Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

DOI:

10.3791/52451

⸱

19 kwietnia 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Therapeutics, Institut de la Vision, Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968, 2INSERM, U968, 3CNRS, UMR_7210

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać przepuszczalność bariery krew-siatkówka i wewnętrzną integralność błony ograniczającej w zwierzęcych modelach chorób siatkówki, użyliśmy kilku wariantów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jako narzędzi do oznaczania neuronów siatkówki i gleju. Ekspresja genu reporterowego za pośrednictwem wirusa jest następnie wykorzystywana jako wskaźnik przepuszczalności bariery siatkówkowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki Müllera są głównymi komórkami glejowymi siatkówki. Ich stopy końcowe tworzą granice siatkówki na zewnętrznej i wewnętrznej błonie granicznej (ILM), a w połączeniu z astrocytami, perycytami i komórkami śródbłonka tworzą barierę krew-siatkówka (BRB). BRB ogranicza transport materiału między krwiobiegiem a siatkówką, podczas gdy ILM działa jak błona podstawna, która histologicznie określa granicę między siatkówką a jamą ciała szklistego. Znakowanie komórek Müllera jest szczególnie istotne dla badania stanu fizycznego barier siatkówkowych, ponieważ komórki te są integralną częścią BRB i ILM. Zarówno BRB, jak i ILM są często zmienione w chorobie siatkówki i są odpowiedzialne za objawy chorobowe.

Istnieje kilka sprawdzonych metod badania integralności BRB, takich jak test niebieski Evansa czy angiografia fluoresceinowa. Metody te nie dostarczają jednak informacji na temat zakresu przepuszczalności BRB dla większych cząsteczek, w zakresie nanometrów. Ponadto nie dostarczają one informacji na temat stanu innych barier siatkówkowych, takich jak ILM. Aby zbadać przepuszczalność BRB wraz z ILM siatkówki, zastosowaliśmy metodę opartą na AAV, która dostarcza informacji na temat przepuszczalności BRB dla większych cząsteczek, wskazując jednocześnie stan ILM i białek macierzy zewnątrzkomórkowej w stanach chorobowych. Do takich badań przydatne są dwa warianty AAV: AAV5 i ShH10. AAV5 ma naturalny tropizm dla fotoreceptorów, ale nie może przedostać się do zewnętrznej siatkówki, gdy jest podawany do ciała szklistego, gdy ILM jest nienaruszony (tj. w siatkówkach typu dzikiego). ShH10 ma silny tropizm w stosunku do komórek glejowych i selektywnie oznacza glej Müllera zarówno w zdrowych, jak i chorych siatkówkach. ShH10 zapewnia bardziej efektywne dostarczanie genów do siatkówki, w której ILM jest upośledzony. Te wirusowe narzędzia w połączeniu z immunohistochemią i analizą DNA krwi rzucają światło na stan barier siatkówkowych w chorobie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki Müllera są głównym glejowym składnikiem siatkówki. Morfologicznie obejmują siatkówkę promieniście, a ich stopy końcowe, w kontakcie z ciałem szklistym, są skierowane w stronę ILM i tajemnych elementów tego ostatniego. ILM jest błoną podstawną składającą się z około dziesięciu różnych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (laminina, agryna, perlekan, nidogen, kolagen i kilka proteoglikanów siarczanu heparyny). Podczas rozwoju jego obecność jest niezbędna do histogenezy siatkówki, nawigacji aksonów wzrokowych i przeżycia komórek zwojowych1-3. Jednak ILM nie jest niezbędny w dorosłej siatkówce i może być usunięty chirurgicznie w niektórych patologiach bez powodowania uszkodzenia siatkówki4. W terapii genowej błona ta staje się fizyczną barierą dla efektywnej transdukcji siatkówki za pomocą AAV przez wstrzyknięcie do ciała szklistego5.

