczególny środek ostrożności szczenięta można owinąć gazą przed umieszczeniem na mokrym lodzie.
7. Napełnić strzykawkę roztworem DNA/PEI.
8. Unieruchomić szczeniaka w ramie stereotaktycznej, umieszczając jego głowę między nausznikami pokrytymi gazą (ryc. 2b). Upewnij się, że grzbietowa strona czaszki jest pozioma, równoległa do powierzchni ramy i że szwy czaszkowe są wyraźnie widoczne. Przetrzyj głowę 70% etanolem.
9. Opuścić igłę strzykawki i wyregulować współrzędne stereotaktyczne za pomocą pokręteł ramy stereotaktycznej, aż igła dotknie lambdy (przecięcie linii środkowej kości ciemieniowej i potylicznej) (ryc. 2b).
10. Podnieś igłę i ustaw współrzędne stereotaktyczne na 0,8 mm bocznie i 1,5 mm rostralnie do lambdy (rysunek 2b).
11. Opuść igłę, aż dotknie skóry i lekko ją wgłębi. Zmierz współrzędne. Opuścić igłę o kolejne 1,5 mm. Igła przebije skórę i czaszkę i przejdzie przez korę, aby wejść do komory bocznej (ryc. 2c).
12. Za pomocą automatycznego wstrzykiwacza wstrzyknąć 0,75 μl roztworu DNA/PEI z szybkością 0,5 μl/min
13. Trzymaj szczenię na ramie przez kolejną minutę, aby roztwór mógł rozproszyć się w komorach. W międzyczasie znieczulij inne szczenię na lodzie przez 2 minuty, przygotowując się do następnego wstrzyknięcia.
14. Delikatnie i powoli podnieś igłę i umieść szczeniaka pod lampą grzewczą. Monitoruj oddech i aktywność. W razie potrzeby zapewnij delikatną stymulację kończyn aż do pierwszego oddechu.
15. Zwróć szczenię matce po rozgrzaniu, osiągnięciu różowego koloru, regularnym oddychaniu i aktywności, zwykle 5-7 minut. Jeśli wstrzykuje się więcej niż jedno młode na raz, należy trzymać wszystkie młode razem, aż wszystkie wstrzyknięcia zostaną wykonane. Jeśli wstrzyknięcia trwają dłużej niż 30 minut, połowę szczeniąt należy zwrócić po pierwszych 30 minutach, a resztę po zakończeniu zabiegu.
16. Monitoruj, czy matka reaguje i pielęgnuje swoje młode. W razie potrzeby dodaj do klatki zastępczą mamę.
17. Upewnij się, że przerwa między umieszczeniem szczeniaka na lodzie a umieszczeniem go pod ogrzewaniem lamp jest krótsza niż 10 minut. Im szybsza procedura, tym lepsze przeżycie. Zwykle czas potrzebny na znieczulenie i wstrzyknięcie szczeniaka wynosi 4 minuty.

3. Bioluminescencyjne monitorowanie powstawania i progresji nowotworu

3.1) Monitorowanie wychwytu plazmidu po wstrzyknięciu

1. 24-72 godziny po wstrzyknięciu wyjmij wszystkie młode z klatki matki i umieść w 6-dołkowym naczyniu do hodowli tkankowych, po jednym szczenię na studzienkę.
2. Przygotować roztwór lucyferyny o stężeniu 30 mg/ml rozpuszczony w roztworze soli fizjologicznej lub buforze fosforanowym. Przygotować ten roztwór z wyprzedzeniem i przechowywać w małych porcjach w temperaturze -20 °C.
3. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę podskórną o rozmiarze 30 wstrzyknąć podskórnie 30 μl lucyferyny między łopatki szczeniaka. Upewnij się, że igła nie przebija żadnych narządów, ściskając skórę i lekko ją unosząc przed wkłuciem igły.
4. Natychmiastowy obraz za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo. W przypadku spektrum IVIS należy użyć następujących ustawień dla akwizycji: automatyczna ekspozycja, duże binning i przysłona f = 1.

3.2) Monitorowanie powstawania i postępu nowotworu

UWAGA: Zwierzęta zaczną tworzyć makroskopowe guzy wykrywalne przez bioluminescencję i histologię w ciągu 21/2-6 tygodni, w zależności od wstrzykniętych plazmidów onkogennych.

