Artykuł metodologiczny

Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/52445

⸱

22 lutego 2015

 ,  , 
1Institute for Society and Genetics, University of California, Los Angeles, 2Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 3California Nanosystems Institute, Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy szczegółowe etapy wysokoprzepustowego testu chemicznego u nicieni Caenorhabditis elegans używanych do oceny toksyczności linii zarodkowej. W tym teście zaburzenie funkcji linii zarodkowej po narażeniu na działanie substancji chemicznych jest monitorowane za pomocą fluorescencyjnego reportera specyficznego dla zarodków aneuploidalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja toksyczności reprodukcyjnej tysięcy substancji chemicznych obecnych w naszym środowisku była jednym z najbardziej kuszących wyzwań w dziedzinie zdrowia środowiskowego. Wynika to po części z niedostatku systemów modelowych, które mogą (1) dokładnie podsumować kluczowe cechy procesów rozrodczych oraz (2) zrobić to w sposób średnio lub wysokoprzepustowy, bez potrzeby stosowania dużej liczby kręgowców.

Opisujemy tutaj test na nicieniu C. elegans, który pozwala na szybką identyfikację substancji toksycznych dla linii zarodkowej poprzez monitorowanie indukcji aneuploidalnych zarodków. Wykorzystując linię reporterową GFP, błędy w segregacji chromosomów wynikające z przerwania linii zarodkowej są łatwo wizualizowane i określane ilościowo za pomocą automatycznej mikroskopii fluorescencyjnej. W ten sposób badanie przesiewowe określonego zestawu związków pod kątem jego toksyczności można przeprowadzić w formacie płytki od 96 do 384 dołków w ciągu kilku dni. Wtórna analiza dodatnich trafień może być przeprowadzona w celu określenia, czy nieprawidłowości chromosomowe pochodzą z rozerwania mejotycznego, czy z wczesnych błędów segregacji chromosomów embrionalnych. Ogólnie rzecz biorąc, test ten stanowi szybką strategię pierwszego przejścia do szybkiej oceny dysfunkcji linii zarodkowej po ekspozycji chemicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje około 87 000 substancji chemicznych zarejestrowanych do handlu w Stanach Zjednoczonych, jednak tylko niewielka liczba z nich została przetestowana pod kątem potencjalnych skutków zdrowotnych1. Spośród tych, które zostały przetestowane, tylko część została oceniona pod kątem wpływu na zdrowie reprodukcyjne, częściowo ze względu na trudności w określeniu zmian we wczesnych zdarzeniach rozrodczych u ssaków, zwłaszcza podczas rozwoju i różnicowania żeńskich komórek rozrodczych. Rzeczywiście, pierwsze zdarzenia mejotyczne mają miejsce we wczesnych stadiach rozwoju embrionalnego u samic ssaków, a zatem są trudno dostępne i zebrane w ilościach odpowiednich do celów przesiewowych.

Linia zarodkowa stanowi kluczowe ogniwo między pokoleniami, a jej właściwa funkcja zależy od precyzyjnego wykonania skomplikowanego programu podziału komórkowego i chromosomowego, zwanego mejozą. Rozregulowanie procesu mejotycznego może skutkować zmniejszoną płodnością oraz produkcją gamet i zarodków z nieprawidłową liczbą chromosomów, stan określany mianem aneuploidii. Błędy segregacji chromosomów w mejozie są bardzo istotne dla zdrowia ludzkiego. Nieprawidłowości chromosomowe są powszechne, z częstością 1 na 150 żywych urodzeń, trisomia 21, 18 i 13, a także błędy chromosomowe X i Y są najbardziej rozpowszechnionymi typami2,3. Co więcej, wrodzone wady rozwojowe, w tym te o podłożu chromosomalnym, są główną przyczyną zgonów niemowląt w USA.4 Pomysł, że wpływy środowiskowe mogą wpływać na segregację chromosomową i zachowanie, nie jest nowy5, ale nadal jest słabo poznany. Dlatego tak ważne jest zbadanie, które z substancji chemicznych wprowadzanych do naszego środowiska zakłócają płodność człowieka, wczesny rozwój i ogólne zdrowie reprodukcyjne.