Poprzez rozległą arboryzację swoich procesów, komórki Müllera zapewniają wsparcie odżywcze i regulacyjne zarówno neuronom siatkówki, jak i komórkom naczyniowym. Komórki Müllera biorą również udział w regulacji homeostazy siatkówki, w tworzeniu i utrzymywaniu BRB6. Ścisłe połączenia między komórkami śródbłonka naczyń włosowatych siatkówki, komórkami Müllera, astrocytami i perycytami tworzą BRB. BRB zapobiega przedostawaniu się niektórych substancji do siatkówki. W wielu chorobach, takich jak retinopatia cukrzycowa, niedrożność żył siatkówki i choroby układu oddechowego, niedotlenienie siatkówki powoduje przeciek przez BRB7-9. Pęknięcie to wiąże się ze wzrostem przepuszczalności naczyń krwionośnych, co prowadzi do obrzęku naczyniopochodnego, odwarstwienia siatkówki i uszkodzenia siatkówki.

Komórki Müllera są ściśle związane z naczyniami krwionośnymi i błoną podstawną, odgrywając ważną rolę zarówno w integralności BRB, jak i ILM. W związku z tym znakowanie komórek glejowych Müllera jest szczególnie istotne dla badania stanu fizycznego tych barier siatkówkowych.

Klasycznie, przepuszczalność BRB jest mierzona za pomocą testu niebieskiego Evansa, polegającego na ogólnoustrojowym wstrzykiwaniu niebieskiego barwnika Evansa, który wiąże się niekowalencyjnie z albuminą osocza. Test ten mierzy wyciek albuminy (białko o średniej wielkości, ~66 kDa) z naczyń krwionośnych do siatkówki (patrz sekcja 5 protokołów)10. Alternatywnie, przeciek naczyniowy można uwidocznić za pomocą angiografii siatkówki fluorescencyjnej potwierdzającej wyciek fluoresceiny (mała cząsteczka, ~359 Da; patrz sekcja 6 protokołów)11. Niemniej jednak obie metody pozwalają na ocenę przepuszczalności BRB dla małych cząsteczek i białek, ale nie dostarczają informacji na temat integralności ILM.

Stąd, aby zbadać przepuszczalność BRB, użyliśmy metody opartej na AAV, która dostarcza informacji na temat przepuszczalności BRB dla większych cząsteczek (np. cząstek AAV, średnica 25 nm). Rzeczywiście, nasza metoda może wykryć obecność transgenu AAV we krwi, co sugerowałoby, że cząsteczki o średnicy ~25 nm byłyby w stanie przeniknąć do krwiobiegu. Metoda ta dostarcza również informacji na temat struktury białek ILM i macierzy zewnątrzkomórkowej w warunkach patologicznych. Do takich badań przydatne są dwa warianty AAV: AAV5 i ShH10. Podsiatkówkowo wstrzykiwany AAV5 ma naturalny tropizm dla fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki12, ale nie może przedostać się do zewnętrznej siatkówki, gdy jest podawany do ciała szklistego w siatkówkach typu dzikiego z nienaruszonym ILM5,13. ShH10 to wariant AAV, który został zaprojektowany tak, aby celować w komórki glejowe nad neuronami14,15. ShH10 selektywnie znakuje komórki Müllera zarówno w zdrowych, jak i chorych siatkówkach ze zwiększoną wydajnością w siatkówkach z naruszonymi barierami16. Te narzędzia wirusowe w połączeniu z immuhistochemią i analizą krwi DNA dostarczają informacji na temat stanu barier siatkówkowych i ich udziału w chorobie (ryc. 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta użyte w tym badaniu były pod opieką i traktowane zgodnie z Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.

1. Produkcja rekombinowanego AAV (rAAV) przez transfekcję przejściową komórek HEK-29317,18

UWAGA: Zobacz McClure C, JoVE (2011)19.