1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 26 wstrzyknąć dootrzewnowo 100 μl roztworu lucyferyny o stężeniu 30 mg/ml.
2. Umieść zwierzę w komorze anestezjologicznej. Wstrzyknąć do pięciu zwierząt w tym samym czasie.
3. Odczekaj 5 minut, a następnie rozpocznij przepływ tlenu/izofluranu (1,5-2,5% izofluranu) w celu znieczulenia zwierząt. Po 3-4 minutach wyjmij zwierzęta z komory anestezjologicznej, rozpocznij przepływ tlenu / izofluranu w komorze bioluminescencyjnej. Umieść zwierzęta w odpowiednich szczelinach wyposażonych w szklane stożki nosowe, aby umożliwić znieczulenie i swobodny przepływ światła.
4. Zazwyczaj uzyskuje się serię 6 zdjęć w odstępach 2-minutowych z automatycznym czasem ekspozycji, medianą kategoryzacji i otwartą przysłoną f = 1.
5. Ustaw obszar zainteresowania dla wszystkich obrazowanych zwierząt, zazwyczaj owal nad obszarem głowy, i zmierz intensywność luminescencji za pomocą skalibrowanych jednostek fotonów/s/cm²/sr.
6. Zapisać maksymalną wartość dla każdego zwierzęcia. Następnie można porównać zapisy w trakcie progresji guza dla każdego zwierzęcia i/lub między zwierzętami, na przykład gdy stosowane są różne metody leczenia.

4. Analiza histologiczna i immunohistochemiczna nowych GBM

UWAGA: Gdy nowotwory osiągną pożądany eksperymentalny punkt czasowy, zwierzęta mogą być składane w ofierze, mózgi poddawane perfuzji, naprawiane i analizowane. Dla analiz przeżycia stan agonalny stanowi punkt końcowy doświadczenia, w którym zwierzęta są humanitarnie uśmiercane przy pierwszych oznakach obciążenia nowotworem, zgodnie z definicją w stadium klinicznym, gdy zwierzę zaczyna wykazywać objawy upośledzonej mobilności, zgarbioną postawę i niechlujną sierść. Poniżej przedstawiono krótki opis stosowanych standardowych metod histologicznych i immunohistochemicznych.

4.1) Perfuzja i fiksacja

1. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny.
2. Sprawdź odruch pedału, ściskając stopę myszy. Kiedy ten odruch zostanie zniesiony, wskazując na głębokie znieczulenie, unieruchomij mysz na desce preparacyjnej za pomocą szpilek, otwórz jamę brzuszną, wypreparuj przeponę i otwórz klatkę piersiową, aby uwidocznić serce.
3. Włóż kaniulę o rozmiarze 20 do lewej komory serca. Połączyć kaniulę z plastikową rurką przechodzącą przez pompę perystaltyczną do pojemnika z natlenionym i heparynizowanym roztworem Tyrode'a (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl₂ 2H₂O, 0,005% NaH₂PO₄, 0,1% glukozy, 0,1% NaHCO₃, 0,02% KCl). Rozpocznij przepływ roztworu Tyrode'a, dostosowując prędkość pompy perystaltycznej, aby zapewnić powolny i stały przepływ, około jednej kropli na sekundę lub mniej, jeśli zwierzęta są mniejsze.
4. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku serca, aby umożliwić odpływ krwi i Tyrode'a.
5. Monitoruj wydajność perfuzji, obserwując blednienie narządów wewnętrznych (najbardziej widoczne w wątrobie i nerkach), gdy stają się one pozbawione krwi.
6. Gdy roztwór spływający z serca będzie klarowny (3-5 min), zamień roztwory z Tyrode'a na 4% paraformaldehydu w celu utrwalenia (4% PFA, pH 7,34 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem).
7. Monitoruj dobre utrwalenie tkanek przez zwiększoną sztywność szyi i ogona.
8. Odetnij głowę myszy i ostrożnie wypreparuj mózg z czaszki.
   1. Pociągnij futro zakrywające czaszkę rostralnie w kierunku nosa i chwyć je mocno, aby ustabilizować głowę grzbietem do góry.
   2. Za pomocą ostrego skalpela przeciąć w dół wzdłuż krawędzi oczodołu, aby przeciąć mięśnie oczodołu i leżące poniżej łuki jarzmowe.
   3. Odwróć głowę brzuszną stroną do góry i usuń przyczepione mięśnie szyi za pomocą rongeur. Zmiażdż pierwszy kręg i usuń go z pnia mózgu.
   4. Wizualizuj ślimak, chwyć leżącą nad nim kość skroniową za pomocą rongeur i utwórz otwór między kością skroniową a potyliczną. Oderwij kość potyliczną od powierzchni móżdżku.
   5. Zmiażdż kość leżącą nad nosem za pomocą rongeur. Ostrożnie usuń pozostałe kości czołowe i ciemieniowe z powierzchni mózgu, uważając, aby nie uszkodzić powierzchni mózgu. Zwróć szczególną uwagę w obszarze orbity.
   6. Obróć głowę brzuszną stroną do góry. Mózg zsunie się w dół z pozostałej części czaszki, połączonej teraz wyłącznie przez nerwy czaszkowe. Za pomocą małych nożyczek przetnij nerwy węchowe, wzrokowe i trójdzielne. To uwolni mózg.
9. Umieścić mózg w 4% PFA na noc w temperaturze 4 °C w celu późniejszego utrwalenia.
10. W celu analizy histologicznej i barwienia hematoksyliną-eozyną należy przenieść mózgi do buforu fosforanowego na 24 godziny, a następnie przystąpić do zatapiania parafiny.
11. W celu analizy immunohistologicznej przenieś mózgi do 30% roztworu sacharozy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez 24-48 godzin (do momentu, gdy mózgi opadną na dno probówki)
12. Przeciąć mózgi na pół przez środek obszaru guza, umieścić przeciętą stroną do dołu w formie do zamrażania, zanurzyć w pożywkach kriozatapiających (związek OCT) i błyskawicznie zamrozić w zawiesinie etanolu z suchego lodu, izopentanu z suchego lodu lub ciekłego azotu. Zamrożone bloki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu podzielenia i zabarwienia.