W świetle tych ograniczeń modeli ssaków, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test przesiewowy do testowania toksyczności reprodukcyjnej glisty C. elegans. Zmobilizowaliśmy kilka ważnych cech oferowanych przez ten powszechnie stosowany system modeli genetycznych, takich jak jego niewielkie rozmiary, niski koszt, krótki cykl reprodukcyjny, wysoki odsetek komórek rozrodczych i łatwość manipulacji6. Robaki mogą być hodowane na 96-dołkowych płytkach lub w dużych ilościach płynnych kultur, a ze względu na ich przezroczystość mogą być bezpośrednio obrazowane na płytkach w celu wykrycia reporterów fluorescencyjnych. Test opisany poniżej wykorzystuje te cechy i wykorzystuje szczep robaka zawierający fluorescencyjny reporter Pxol-1::GFP do wykrywania przerwania linii zarodkowej i indukcji aneuploidii zarodkowej.

Użycie tego szczepu reporterowego opiera się na ogólnie rzadkim występowaniu samców w populacji głównie hermafrodytycznych robaków. Ci mężczyźni (<0,2%) naturalnie pochodzą z błędu w segregacji chromosomuX 7. Ponieważ jednak zaburzenie linii zarodkowej często prowadzi do błędów w segregacji autosomów i heterochromosomów, koreluje zarówno z podwyższoną częstością występowania fenotypu męskiego (błędna segregacja X), jak i śmiertelnością zarodka (błędna segregacja autosomów). Aby łatwo wykryć indukcję samców, jednocześnie omijając problem śmiertelności embrionalnej, stosuje się promotor specyficzny dla samców (xol-1) do kierowania ekspresją GFP we wczesnych zarodkach nadal zawartych w macicy robaka. W związku z tym pojawienie się zarodków wykazujących ekspresję GFP jest wykorzystywane jako wskaźnik zastępczy dla obecności zarodków aneuploidalnych. Metoda ta była wcześniej stosowana do identyfikacji genów zaangażowanych w utrzymanie linii zarodkowej i mejozę8,9. Przystosowany do badań przesiewowych chemicznych, szczep ten jest stosowany w przesiewaniu o średniej i wysokiej przepustowości. Co ważne, szczep wiernie oddaje aneugenność substancji chemicznych i dlatego jest istotny dla punktów końcowych rozrodczości ssaków10. Opisany tutaj test będzie szczególnie przydatny dla toksykologów w przemyśle farmaceutycznym i chemicznym, którzy chcą szybko ocenić toksyczność chemikaliów w odniesieniu do punktów końcowych reprodukcji. Co więcej, test ten jest w pełni zgodny z priorytetami rządowymi podkreślonymi w raporcie Toksyczność w XXI wieku 11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie bakterii żerujących

UWAGA: Ta sekcja opisuje przygotowanie bakterii żerujących (szczep E. coli OP50).

  1. Wyizolować pojedynczą kolonię szczepu E. coli OP50 z płytki agarowej bulionu lizogennego (LB) i aseptycznie zaszczepić w 300 ml autoklawowanego bulionu LB.
  2. Pozostawić zaszczepioną kulturę do wzrostu przez noc w wytrząsarce z prędkością 200 obr./min i w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia nasycenia.
  3. Przenieś OP50 do 6 sterylnych, wstępnie zważonych stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Osadzaj bakterie przez wirowanie przez 5 minut przy 6 000 obr./min (5 000 x g).
  4. Wyrzucić supernatant i przemyć bakterie 50 ml sterylnego M9. Powtórz dwa razy.
  5. Po drugim praniu wyjmij pozostały M9, upewniając się, że w tubie nie pozostał żaden M9.
  6. Określić masę osadu, ważąc probówkę zawierającą osad bakterii i odejmując wagę probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
  7. Zawiesić osad w M9 w stężeniu 100 mg/ml.
  8. Przechowywać roztwór OP50 w temperaturze 4 °C do czasu, gdy zostanie wykorzystany do hodowli robaków.

2. Przygotowanie pożywki Petriego dla nicieni (NGM)

UWAGA: Ta sekcja opisuje przygotowanie płytek Petriego NGM, które są płytkami, na których robaki C. elegans są rutynowo utrzymywane w laboratorium.

