Metody porównywania składników odżywczych w pierzgach wytwarzanych przez zafrykanizowane i europejskie pszczoły miodne oraz wpływ na miana białek hemolimfy

Podsumowanie

Oto metody ilościowego określania składników odżywczych w pyłku przed i po jego przemianie w pierzgę przez dwa podgatunki pszczół miodnych. Opisujemy techniki pomiaru spożycia pierzgi pszczelej i wynikających z niej mian białek w obu podgatunkach.

Streszczenie

Pszczoły miodne otrzymują składniki odżywcze z pyłku, który zbierają i przechowują w ulu jako pierzga. Opracowaliśmy metody kontrolowania źródła pyłku, które pszczoły zbierają i przekształcają w pierzch, umieszczając kolonie w specjalnie skonstruowanym zamkniętym obszarze lotu. Opracowano metody analizy składu białkowego i aminokwasowego pyłku i pierzgi. Opisujemy również, w jaki sposób mierzono spożycie pierzgi i metody stosowane do określania miana białka hemolimfy u dorosłych robotnic pszczół po karmieniu się pierzką przez 4, 7 i 11 dni po wzejściu. Zastosowano metody w celu określenia, czy genotyp wpływa na przemianę pyłku w pierzgę oraz tempo, w jakim pszczoły spożywają i pozyskują z niego białko. Dwa podgatunki (pszczoły miodne europejskie i zafrykanizowane; EHB i AHB) podawano to samo źródło pyłku. Na podstawie opracowanych metod stwierdzono, że pierzga wytwarzana przez oba podgatunki miała niższe stężenie białka i wartości pH niż pyłek. Ogólnie rzecz biorąc, stężenia aminokwasów w pierzgi wytwarzanej przez EHB lub AHB były podobne i występowały na wyższych poziomach w chlebie pszczelim niż w pyłku. Zarówno AHB, jak i EHB spożywały znacznie więcej pierzgi wytwarzanej przez AHB niż przez EHB. Chociaż EHB i AHB spożywały podobne ilości każdego rodzaju pierzgi, stężenie białka w hemolimfie w AHB było wyższe niż w EHB. Różnice w pozyskiwaniu białka między AHB i EHB mogą odzwierciedlać adaptacje środowiskowe związane z regionem geograficznym, w którym wyewoluował każdy podgatunek. Różnice te mogą przyczynić się do pomyślnego osiedlenia się populacji AHB w Nowym Świecie ze względu na wpływ na odchów czerwiu i wzrost kolonii.

Wprowadzenie

Odżywianie odgrywa fundamentalną rolę w zdrowiu i żywotności kolonii pszczół miodnych oraz w ich tworzeniu populacji. Składniki odżywcze z pożywienia dostarczają energii i składników biochemicznych potrzebnych do odchowu czerwiu, termoregulacji, żerowania i odpowiedzi immunologicznej. W przypadku rodzin pszczelich miodnych składniki odżywcze potrzebne do wzrostu populacji pszczół miodnych i utrzymania ich zdrowia pochodzą z nektaru i pyłku. Nektar dostarcza węglowodanów, a pyłek zaspokaja pozostałe zapotrzebowanie żywieniowe, takie jak białko, lipidy, witaminy i minerały ¹.

Podgatunki pszczół miodnych mogą różnić się parametrami na poziomie kolonii zależnymi od odżywiania, takimi jak długowieczność robotnic, odchów czerwiu i mechanizmy odporności społecznej ^2-6. Różnice te mogą być związane ze sposobem, w jaki żywność, w szczególności pyłek, jest przetwarzana przez kolonię i trawiona przez osobniki. Pyłek jest przechowywany w komórkach grzebieniowych i poprzez fermentację kwasu mlekowego za pośrednictwem mikroorganizmów jest chemicznie zmieniany ^7-10. Sfermentowany pyłek nazywany jest pierzchą. Mogą istnieć różnice genotypowe między podgatunkami w ich zdolności do pozyskiwania składników odżywczych z pyłku, który zbierają i przechowują, co może wpływać na wzrost i przetrwanie kolonii. Wpływ genotypów na przetwarzanie żywności i pozyskiwanie składników odżywczych został udokumentowany w innych organizmach, powodując, że niektóre osoby uzyskują więcej składników odżywczych i kalorii niż inne podczas spożywania tych samych pokarmów.