  1. Oczyścić preparat plazmidowy na dużą skalę (co najmniej 1 mg/ml) z plazmidów wektorowych AAV. Użyj 3 plazmidów. Plazmid pomocniczy AAV przenoszący geny replikacji i kapsydu bez odwróconego końca AAV powtarza ITR, kasetę ekspresji transgenu przenoszącą ITR AAV określaną jako plazmid transferowy, oraz plazmid dostarczający geny pomocnicze adenowirusa E2, E4 i geny RNA VA określane jako pHELPER.
  2. Transfekcja 293 komórek tymi 3 plazmidami za pomocą polietylenoiminy (lub innego odczynnika do transfekcji). Powyżej 80% skuteczności transfekcji jest konieczne dla uzyskania dobrych plonów wirusa.
  3. Oczyść rekombinowany AAV z 293 lizatów komórkowych na gradiacji jodiksanolu. Do uzyskania gradientu stosuje się 15%, 25%, 40% i 60% jodiksanolu. Zebrać 40% frakcji jodiksanolu zawierającej cząstki AAV, zagęścić frakcję po ultrawirowaniu w 500 000 x g przez 1 godzinę i wymienić bufor z PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) z 0,001% Pluronu.
  4. Aby określić miano genomowewirusa 20, należy przeprowadzić trawienie DNAzy ProteinaseK, a następnie QPCR. Startery do przodu i do tyłu wzmacniają obszar 62 pz znajdujący się w AAV2 ITR. W przypadku standardu plazmidu sonda jest oznaczona FAM i posiada wygaszacz czarnej (BHQ).
  5. Przeprowadzić qPCR (ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy) w końcowej objętości 25 μl przy użyciu 340 nM odwróconego startera ITR, 100 nM startera ITR do przodu, sondy 100 nM AAV2 ITR, 0,4 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq i 5 μl matrycy (standard, próbka i bez kontroli szablonu).
  6. Jako wzorzec należy użyć plazmidu do transfekcji w 7 x 10-krotnych rozcieńczeniach seryjnych (po 5 μl 2 x 109 do 2 x 103 genomów/ml, co daje końcowe stężenie od 1010 do 104 genomów/ml).
  7. Rozpocząć program od początkowego etapu denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 minut, po którym następuje 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 1 minutę i wyżarzania/przedłużania w temperaturze 60 °C przez 1 minutę. Przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze -20 °C w przypadku długich okresów przechowywania.

2. Wstrzyknięcie doszklistkowe AAV

  1. Znieczulij C57BL6J myszy ketaminą (50 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) i sprawdź utratę odruchu prostowania, odruch wycofania i reakcję szczypania ogona wskazującą na prawidłowe znieczulenie. Rozszerz źrenice poprzez nałożenie na rogówkę neosynefryny 5% i kropli do oczu mydriaticum 0,5%. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  2. Przełóż ultracienką jednorazową igłę o masie 30 g przez równik i obok rąbka do jamy ciała szklistego (patrz Chiu K, JoVE (2007)21). Wstrzyknąć 1 μl zapasu zawierającego od 1 do 4 x 1011 vp ShH10-GFP lub AAV5-GFP z bezpośrednią obserwacją igły w środku jamy ciała szklistego (ryc. 1). Użyj jednego oka jako kontrolki w eksperymentach ILM. Wstrzyknąć oba oczy do eksperymentów BRB. Zastosuj miejscowe leczenie przeciwzapalne i przeciwbakteryjne na wstrzyknięte oczy.
  3. Rozszerz źrenice za pomocą neosynefryny i kropli do oczu mydriaticum do obrazowania. Wykonaj badania dna oka za pomocą kamery dna oka, aby śledzić ekspresję GFP (zielonego białka fluorescencyjnego) 1 tydzień, 2 tygodnie, 1 miesiąc i 2 miesiące po wstrzyknięciu do ciała szklistego (ryc. 1). Myszy należy ofiarować przez inhalację CO2 1 do 2 miesięcy po wstrzyknięciu.