4.2) Barwienie hematoksylinowo-eozynowe mózgów zanurzonych w parafinie do analizy histopatologicznej wewnętrznych GBM

1. Płuczki zatopione w parafinie należy rozdrobnić o grubości 4 μm, zanurzyć w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C i zamontować na szkiełkach podstawowych.
2. Odparafinować szkiełka, umieszczając je na 10 minut w piecu o temperaturze 60 °C, a następnie przenosząc je w odstępach 5-minutowych przez szereg trzech pojemników na szkiełka wypełnionych ksylenem.
3. Uwodnić szkiełka przez serię kąpieli etanolowych: 100% etanol przez 2 minuty, powtórz raz, 95% etanolu przez 2 minuty, powtórz raz, 70% etanolu przez 2 minuty, a następnie przenieś szkiełka do wody.
4. Zabarwić szkiełka, zanurzając je w pojemniku na szkiełka wypełnionym hematoksyliną Harris na 2 minuty.
5. Spłucz w wodzie z kranu, aż woda będzie czysta.
6. Zanurz dwukrotnie szkiełka w roztworze do niebieszczenia (0,1% wodorowęglanu sodu).
7. Pozostaw szkiełka w wodzie z kranu na 2 minuty, a następnie przenieś na 80% etanol na 2 minuty.
8. Zaplamić szkiełka, zanurzając je w pojemniku wypełnionym Eozyną na 5 minut.
9. Szkiełka odwadniające w serii kąpieli etanolowych (80% etanolu 3-4 zanurzenia, 95% etanolu 2 min, powtórz raz, 100% etanolu 2 minuty, powtórz raz).
10. Klarować przez 3 kolejne kąpiele ksylenu, każda po 3 minuty.
11. Szkiełko nakrywkowe z podłożem montażowym na bazie ksylenu i pozostawić do wyschnięcia na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej, aż będzie gotowe do obrazowania. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

4.3) Immunohistochemia kriokonserwowanych wbudowanych mózgów do molekularnej i komórkowej charakterystyki GBM indukowanych de novo