Tutaj opisujemy metody używane do porównywania składu i konsumpcji pierzgi pszczelej wytwarzanej przez różne podgatunki pszczół miodnych. Opisano również metody pomiaru uzyskanych mian białek hemolimfy u pszczół robotnic. Wcześniejsze badania nad składem odżywczym pierzgi przeprowadzono na europejskich pszczołach miodnych (EHB) ^10,15,16. Mogą jednak występować różnice w pierzgach wytwarzanych przez pszczoły różnych podgatunków, nawet jeśli żywią się tym samym pyłkiem. EHB i AHB porównano, ponieważ te podgatunki mają wyraźne różnice behawioralne i fizjologiczne, które mogą być związane z przetwarzaniem żywności i pozyskiwaniem składników odżywczych ¹⁷. Niektóre z najbardziej zauważalnych różnic polegają na tym, że AHB zbiera i spożywa więcej pyłku niż EHB i wydaje się, że łatwiej przekształca go w czerw ¹⁸. Kolonie AHB mają wyższe wskaźniki rojenia niż EHB i uciekają, gdy zasoby żywności stają się ograniczone ^19-23. Ucieczka jest rzadkością w EHB. AHB mają również wyższe tempo przemiany materii niż EHB ²⁴. Podstawy odżywcze różnic na poziomie kolonii między EHB i AHB mogą być związane z szybkością zbierania pyłku, a także z zawartością składników odżywczych (np. aminokwasów i białka) po przekształceniu go w pierzgę. Spożycie pierzgi pszczelej i wynikające z tego pozyskiwanie białka również mogą odgrywać rolę w różnicach na poziomie kolonii między EHB i AHB. Korzystając z opracowanych metod, EHB i AHB wyprodukowały pierzgę z tego samego źródła pyłku. Pierzga była następnie podawana z powrotem pszczołom każdego podgatunku i mogła określić, czy pszczoły pozyskują białko z chleba pszczelego w sposób charakterystyczny dla ich podgatunku lub dla źródła chleba pszczelego.

Protokół

1. Pozyskiwanie pierzgi z kolonii AHB i EHB

1. Umieść pułapki pyłkowe na rodzinach pszczół miodnych i zbieraj pyłek. Zmiel pyłek na drobny proszek (podobny do pyłku zrzucanego z pylników) za pomocą młynka do kawy.
2. Założyć po 5 kolonii AHB i EHB w zamkniętym obszarze lotów (EFA), tak aby pszczoły żywiły się wyłącznie dostarczonym pyłkiem. Aby zapobiec przemieszczaniu się robotnic między koloniami EHB i AHB, należy podzielić EFA na oddzielne sekcje, aby pszczoły nie mogły między nimi przechodzić. W każdej sekcji NNKT należy umieścić indywidualne kolonie EHB lub AHB z 3 500-4 000 pszczół robotnic, plastr woskowy z nektarem, miodem, niedojrzałym czerwiem i pustym plastrem.
   UWAGA: Kolonie nie mają zmagazynowanego pyłku w momencie założenia. Szybkość przechowywania pyłku można zwiększyć, nie uwzględniając królowej niosek w koloniach.
3. Nakarmić kolonie zmielonym pyłkiem, umieszczając tackę z pyłkiem w każdej sekcji NNKT. Rozprowadzanie około 60 g pyłku na każdej tacy, aby pszczoły żerujące mogły zbierać go w postaci ładunków cielesnych i przechowywać pyłek w swoich koloniach jako pierzch. Kontynuuj dostarczanie świeżego pyłku na każdą tacę codziennie przez 3 tygodnie.
4. Pierzga z kolonii europejskich nazywana jest europejską pierzchą (EBB), a z kolonii afrykańskich nazywana jest pierzchą afrykanizowaną (ABB).