3. Immunohistochemia

  1. W przypadku kriosekcji siatkówki (ryc. 1) należy wypreparować wyłuszczone oczy w celu usunięcia soczewki i rogówki, a następnie zanurzyć w 4% paraformaldehydzie na 1 godzinę.
    1. Cryoprotect wcześniej utrwalone oczy w 10% sacharozie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, 20% sacharozy przez kolejną godzinę w temperaturze pokojowej. Cryoprotect w 30% roztworze sacharozy, przez noc w temperaturze 4 °C. Zamrozić i zanurzyć muszle oczne w żywicy do zatapiania, takiej jak Cryo-matrix. Wykonaj kriosekcje 10 μm i zamontuj na szkiełkach specjalnie przygotowanych do zamrożonych skrawków tkanek, które poprawiają przyleganie tkanek podczas barwienia.
    2. Przepuszczalność skrawków z 0,1% Triton X100 w PBS pH 7,4 przez 5 min. Prać 2x w PBS i blokować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w PBS z 1% BSA, 0,1% Tween 20.
  2. W przypadku płaskich łożysk siatkówki (ryc. 1) utrwalić wyłuszczone oczy w 4% paraformaldehydzie przez 15 minut, aby ułatwić rozwarstwienie.
    1. W ciągu 15-30 minut przeprowadź sekcję oczu, aby usunąć rogówkę i soczewkę. Oddziel siatkówkę od nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i twardówki, przecinając okolice ora serrata i nerwu wzrokowego. Zanurz w 4% paraformaldehydzie na kolejne 30 minut, aby utrwalić siatkówkę i białko fluorescencyjne w transdukowanych komórkach siatkówki (utrwalenie nie może przekraczać 24 godzin). Prać 5 minut w sterylnym PBS o pH 7,4.
    2. Zmienić PBS na bufor blokujący (PBS z 1% BSA, 2% normalna surowica kozi lub osła, 0,5% Triton X-100) i inkubować w buforze blokującym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc.
  3. Inkubować tkanki z pierwszorzędowymi przeciwciałami w buforze blokującym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj 3x z PBS.
    UWAGA: Stosowane przeciwciała są następujące: anty-laminina (1/1,000) znakująca ILM, przeciwciała znakujące klon anty-rodopsyny 4D2 (1/500), klon syntetazy antyglutaminy GS-6 (1/1,500) znakujący komórki Müllera, stożki znakujące PNA Lektyna (1/40).
  4. Inkubować tkanki z rozcieńczeniem 1:500 sprzężonych z fluorem alexa przeciwciał drugorzędowych w buforze blokującym przez 1 godzinę (kriosekcje) lub 2 godziny (płaskie mocowania) w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem. Umyj 3x PBS.
  5. Wykonaj odciążające nacięcia siatkówki i zamontuj ją płasko na szklanym szkiełku z fotoreceptorem lub komórką zwojową siatkówki (RGC) skierowaną do góry. Dodać wodne podłoże montażowe, nałożyć szkiełko nakrywkowe i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. Wykonaj mikroskopię konfokalną na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym. Rejestruj obrazy sekwencyjnie, linia po linii, aby zmniejszyć przesłuchy wzbudzenia i emisji. Zdefiniuj rozmiar kroku zgodnie z twierdzeniem o próbkowaniu Nyquista-Shannona. Użyj ustawień ekspozycji, które minimalizują przesycenie pikseli na końcowych obrazach. Przetwarzaj 12-bitowe obrazy za pomocą FIJI, wyświetlaj przekroje Z na jednej płaszczyźnie przy użyciu maksymalnej intensywności w funkcji Z-project i na koniec konwertuj na 8-bitowy tryb kolorów RGB.