  1. Autoklawować podłoże agarowe NGM.
  2. Stosując sterylne procedury, dozować 17 ml roztworu agarowego NGM na 6-centymetrowe płytki Petriego za pomocą pompy perystaltycznej.
    UWAGA: Stała ilość agaru w płytkach zmniejsza potrzebę ponownego ustawiania ostrości mikroskopu podczas przełączania z jednej płytki na drugą.
  3. Pozostaw płytki w temperaturze pokojowej na 2-3 dni przed użyciem, aby agar zastygł i pozwolił nadmiarowi wilgoci odparować.
  4. Wysiewaj płytki NGM przy użyciu sterylnej techniki. Nałóż 1-2 krople płynnej kultury OP50 i rozprowadź za pomocą szklanej pałeczki. Upewnij się, że nie rozprzestrzeniasz trawnika bakteryjnego aż do krawędzi talerzy.
  5. Pozwól trawnikowi OP50 rosnąć przez 1-2 dni w temperaturze pokojowej przed użyciem płytek do hodowli robaków.

3. Przygotowanie synchronicznej populacji robaków

UWAGA: Cykl życiowy C. elegans składa się z etapu embrionalnego, czterech stadiów larwalnych (L1-L4) i dorosłości. W tej sekcji opisano przygotowanie populacji robaków synchronicznej z wiekiem. Wszystkie materiały mające kontakt z C.elegans po zabiegu wybielania muszą być sterylne.

  1. Dzień 1 – Przygotowanie populacji robaka gravid
    1. Używaj płytek NGM, w których większość populacji robaków składa się z wygłodzonych larw L1.
    2. Zbierz larwy L1 za pomocą wysterylizowanego kilofa do robaków i przenieś je na świeże 6 cm płytki NGM obsiane OP50. Inkubować przez około 65 godzin w temperaturze 20 °C, aż większość dorosłych robaków stanie się ciężarna. Aby uniknąć przepełnienia płytki i umożliwić robakom wzrost bez zubożania bakterii, nie należy przenosić więcej niż jednego lub dwóch skupisk larw L1 na każdą świeżą płytkę NGM.
  2. Dzień 4 – Ustalenie zsynchronizowanej populacji larw L1
    1. Zebrać grawitacyjne robaki z płytek NGM, przemywając je 1-2 ml M9 i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Pozwól, aby grawitacyjne robaki osiadły na dnie stożkowej probówki o pojemności 15 ml przez około 5-10 minut. Usunąć supernatant bez naruszania osadu robaka.
    3. Przenieś osad robaka do 2-4 probówek mikrowirówek i dodaj 1 ml roztworu wybielacza/NaOH. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Monitorować postęp reakcji pod mikroskopem stereoskopowym, aby upewnić się, że wszystkie robaki są martwe. Nie wybielaj dłużej niż 5 minut, ponieważ zarodki mogą umrzeć.
    4. Zebrać robaki, wirując przez 1 minutę przy 3 000 obr./min (900 x g). Usunąć supernatant i dodać 1 ml sterylnego M9 w celu zneutralizowania reakcji.
    5. Umyj robaki dwukrotnie, odwirowując przez 1 minutę przy 3 000 obr./min (900 x g).
    6. Usunąć supernatant i dodać M9 do objętości 100-200 μl.
    7. Za pomocą szklanej pipety Pasteura dodać kroplę mieszanki robak/M9 w celu oczyszczenia płytek NGM i inkubować je przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 20 °C, aby umożliwić wyklucie się zarodków.
      UWAGA: Bez pożywienia wzrost larw zostanie zatrzymany na etapie L1.
  3. Dzień 5 – Ustalenie zsynchronizowanej populacji larw L4
    1. Zebrać larwy L1 z przezroczystych płytek NGM, przemywając płytki 1-2 ml M9 i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Pozwól, aby martwe dorosłe robaki osiadły na dnie stożkowej probówki o pojemności 15 ml przez około 5 minut.
    3. Zebrać supernatant, w którym znajdują się robaki L1, do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wytrącić robaki przez odwirowanie przez 2 minuty przy 2 600 obr./min (1 000 x g).
    4. Usunąć supernatant pozostawiając około 500 μl.
    5. Określić stężenie robaków w roztworze M9, licząc liczbę robaków w kroplach o objętości 10 μl za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Policz co najmniej 5 kropli.
    6. Dostosuj stężenie robaków do 20-25 robaków/μl i dodaj 50 μl mieszanki robak/M9 do płytek NGM wysianych OP50.
    7. Inkubować przez 65 godzin w temperaturze 15 °C (do inkubacji do końca weekendu), aby umożliwić wzrost zsynchronizowanej populacji L1 aż do osiągnięcia stadium L4.