2. Karmienie pszczół w klatkach

1. Umieść ramki z zapieczętowanym czerwiem robotnic z kolonii AHB i EHB w oddzielnych klatkach wyłaniających się w pomieszczeniu środowiskowym ustawionym na 32-34 °C i 40% wilgotności względnej.
2. Kiedy robotnice wyjdą na zewnątrz i osiągną wiek około 24 godzin, ustaw 12 klatek do testów biologicznych z pleksiglasu (wymiary = 11,5 x 7,5 x 16,5 cm³) i dodaj do każdej klatki 100 nowo powstałych pszczół robotnic EHB lub 100 nowo wynurzonych pszczół robotnic AHB. Umieść fragment grzebienia ze znaną liczbą komórek EBB lub ABB (24-30 komórek na klatkę) w każdej klatce, aby uzyskać następujące kombinacje traktowania: AHB karmione ABB, EHB karmione ABB, AHB karmione EBB i EHB karmione EBB. (4 zabiegi; 6 klatek na zabieg; łącznie 24 klatki).
3. Do każdej klatki dodać fiolki z wodą i 50% roztwór miodu i wody o objętościowym składzie. Napełniaj fiolki z miodem i wodą codziennie przez 11-dniowy okres badania.

3. Pobieranie próbek pszczół robotnic i pierzgi oraz szacowanie zużycia

1. Pobranie próbki od 10 nowo wynurzonych robotnic EHB i AHB przed umieszczeniem ich w klatkach. Odnieś się do nich jako do pszczół dnia 0 i niech służą jako punkt odniesienia dla stężeń białka w hemolimfie.
2. Usuń 10 pszczół z każdej klatki po tym, jak karmiły się EBB lub ABB przez 4, 7 i 11 dni.
3. Umieść żywe pszczoły w osobnych probówkach do mikrowirówek i umieść na okładach z lodu. Wybierz podpróbkę czterech pszczół do analizy stężenia białka hemolimfy.
4. Po pobraniu próbek od pszczół w dniu 11 policz liczbę komórek grzebienia, które nadal zawierają pierzch. Jest to względna miara spożycia pierzgi
.
5. Usuń pozostałą pierzgę z komórek w każdej klatce i przechowuj w oddzielnych probówkach do mikrowirówek zgodnie z klatką. Próbki pierzgi należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy pod kątem pH, stężenia białka rozpuszczalnego i zawartości aminokwasów.

4. Szacowanie pH pyłku i pierzgi

1. Pobrać sześć losowych próbek pyłku o masie 0,3 g podawanego pszczołom w EFA i rozpuścić go w 300 μl wody destylowanej. Zmierz pH za pomocą wodoodpornej włóczni pH z podwójnym złączem z dokładnością +0,01.
2. Pobrać 0,3 g próbki pierzgi, która pozostała po 11-dniowym okresie karmienia w każdej klatce. Rozpuścić pierzgę w 300 μl wody destylowanej i zmierzyć pH zgodnie z opisem dla pyłku (4.1).