4. Analiza PCR próbek krwi myszy

  1. Wstrzyknąć 100 μl bulionu zawierającego od 1 do 4 x10 11 cząstek AAV-GFP do żyły prącia znieczulonych myszy C57BL6J (5% izofluranu do indukcji w zamkniętej komorze i 2,5% izofluranu przez stożek nosowy podczas operacji) za pomocą strzykawki insulinowej z ultracienką igłą 6 mm. Zwierzę to będzie służyć jako pozytywna kontrola krążących cząstek AAV.
  2. Pobieraj próbki krwi z ogona myszy przed wstrzyknięciem i 3 godzinami, 24 godzinami, 2 dniami i 3 dniami po wstrzyknięciu ShH10 do ciała szklistego lub po wstrzyknięciu do prącia (ryc. 1). Około 10-20 μl gromadzi się w probówkach z heparyną. Uśmiercać myszy przez wdychanie CO2 po zakończeniu procedury.
  3. Wyodrębnij genomowe DNA z próbek krwi za pomocą wybranego zestawu do ekstrakcji.
  4. Wykonaj amplifikację PCR genomowego DNA. Dla tego protokołu należy użyć następującej pary starterów: GFP, sense 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3', antisense 5'-CATGGACGAGCTGTACAGGGA-3'. Wykonano następujący program PCR: 95 °C 2 min (1 cykl); 95 °C 45 sek., 55 °C 1 min, 72 °C 45 s (30 cykli); 72°C 5 min (1 cykl); Trzymać w 4 °C.

5. Opcjonalna metoda Evansa Blue

UWAGA: Określ ilościowo przepuszczalność naczyń krwionośnych, mierząc wyciek albuminy z naczyń krwionośnych do siatkówki za pomocą niebieskiej metody Evansa10.

  1. Barwnik Evans Blue należy przygotować przez rozpuszczenie w zwykłym roztworze soli fizjologicznej (6 mg/ml), sonikację przez 5 minut w myjce ultradźwiękowej i filtrację przez filtr 5 μm.
  2. Znieczulić myszy C57BL6J (inhalacja izofluranu, patrz krok 4.1), sprawdzić utratę odruchu prostowania, odruch wycofania i reakcję szczypania ogona wskazującą na prawidłowe znieczulenie, a następnie wstrzyknąć błękit Evansa (45 mg / kg) przez żyłę prącia (ryc. 1). Sprawdź, czy łapy, pysk i uszy myszy stają się wyraźnie niebieskie po wstrzyknięciu niebieskiego Evansa, potwierdzając pobieranie i dystrybucję barwnika.
  3. Znieczulenie C57BL6J myszy należy przeprowadzić 3 godziny po wstrzyknięciu barwnika z ketaminą (50 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) i zweryfikować utratę odruchu prostującego wskazującą na prawidłowe znieczulenie. Pobrać śródsercowo około 500 μl krwi w probówkach z heparyną i perfuzjonować myszy przez 2 minuty przez lewą komorę za pomocą buforu cytrynianowego (0,05 M, pH 3,5; rozpuścić 7,8 g kwasu cytrynowego i 3,8 g cytrynianu sodu w 1 l wody destylowanej) wstępnie podgrzanej do 37 °C, aby zapobiec zwężeniu naczyń krwionośnych. Myszy są składane w ofierze poprzez perfuzję.
  4. Po perfuzji wyłuszczyć i ostrożnie wypreparować oba oczy pod mikroskopem operacyjnym w celu pobrania siatkówki (patrz punkt 3.2). Wysuszyć siatkówki w parowniku odśrodkowym przez noc, zważyć i wyekstrahować niebieski barwnik Evansa, inkubując siatkówki ze 100 μl formamidu przez 18 godzin w temperaturze 65 °C z wytrząsaniem (100 x g). Odwirować próbki siatkówki w 30-karatowych probówkach filtracyjnych omega przy 20 798,5 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C i odwirować próbki krwi w temperaturze 20 798,5 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Do pomiaru absorbancji należy użyć obu supernatantów. Określić absorbancję każdej próbki, odejmując maksimum absorbancji dla błękitu Evansa przy 620 nm do minimum absorbancji przy 740 nm. Obliczać Stężenie błękitu Evansa w osoczu i siatkówce na podstawie krzywej wzorcowej błękitu Evansa w formamidzie. Wyraźna przepuszczalność BRB w mikrolitrach błękitu Evansa na gram suchej siatkówki na godzinę (μl osocza/g suchej siatkówki wt/godz.).