4. Narażenie robaków na chemikalia w płytkach 96-dołkowych

UWAGA: Ta sekcja opisuje użycie reportera transkrypcyjnego Pxol1::gfp zawierającego szczep C. elegans do badania przesiewowego pod kątem indukcji aneuploidii.

  1. Zebrać larwy L4 z przezroczystych płytek NGM, przemywając płytki 1-2 ml M9 i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  2. Pozwól robakom L4 osiąść na dnie stożkowej probówki o pojemności 15 ml przez około 5-10 minut. Usunąć supernatant bez naruszania osadu robaka.
  3. Dodać 3-5 ml M9 i oznaczyć stężenie robaków w roztworze M9, licząc liczbę robaków w 10 μl kropli za pomocą stereomikroskopu. Odliczyć co najmniej 5 kropli na każdą próbkę.
  4. Zawiesić robaki w stężeniu 1 000 robaków/ml w M9.
  5. Rozcieńczyć bakterie OP50 z sekcji 1 10-krotnie za pomocą M9. Upewnij się, że zawieszone bakterie osiągają temperaturę pokojową, ponieważ niższa temperatura wpływa na rozwój robaków.
  6. Za pomocą pipety wielokanałowej najpierw dodaj 100 μl mieszanki robak/M9 (z kroku 4.4), a następnie dodaj 400 μl rozcieńczonych bakterii OP50 (z kroku 4.5) do każdego dołka 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie o głębokości 2 ml. Na koniec każda studnia będzie miała 100 robaków w 500 μl.
  7. Dodać 0,5 μl badanej substancji chemicznej lub odpowiedniej kontroli do żądanych studzienek, aby uzyskać sugerowane stężenie końcowe 100 μM, stężenie powszechnie stosowane w badaniach przesiewowych substancji chemicznych w C. elegans12. Wystawić na działanie kontrolnego rozpuszczalnika etanolowego lub rozpuszczalnika DMSO w końcowym stężeniu 0,1%.
    UWAGA: Zalecamy stosowanie nokodazolu (100 μM) jako kontroli dodatniej.
  8. Uszczelnij płytkę za pomocą folii samoprzylepnej. Pamiętaj, aby dobrze uszczelnić płytę, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między studzienkami.
  9. Owiń talerz folią aluminiową.
  10. Przenieść płytkę do wytrząsarki (170-180 obr./min) o odpowiedniej temperaturze na odpowiedni czas (24 lub 65 godzin). Temperatura w pomieszczeniu wpływa na rozwój robaków; utrzymywać temperaturę około 20 °C.

5. Akwizycja obrazu robaków grawitacyjnych w płytce 384-dołkowej

UWAGA: Ta sekcja opisuje użycie mikroskopu o wysokiej zawartości do obrazowania narażonych robaków Pxol1::gfp, aby zobrazować ekspresję GFP w zarodkach w macicy dorosłych hermafrodytów. Do każdej płytki 384-dołkowej, która ma być przesiewana, należy użyć robaków z 4 płytek 96-dołkowych.