5. Analiza białek

1. Z każdej klatki pobrać sześć próbek pyłku oraz próbkę EBB i ABB. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu ich analizy pod kątem stężenia białka rozpuszczalnego.
2. Zmieszać 20 mg pyłku lub pierzgi z 1 000 μl 0,1 M roztworu buforowego fosforanu (PBS).
3. Mieszać mieszaninę przez 10 sekund i odwirowywać przy 571,2 x g przez 1 min.
4. Pobrać 10 μl próbki supernatantu i umieścić w studzienkach 96-dołkowej płaskiej płytki polistyrenowej EIA/RIA. Powtórzyć każdą próbkę w trzech studzienkach.
5. Narysuj hemolimfę od pszczół zebranych z każdej klatki, wkładając rurkę kapilarną o pojemności 20 μl (która została podgrzana i pociągnięta do ostrego jak igła punktu) do prawej bocznej części klatki piersiowej w pobliżu punktu przyczepienia skrzydeł. W razie potrzeby zbierz dodatkową hemolimfę, wkładając tę samą rurkę do błony między tergitami brzusznymi.
6. Dodać 1 μl hemolimfy do 9 μl 0,1 M PBS. Przechowywać roztwór hemolimfy w temperaturze -20 °C do czasu analizy na obecność białka rozpuszczalnego.
7. Określ całkowite stężenie rozpuszczalnego białka w próbkach pyłku, pierzgi pszczelejki i hemolimfy za pomocą komercyjnego zestawu do oznaczania białek Bradford. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
8. Ustalić krzywą wzorcową w celu oszacowania stężenia białka rozpuszczalnego w próbkach, mierząc absorbancję białka ze znanymi stężeniami białka w albuminie surowicy bydlęcej (BSA). Zmierzyć absorbancję białka przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru.

6. Analiza aminokwasów

1. Zebrać pojedyncze próbki z komórek grzebieniowych każdej kolonii, aby utworzyć reprezentatywną próbkę EBB i ABB do analizy.
2. Pobrać próbkę pyłku lub chleba pszczelego o stężeniu 50 mg zważoną do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek i dodać do niej 1 ml wody destylowanej wraz ze 100 μl roztworu wzorca wewnętrznego o stężeniu 50 ng/μl składającego się z 4-alaniny, kwasu_{23-laurynowego}, ¹³C_6-glukozy i kwasu d_{39-arachidiaku}.
3. Zamknąć próbkę i poddać sonikacji przez 5 minut.
4. Kondycjonować wkład HLB dodając 1 ml metanolu, równoważąc dodając 1 ml wody destylowanej, a następnie dodając 1 ml próbki chleba pszczelego lub pyłku. Przemyć wkład 1 ml 5,0% MeOH/_H2O i wymyć 1 ml 80% MeOH/_H2O.
5. Odparować próbkę do sucha pod strumieniem azotu. Rozpuścić próbkę w 50 μl pirydyny i 100 μl N,O-Bis (trimetylosililo)trifluoroacetamidu + trimetylochlorosilanu (BSTFA + TMCS).
6. Zakryć próbkę i inkubować ją w temperaturze 70 °C przez 30 minut.
7. Pozostawić próbkę do ostygnięcia i przenieść ją do czystej fiolki z automatycznym podajnikiem próbek.
8. Nałożyć nakrętkę i umieścić próbkę w selektywnym detektorze masowym połączonym z chromatografem gazowym w celu analizy próbek zarówno pod kątem związków lotnych, jak i kwasów organicznych. Oddzielić cukier i kwasy organiczne po derywatyzacji TMS za pomocą BSTFA + TMCS za pomocą kolumny (średnica wewnętrzna 30 m x 0,25 mm) o grubości warstwy 1,0 μm.
9. Ustawić piec kolumnowy na 50 C na 2 minuty, następnie zwiększyć temperaturę liniowo do 290 °C przy 5 C/min i przytrzymać przez 7 minut. Ustawić wtryskiwacz GC i interfejs GC/MS odpowiednio na 250 °C i 290 °C.
   1. Stosować hel jako nośnik przy natężeniu przepływu 1,0 ml/min. Ustawić temperaturę źródła MS na 230 °C.
10. Codziennie dostrajaj i kalibruj spektrometr mas za pomocą perfluorotributyloaminy (PFTBA). Użyj wstrzyknięcia 1 μl PFTBA w trybie pełnego skanowania (35-700 amu) jonów dodatnich, aby uzyskać dane na temat obecności i stężeń aminokwasów.

Wyniki

Beebread był przechowywany w temperaturze -80 °C przez mniej niż miesiąc przed analizą pod kątem pH i stężenia białka, a także przez około 4 miesiące przed analizą aminokwasów. Pierzga różniła się od pyłku pszczelym pH i stężeniem białka (ryc. 1). pH pierzgi było niższe niż pyłku, podobnie jak stężenie białka. Zarówno EHB, jak i AHB zużywały więcej ABB niż EBB (Rysunek 2).