6. Opcjonalna angiografia fluoresceinowa

UWAGA: Wyciek z naczyń krwionośnych siatkówki u myszy można uwidocznić poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie fluoresceiny sodu.

  1. Znieczulić C57BL6J myszy (inhalacja izofluranu, patrz krok 4.1) i rozszerzyć źrenice kroplami do oczu (neosynefryna i rozszerzenie źrenic). Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  2. Wstrzyknąć dootrzewnowo 0,01-0,02 ml 10% fluoresceiny sodu w 0,1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej do angiografii fluoresceinowej.
  3. Zbierz obrazy obu oczu po wstrzyknięciu za pomocą kamery do badania dna oka. Ofiarować myszy przez wdychanie CO2 po zabiegu.
    UWAGA: 20 sekund jest konieczne, aby naczynia siatkówki stały się widoczne na angiografii. Obrazy muszą być wykonane w ciągu maksymalnie 3-10 minut po wstrzyknięciu fluoresceiny. Miejsca nieszczelności (jeśli występują) są widoczne po 2,5 minuty. W późniejszych punktach czasowych jakość obrazu jest tracona z powodu dyfuzji fluoresceiny sodu do ciała szklistego, dlatego do analizy wykorzystywane są tylko obrazy uzyskane wkrótce po niej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewidujemy zwiększoną transdukcję siatkówkową komórek glejowych Müllera przy użyciu ShH10, jeśli model zwierzęcy wykazuje zaburzenia w strukturze błony wewnętrznej ograniczającej siatkówkę (ILM) (Rysunek 2A-B). Wykazaliśmy na przykład, że w przypadku braku Dp71,  ShH10 celuje specyficznie, lecz bardziej efektywnie w komórki glejowe Müllera po wstrzyknięciu do ciała szklistego, co wskazuje na zwiększoną przepuszczalność ILM w tej linii myszy w porównaniu z myszami typu dzikiego