1. Pobrać zamrożone bloki z magazynu w temperaturze -80 °C, umieścić w kriosacie i pozostawić do wyrównania temperatur przez 30 minut.
2. Sekcja o grubości 12-14 μm i zamontuj 2-3 sekcje na dodatnio naładowanych szkiełkach szkiełkowych. Wycinaj sekcje szeregowo, zbierając sąsiednie sekcje na różnych prowadnicach. Pozwala to na barwienie różnymi przeciwciałami na sąsiednich odcinkach tkanki w obrębie guza.
3. Suszyć szkiełka w eksykatorze przez co najmniej 1 godzinę po przekrojeniu, aby umożliwić dobre przyleganie tkanki.
4. Stwórz barierę hydrofobową (ze znacznikiem hydrofobowym) na każdym końcu szkiełka, aby płyn mógł pokryć sekcje i pozostać na szkiełku podczas mycia. Przykryj skrawki roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z 0,1% Triton-X (PBS 0,1% Tx) i delikatnie wstrząsaj przez 5 minut na poziomym wytrząsaczu, aby przepuszczalność tkanki. Powtórz dwa razy.
5. Zablokować niespecyficzne wiązanie roztworem 10% normalnej surowicy koziej (lub surowicy zwierzęcia, w którym wyhodowano przeciwciało drugorzędowe) przez 30 minut, delikatnie wstrząsając
6. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała w 2% normalnej surowicy koziej w PBS 0,1% Tx i pipetować roztwór na skrawki. Umieść szkiełka w zakrytej, wilgotnej komorze w ciemności i przechowuj przez noc w temperaturze pokojowej.
7. Następnego dnia przemyj skrawki trzy razy przez 5 minut PBS 0,1% Tx i inkubuj w fluorescencyjnym przeciwciałie drugorzędowym rozcieńczonym w 2% normalnej surowicy koziej PBS 0,1% Tx przez godzinę.
8. Przemyć skrawki trzy razy przez 5 minut z PBS 0,1% Tx, zabarwić barwnikiem jądrowym (np. DAPI) przez 2 minuty, umyć jeszcze raz, oczyścić w wodzie i nakryć szkiełkiem z medium montażowym na bazie wody, które zachowa fluorescencję. Umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i pozwól im utwardzać się przez co najmniej 24 godziny w ciemności, aż będą gotowe do obrazowania. Następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.

5. Generowanie pierwotnych linii komórek nowotworowych ze specyficznymi zmianami genetycznymi.

1. Aby wygenerować linie komórkowe od myszy z guzem Śpiącej Królewny, wybierz mysz z potwierdzonym dużym guzem (bioluminescencja 10,^7-10,⁸ fotonów/s/^cm2/sr).
2. Poddać mysz eutanazji za pomocą przedawkowania znieczulenia izofluranem, odciąć głowę zwierzęcia i ostrożnie wyciąć mózg z czaszki (jak opisano w sekcji 4). Umieść mózg na czystej szalce Petriego.
3. Za pomocą żyletki wykonaj cięcia koronalne z przodu i z tyłu guza. Lokalizacja guza jest zwykle rozpoznawalna ze względu na przezroczystość mózgu.
4. Wyciąć guz, zwykle o średnicy 5-7 mm za pomocą drobnych kleszczyków i umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml wypełnionej 300 μl pożywki z nerwowych komórek macierzystych (pożywka NSC: DMEM/F12 z suplementem B-27, suplementem N2 i Normociną, uzupełnioną ludzkim rekombinowanym EGF i bFGF w stężeniu 20 ng / ml każdy).
5. Delikatnie homogenizuj guz plastikowym tłuczkiem, który pasuje do ścianek rurki.
6. Dodać 1 ml bezenzymatycznego roztworu do dysocjacji tkanek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
7. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm, przemyć sitko 10 ml pożywki NSC, odwirować przy 300 x g przez 4 min, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 7 ml pożywki NSC.
8. Umieścić płytkę w kolbie hodowlanej T25 i wyhodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych w atmosferze 95% powietrza i 5%_CO2. Po 3 dniach niektóre komórki obumarły, niektóre przylgnęły do dna szalki hodowlanej, a niektóre tworzą neurosfery, swobodnie unoszące się w pożywce.
9. Usunąć te zawieszone komórki i ponownie umieścić je w kolbie do hodowli tkankowej T75.
10. Po kolejnych trzech dniach hodowli zbierz neurosfery, dysocjuj zgodnie z opisem w kroku 5.6, przecedź przez sitko komórkowe i policz komórki. Zamrozić podwielokrotności komórek w płodowej surowicy bydlęcej 10% DMSO i komórki pasażujące o gęstości miliona komórek w 14 ml NSC uzupełnionym EGF i FGF dla kolby T75. Tempo wzrostu będzie zależało od onkogenów wykorzystywanych do generowania nowotworów. Dostosuj warunki hodowli komórkowej, aby zapobiec przerostowi i utrzymać komórki w stosunkowo dużej gęstości.