Poziomy rozpuszczalnego białka w hemolimfie AHB były znacznie wyższe niż EHB, niezależnie od rodzaju spożywanej przez nich pierzgi (Rysunek 3). Te różnice w poziomach białka w hemolimfie wystąpiły, mimo że EHB i AHB spożywały podobne ilości każdego rodzaju pierzgi. Wiek pszczół w momencie pobierania próbek istotnie wpłynął na stężenie białka rozpuszczalnego w hemolimfie. Stężenia białka były znacznie niższe u pszczół 4. dnia w porównaniu z pszczołami w 7. lub 11. dniu, które nie różniły się.

Spośród 10 aminokwasów, które są niezbędne dla pszczół miodnych, w pyłku wykryto wszystkie oprócz histydyny. W większości przypadków stężenia aminokwasów mierzone w pierzgi były wyższe niż w pyłku (ryc. 4). Na przykład stężenie leucyny i treoniny było o około 60% wyższe w pierzgi w porównaniu z pyłkiem, a stężenie waliny było o około 25% wyższe. Poziomy alaniny, kwasu asparaginowego, glutaminy i metioniny były również wyższe w pierzgach pszczelich niż w pyłku. Stężenia aminokwasów nie różniły się istotnie między ABB i EBB, z wyjątkiem fenyloalaniny i cysteiny. Poziomy fenyloalaniny były około dwa razy wyższe w ABB w porównaniu z EBB lub pyłkiem. Stężenia cysteiny były niższe w EBB w porównaniu z ABB lub pyłkiem. Tryptofan był jedynym aminokwasem obecnym w wyższych stężeniach w pyłku niż w EBB lub ABB. Stężenia proliny w pyłku i ABB były wyższe niż w EBB.

Rysunek 1: Porównanie pH (A) i stężeń rozpuszczalnego białka (B) w pyłku i pierzgach wytwarzanych przez europejskie (EHB) lub zafrykanizowane (AHB) pszczoły miodne. pH pyłku było znacznie wyższe niż w przypadku pierzgi, co określono na podstawie analizy wariancji (F_2,12 = 3725, p <0,0001), a następnie testu wielokrotnego porównania Tukeya W. Stężenie białka w pyłku było istotnie wyższe niż w chlebie pszczelim wytwarzanym metodą EHB (EBB) lub AHB (ABB) (F_2,27 = 16,49; p <0,0001). Średnie, po których następuje ta sama litera, nie różnią się znacząco na poziomie 0,05.

Rysunek 2: Średni odsetek komórek zawierających pierzch, które zostały całkowicie skonsumowane w ciągu 11 dni przez pszczoły trzymane w klatkach. Pierzga została wyprodukowana przez pszczoły europejskie (EHB) lub afrykańskie (AHB) przy użyciu tego samego źródła pyłku. Środki oszacowano na podstawie pięciu klatek z każdej próby; te z tą samą literą nie różnią się istotnie na poziomie 0,05, jak określono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (F_3,16 = 7,3, p = 0,003) i testu W Tukeya. Ten rysunek został zmodyfikowany z ²⁵.

Rycina 3: Średnie stężenie białka w hemolimfie od europejskich (EHB) lub afrykanizowanych (AHB) pszczół miodnych karmionych pierzją wytwarzaną przez pszczoły europejskie (EBB) lub afrykanizowane (ABB) przez 4, 7 i 11 dni. Analiza wariancji przeprowadzona w wyniku powtarzających się pomiarów wykazała istotne różnice między 4 grupami badanymi (F_3,20 = 19,7, p <0,001). Poziomy rozpuszczalnego białka w ABB karmionym AHB były znacznie wyższe niż w ABB karmionym EHB (p = 0,008) lub EBB (p = 0,018). Wiek pszczół w momencie pobierania próbek istotnie wpłynął na stężenie białka rozpuszczalnego w hemolimfie. Poziomy były znacznie niższe u pszczół dnia 4 w porównaniu z dniem 7 (p <0,0001) lub 11 (p = 0,001). Pszczoły dnia 7 i dnia 11 nie różniły się (p = 0,149). Liczba ta została zmodyfikowana z²⁵ .