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BRB reguluje wymianę cząsteczek między krwią a siatkówką. Jego rozpad wiąże się z różnymi chorobami, takimi jak retinopatia cukrzycowa lub zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). Niedawno wykazaliśmy, że u myszy z nokautem dystrofiny, która wykazuje przepuszczalny BRB, siatkówka staje się bardziej podatna na dostarczanie genów, w którym pośredniczą wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV). Jednak pomimo przepuszczalności BRB, cząsteczki AAV wstrzykiwane dogałkowo pozostają ograniczone do przedziału ocz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy platformie obrazowania Institut de la Vision. Dziękujemy Francuskiemu Stowarzyszeniu Dystrofii Mięśniowej (AFM) za stypendium doktoranckie dla O.V. i Allergan INC. Prace wykonane w ramach projektu LABEX LIFESENSES [nr ref. ANR-10-LABX-65] były wspierane przez francuskie fundusze państwowe zarządzane przez ANR. Dziękujemy Peggy Barbe i Mélissie Desrosiers za pomoc techniczną w przygotowaniach do AAV. Jesteśmy wdzięczni Stéphane'owi Fouquetowi za doskonałą pomoc techniczną w mikroskopii konfokalnej i jego ekspercki wkład w interpretację wyników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C57BL6J myszy szczepmyszy JANVIER LABS
Ketamina 500Virbac Franceznieczulenie
Ksylazyna Rompun 2%Bayer Healthcareśrodek znieczulający
Neosynefryna 5% FaureEurophtarozszerzający
rozszerzenie Mydriaticum 0,5%Rozszerzacz Thea
SterdexNovartisprzeciwzapalna
żywica do zatapiania CryomatrixThermo Scientific6769006
Prowadnice adhezyjne Superfrost PlusThermo Scientific10143352prowadnice
anty-lamininoweSigmaL9393przeciwciało
anty-rodopsyny klon 4D2MilliporeMABN15
anty-syntetazy glutaminy klon GS-6Przeciwciało MilliporeMAB302
Antyglejowe fibrylarne białko kwasowePrzeciwciało Dako334
PNA LektynaSonda InvitrogenL32459
Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluorem AlexaPrzeciwciało Invitrogen
Odczynnik FluorsaveCalbiochem345789podłoża montażowego
QIAmp DNA Micro KitQIAGEN56304
Polimeraza DNA GoTaqPromegaM3001
Evans Niebieski barwnikSigmaE2129barwnik
5 i mikro; m filtrMillipore
Cytrynian soduSigmaS1804
Kwas cytrynowySigmaC1909-2.5KG
Spektrofotometria formamiduSigma295876-2L
FluoresceinaSigmaF2456barwnik
Micron IIIPhoenix Research LabsSystem mikroskopowy oparty na kolorowej kamerze 3 CCD, frame grabberze i gotowym oprogramowaniu umożliwia naukowcom obrazowanie siatkówki myszy.
Strzykawki insulinoweTerumoSS30M3109
Strzykawka 10 i mikro; l HamiltonDutscher74487Seringue 1701
Igła RN G33, 25 mm, PST 2Fisher Scientific11530332Iniekcje doszklistkowe
UltraMicroPump UMP3World Precision InstrumentsUMP3Wszechstronny wtryskiwacz wykorzystuje mikrostrzykawki do dostarczania objętości pikolitrów
UltraMicroPump (UMP3) (jeden) z kontrolerem SYS-Micro4UMP3-1Sterownik
Lupa lornetkowa SZ76ADVILABADV-76B2Zoom 0,66 x 5 x diody LED ze stojakiem epi i dia / Rozwarstwienie siatkówki
Nożyczki sprężynowe proste - 8,5 cmBionic France S.a.r.l15003-08Zakrzywione
nożyczki doVanna 15004-08
Pince Dumont 511254-20
Veriti 96-Well Thermal CyclerTechnologie życia4375786Thermocycler
Myjka ultradźwiękowaMateriały laboratoryjneG1125P1T
probówki omega Nanosep 30kVWR
SpeedvacFisher ScientificSC 110 A
SpektrofluorometrTECANinfinite M1000
przeciwciało cyfrowy wycinania siatkówki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Halfter, W. Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth. J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).
  2. Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis. Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).
  3. Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).
  4. Abdelkader, E., Lois, N. Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery. Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).
  5. Dalkara, D., et al. Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous. Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).
  6. Bringmann, A., et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).
  7. Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply. Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).
  8. Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management. Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).
  9. Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).
  10. Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
  11. Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).
  12. Yang, G. S., et al. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).
  13. Li, W., et al. Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye. Mol Vis. 15, 267-275 (2009).
  14. Koerber, J. T., et al. Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery. Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).
  15. Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells. PLoS One. 4 (10), e7467(2009).
  16. Vacca, O., et al. AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers. Glia. , (2013).
  17. Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors. Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).
  18. Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).
  19. McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348(2011).
  20. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  21. Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. J Vis Exp. (8), 313(2007).
  22. Kolstad, K. D., et al. Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration. Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).
  23. Sene, A., et al. Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina. PLoS One. 4 (10), e7329(2009).
  24. Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

bariera krew siatk wkawewn trzna b ona ograniczaj cakom rki M lleraAAV5ShH10iniekcja doszklistkowamikroskopia konfokalnaimmunohistochemia

Powiązane artykuły