Wyniki

Aby scharakteryzować histopatologiczne cechy glejaków wywołanych przez SB, nowonarodzonym myszom C57/ BL6 wstrzyknięto w P1 plazmid kodujący lucyferazy (pT2/SB100x-Luc) w połączeniu z plazmidami kodującymi transpozony z onkogennym DNA, tj. NRAS (pT/CAGGS-NRASV12) i SV40 LgT (pT/CMVSV40-LgT) (Figura 3c) lub plazmidem kodującym krótką spinkę do włosów p53 z PDGFβ i reporterem GFP (pT2shp53/GFP4/mPDGFβ) w połączeniu z NRAS (Rysunek 3d). Zwierzęta były monitorowane pod kątem biolumi...

Dyskusja

W tym artykule szczegółowo opisujemy wszechstronną i powtarzalną metodę generowania nowych modeli GBM przy użyciu integracji onkogennego plazmidowego DNA za pośrednictwem transpozazy SB z komórkami otaczającymi strefę podkomorową noworodków myszy. Przedstawiamy protokół generowania transpozonów plazmidów z nowymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania, ilustrujemy, jak monitorować postęp nowotworów u żywych zwierząt oraz jak scharakteryzować cechy histopatologiczne i immunohistochemiczne tych nowotworów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Standard laboratoryjny firmy Stoelting z adapterami dla szczurów i myszy	Stoelting	51670	Inne firmy produkują podobne ramki, odpowiednie są wszystkie z małymi adapterami do myszy
Kwintesencja wtryskiwacza stereotaktycznego (QSI)	Stoelting	53311	Wtryski można wykonywać bez niego, ale      Automatyczny wtryskiwacz pozwala na zwiększenie powtarzalności i wygody
10 μ l Ręcznie montowana strzykawka MICROLITR serii 700	Hamilton	Model 701	Ten model strzykawki niezawodnie dostarczy od 0,5 do 500 ul roztworu. Inne syrngi (z przykładu 5 ul, Model 75) mogą być również używane
igły podskórnej o rozmiarze 30 (1,25", 15o besko);	Hamilton	S/O# 197462	Ta igła jest idealna do przekłuwania skóry i czaszki noworodka myszy bez konieczności wykonywania innych inwazyjnych zabiegów. Jeśli stanie się matowy (nie wnika łatwo w skórę), należy go wymienić.
in vivo-jetPEI	Polyplus Transfection	201-10G	Podwielokrotność w małych objętościach i utrzymywać w temperaturze -20 oC
D-Lucyferyna, Sól potasowa	Goldbio.com	LuckK-1g	Inne źródła lucifierazy świetlika są równie odpowiednie
Roztwór hematoksyliny, Harris Modified	Sigma Aldrich	HHS128-4L
Tissue-Tek OCT Złożona	mikroskopia elektronowa Sciences	62550-01	Do osadzania mózgów do kriosekcji i immunohistovhemitrii
Zaawansowany DMEM/F-12, bez glutaminy	Życie Technologie	12634-010	Do hodowli neurosfer
B-27¨ Suplement (50X), bez surowicy	Life Technologies	17504-044	Surowica bez suplementu do hodowli neurosfer
Suplement N2 (100x)	Life Technologies	17502-048	Surowica bez suplementu do hodowli neurosfer
Normocyn	InvivoGen	ant-nr-1	Środek antymykoplazmowy do hodowli neurosfer
Rekombinowany ludzki EGF	PEPROTECH	AF-100-15	Suplement czynnika wzrostu do hodowli  neurosfery
Rekombinowany ludzki FGF-basic	PEPROTECH	100-18B	Suplement czynnika wzrostu do hodowli  neurosfery
[nagłówek]
HyClone HyQTase  Odczynnik do odrywania komórek	Thermo Scientific	SV3003001	Do dysocjacji neurosfer
Kimble-Chase Kontes Tłuczek do peletek	Fisher Scientific	K749510-0590	Do dysocjacji świeżo wypreparowanych guzów
Sitka do komórek sokoła rozmiar oczek 70 um	Fisher Scientific	08-771-2	Do generowania zawiesin pojedynczych komórek zdysocjowanych neurosfer
Ksyleny Stopień histologiczny	Fisher Scientific	Protokół C8H10
Hematoksylina Bez rtęci (zakwaszony)	Fisher Scientific	245-678
Protokół Eosyn Y roztwór (zintensyfikowany)	Fisher Scientific	314-631