Rysunek 4: Stężenie aminokwasów (μg na gram pyłku lub pierzgi) w pyłku lub wytwarzanej z niego pierzchły. EBB to pierzga wytwarzana przez pszczoły europejskie, a ABB była wytwarzana przez pszczoły zafrykanizowane. Tryptofan, cysteina, fenyloalanina i prolina zostały wykreślone oddzielnie w celu jasności przedstawienia ich ilości. Liczba ta została zmodyfikowana z ²⁵.

Dyskusja

Korzystając z metod opisanych powyżej, stwierdziliśmy, że pierzga wytwarzana przez AHB była spożywana w większych ilościach zarówno przez AHB, jak i EHB. Chociaż EHB i AHB spożywały podobne ilości każdego rodzaju pierzchy, AHB miało wyższe miana białka w hemolimfie. Wyniki oparte na naszych metodach były podobne do poprzednich doniesień, w których poziomy białka hemolimfy w AHB były wyższe niż w EHB, chociaż obie były karmione tymi samymi dietami ²⁶ . Mierząc spożycie EBB i ABB, które były spożywane w różnym tempie zarówno przez EHB, jak i AHB, ustalono, że stężenie białka hemolimfy w każdym podgatunku nie może zostać zwiększone przez zwiększenie spożycia żywności. Wydaje się, że stężenie białka hemolimfy u robotnic w wieku pszczół pielęgniarskich utrzymuje się na stałym poziomie, a wartość zadana dla tego poziomu jest wyższa w przypadku AHB niż EHB.

Istnieje kilka ważnych warunków do zakładania rodzin pszczelich do produkcji pierzgi, które zoptymalizują tempo przechowywania pyłku. Po pierwsze, rodziny potrzebują ramek z otwartym czerwiem. Bez otwartego czerwiu do karmienia robotnice nie zbiorą dużo pyłku. Po drugie, rodzina musi być pozbawiona królowej, aby nie wytwarzać dodatkowego czerwiu. Odchów czerwiu wymaga dużych ilości pyłku, a magazynowany jest tylko nadmiar pyłku. W małych koloniach założonych w NNKT byłoby niewiele pyłku do przechowywania w postaci pierzgi, gdyby obszary lęgowe się powiększały, więc rodziny muszą być pozbawione królowej. Wreszcie, aby wyprodukować pierzchlę, pyłek musi być zbierany w postaci ładunków sercowych i przechowywany w komórkach grzebieniowych. Jeśli pyłek jest zbierany w pułapkach pyłkowych, należy go zmielić na drobny proszek przed przedstawieniem go pszczołom, aby mogły zebrać go w postaci ładunków korpusowych.

Metody pomiaru spożycia pierzgi pszczelej pozwoliły na uzyskanie szacunków jakościowych, a nie bezwzględnych. Jedyne spożycie, które zostało policzone, miało miejsce, gdy komórki zostały całkowicie opróżnione z chleba pszczelego. Dokładniejsze oszacowanie całkowitego spożycia chleba pszczelego można uzyskać, usuwając chleb pszczeli z komórek i przekształcając go w kotlet, który można zważyć przed i po okresie badania. Chcieliśmy jednak zatrzymać chleb pszczeli w komórkach, aby pszczoły mogły się nim żywić tak, jak w kolonii i być może kontynuować jego przetwarzanie w okresie badania. Różnica w wadze odcinków plastra przed i po badaniu nie została wykorzystana jako oszacowanie spożycia, ponieważ waga mogła wzrosnąć, ponieważ pszczoły umieszczały w niektórych komórkach rozcieńczony miód, którym je karmiono.