  1. Po ekspozycji chemicznej w wytrząsarce pozostaw 96-dołkową płytkę na 10-15 minut, aby dorosłe robaki mogły osiąść na dnie płytki.
  2. Za pomocą pipety wielokanałowej usuń 350 μl M9, bardzo uważając, aby nie naruszyć robaków na dnie płytki.
  3. Umyć robaki 1 ml M9 i powtórzyć krok 5.1.
  4. Za pomocą pipety wielokanałowej usunąć 1 ml wstrzykiwacza M9, bardzo uważając, aby nie naruszyć robaków znajdujących się na dnie płytki.
  5. Za pomocą pipety wielokanałowej ponownie zawiesić robaki w pozostałym M9 i zebrać 100 μl mieszanki robak/M9 z 96-dołkowych płytek i załadować je do dołków 384-dołkowej płytki o czarnych ściankach/przezroczystym dnie. Powtórz proces, używając robaków z 4 x 96-dołkowych płytek, aż wszystkie dołki płytki 384-dołkowej zostaną załadowane.
    UWAGA: Ważne jest, aby wszystkie studzienki miały taką samą objętość, aby zwiększyć wydajność i szybkość autofokusa podczas procesu pozyskiwania obrazu. Każda studzienka powinna zawierać od 80 do 100 robaków.
  6. Dodać 1 μl lewamizolu (100 μM) do każdej studzienki i pozwolić robakom inkubować przez około 30 minut.
    UWAGA: Lewaizol działa jako agonista receptora acetylocholiny i unieruchamia robaki.
  7. Przenieś płytkę do szerokokątnego mikroskopu o wysokiej zawartości, który jest w stanie zapewnić automatyczne obrazowanie.
  8. Do akwizycji obrazu należy używać oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów o wysokiej zawartości zgodnie z wytycznymi producenta. Wybierz obiektyw 4X, aby uzyskać 1 obraz na dołek.
  9. Przed przystąpieniem do akwizycji obrazu należy ustawić parametry obrazowania GFP na 45 ms ekspozycji i rozdzielczość obrazu na 2 160 x 2 160.
  10. Zbierz dane jako liczbę robaków z dodatnim wynikiem GFP podzieloną przez całkowitą liczbę robaków w odwiercie, przy czym ta ostatnia miara jest stosunkowo spójna między odwiertami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narażenie szczepu reporterowego Pxol-1::GFP na czynniki chemiczne, takie jak trucizna mikrotubul Nocodazole (Rysunek 1) prowadzi do indukcji wysokiego odsetka zarodków wykazujących ekspresję GFP w macicy narażonych dorosłych hermafrodytów w porównaniu do kontroli DMSO. Zarodki GFP-dodatnie są znacznie jaśniejsze niż słaba fluorescencja tła obserwowana w innych zarodkach, a także autofluorescencja obserwowana w jelitach zwierząt. Odsłonięte robaki są bezpośrednio obrazowane na płytkach 384-dołkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda stanowi pierwszą zakrojoną na szeroką skalę strategię identyfikacji substancji toksycznych dla linii rozrodczej. Wymaga to użycia transgenicznego szczepu zawierającego GFP Pxol-1::GFP , który wiernie informuje o indukcji aneuploidii we wczesnych zarodkach, który jest używany jako wskaźnik dysfunkcji linii zarodkowej. Metoda polega na starannej synchronizacji populacji robaków C. elegans i ekspozycji robaków na chemikalia w formacie 96-dołkowym, a następnie obrazowaniu robaków z doda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować następującym źródłom finansowania: NIH ES020353 oraz nagrodzie Colgate-Palmolive Alternative Research Grant za umożliwienie tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
60 mm Wentylowane, ostre krawędzie szalki PetriegoTritechT3315
AgarApex20-274
Axygen 96-well clear round den, 2 ml polipropylenowa płytka głębinowaCorningP-DW-20-C-S
BactopeptoneApex20-261
Bactoo-tryptonFisher ScientificBP1421-2
WybielaczClorox
Chlorek wapnia (CaCl2)VWRAA12316-A1
CholesterolFisher ScientificICN10138225
DMSOVWRIC19018680
E. coli (OP50)CentrumGenetyki Caenorhabditishttp://www.cbs.umn.edu/cgc
Etanol 200 proofVWREM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 dołkiSigma-AldrichM1937-32EA
ImageXpress Micro XLS SystemUrządzenia molekularne
Chlorowodorek lewamizoluFluka31742
Siarczan magnezu bezwodny (MgSO4)VWR97061-438
Akwizycja i pozyskiwanie obrazów o wysokiej zawartości MetaXpress Oprogramowanie analitycznemolekularne
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
Folie ze sztucznego jedwabiu do hodowli biologicznychVWR60941-086
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Wodorotlenek sodu (NaOH)Fisher ScientificS318
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Mikroskop stereoskopowyVWR BDH0316
NikonSMZ 745Ten mikroskop ma całkowite powiększenie od 3,35X do 300X. Sprawdzi się każdy mikroskop o podobnych parametrach.
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter szczepCaenorhabditis Genetics Centerhttp://www.cbs.umn.edu/cgc
Ekstrakt drożdżowyBecton Dickinson212750
Urządzenia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from: http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T (2009).
  2. Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
  3. Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
  4. Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
  5. Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
  8. Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
  9. Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
  10. Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
  11. National Research Council. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , The National Academies Press. (2007).
  12. Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Toksyczno linii zarodkowejC elegansembriony aneuploidalnereporter GFPmikroskopia fluorescencyjnaprzesiew chemicznysegregacja chromosom wsynchronizacja nicieniwysoka przepustowoobrazowanie zautomatyzowane

Powiązane artykuły