Robotnicy mogli również dodać trochę rozcieńczonego miodu do chleba pszczelego. Z tych powodów policzono komórki zawierające w przybliżeniu równe ilości chleba pszczelego przed i po okresie karmienia i wygenerowano pomiar jakościowy. Mimo to istniała uderzająca różnica między tymi dwoma rodzajami pierzgi w liczbie zliczonych pustych komórek ABB w porównaniu z EBB po 11 dniach.

Określenie, kiedy przechowywany pyłek staje się chlebem pszczelim, może być trudne, ponieważ pszczoły stale dodają pyłek do komórek. Kolonie używane do produkcji pierzgi były zakładane z ramkami z otwartym czerwiem, aby pszczoły zbierały pyłek. Jednak kolonie były pozbawione królowych, więc larwy były do karmienia tylko przez około 9 dni po założeniu kolonii. Przez pozostałą część 3-tygodniowego okresu, kiedy rodziny pszczele znajdowały się w NNKT, pyłek zebrany przez pszczoły był przechowywany i przekształcany w pierzchę. Przetrzymywanie zmagazynowanego pyłku w komórkach plastra przez dodatkowe 11 dni podczas karmienia nim pszczół w klatkach mogło również kontynuować przetwarzanie pyłku na pierzoś. Przemiana pyłku w pierzgę trwa około 7 dni ⁸. Pierzga podawana EHB i AHB miała niższe pH i obniżone stężenie białka w porównaniu z pierzgą podawaną pyłkiem. Podobne wyniki zmian w pylku po konwersji pszczeli podaje inni ^7,10,27. Nasze wyniki różniły się jednak od poprzednich doniesień tym, że istniały różnice w stężeniach niektórych aminokwasów między pierzchą a pyłkiem. Zmiany zarówno w stężeniach białek, jak i aminokwasów mogą być spowodowane aktywnością enzymów proteolitycznych, których źródłem mogą być same pszczoły lub społeczności mikrobiologiczne zadomowione w pierzgu ^7,8,28,29 .

Metody stosowane do pomiaru stężenia białka były podobne do tych wcześniej opisanych w celu określenia wpływu białka pokarmowego na pszczoły afrykańskie i ^{europejskie26}. Jako rozszerzenie metod, byliśmy w stanie oszacować zawartość rozpuszczalnego białka w pyłku i pierzch. Metody te przyniosły podobne wyniki jak w poprzednich raportach ^7,10,27. Nasze odkrycia dostarczają dodatkowych dowodów na to, że AHB skuteczniej przyswaja białko w diecie niż EHB i że może to być kluczowy czynnik w ekologicznej dominacji AHB w większości regionów, w których wyemigrował i zadomowił się ^{w wieku 30-32} lat.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
wodoodporne podwójne złącze pH spear	Młynek do kawy Thermo Fisher
	Mr. Coffee	model 1DS77
Bufor fosforanowy Dulbecco	Emd-millipore	BSS-1005-B
EIA/RIA płytka polistyrenowa	Sigma-Aldrich-Corning	CLS3590-100EA
pipety mikrokapilarne	Kimble Glass Inc.
Szybki start Zestaw do oznaczania białek Bradford 2	Bio-Rad	#500-0202
Spektrofotometr	Biotek Synergy HT
Masowy detektor selektywny	Chromatograf
HLB
	Agilent	6930
Kolumna chromatografii gazowej	A J& W Naukowy	DB-1701
d4-alanina	Kwas d	488917
dsub>23-laurynowy	Sigma-Aldrich	451401
13C6-glukoza	Sigma-Aldrich	389374
Pirydyna	Sigma-Aldrich	270970
N,O-Bis (trimetylosililo)trifluoroacetamid +
Trimetylochlorosilan (BSTFA + TMCS)	Sigma-Aldrich	33148
Perfluorotributyloamina (PFTBA)	Sigma-Aldrich	442747-U
d39-arachidiak Izotop	Cambridge