Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model prosięcia encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków

19.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52454

⸱

16 maja 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Perinatal Research Unit, Department of Pediatrics, Institute of Clinical Medicine, Aarhus University Hospital, 2Department of Otorhinolaryngology and Head & Neck Surgery, Institute of Clinical Medicine, Aarhus University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

encefalopatia niedotlenieniowo-niedokrwienna po uduszeniu okołoporodowym może być badana na modelach zwierzęcych. Przedstawiono procedury niezbędne do ustalenia modelu encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków u prosiąt.

Streszczenie

Asfiksja urodzeniowa, która powoduje encefalopatię niedotlenieniowo-niedokrwienną (HIE), odpowiada za 0,66 miliona zgonów na całym świecie każdego roku, około jednej czwartej z 2,9 miliona zgonów noworodków na świecie. Modele zwierzęce HIE przyczyniły się do zrozumienia patofizjologii HIE i zwróciły uwagę na dynamiczny proces zachodzący w urazie mózgu spowodowanym zamartwicą okołoporodową. W związku z tym badania na zwierzętach zasugerowały okno czasowe dla strategii leczenia po zniewadze. Hipotermia została przetestowana jako metoda leczenia HIE w modelach pdiglet, a następnie okazała się skuteczna w badaniach klinicznych. Warianty modelu zostały zastosowane w badaniach wspomagających metod neuroprotekcyjnych, a badania ksenonu i melatoniny na prosiętach doprowadziły do badań klinicznych fazy I i II1,2. Model HIE prosiąt jest dalej wykorzystywany do badań resuscytacyjnych i hemodynamicznych noworodków, a także do badań niedotlenienia mózgu na poziomie komórkowym. Jest to jednak model wymagający technicznie, a zmiany w protokole mogą skutkować zbyt łagodnym lub zbyt poważnym uszkodzeniem mózgu. W tym artykule przedstawiono procedury techniczne niezbędne do stworzenia stabilnego modelu HIE noworodka u prosiąt. Najpierw nowonarodzone prosię (< 24 godziny, mediana masy ciała 1500 g) jest znieczulane, intubowane i monitorowane w konfiguracji porównywalnej do tej, która znajduje się na oddziale intensywnej terapii noworodków. Globalne niedotlenienie-niedokrwienie jest indukowane przez obniżenie wdechowej frakcji tlenu w celu uzyskania globalnego niedotlenienia, niedokrwienie poprzez niedociśnienie i płaskie zintegrowane EEG amplitudy śladowej (aEEG) wskazujące na niedotlenienie mózgu. Przeżycie jest wspierane przez dostosowanie natlenienia zgodnie z odpowiedzią aEEG i ciśnieniem krwi. Uszkodzenie mózgu określa się ilościowo za pomocą histopatologii i rezonansu magnetycznego po 72 godzinach.

Wprowadzenie

Asfiksja okołoporodowa jest ostrym i często nieprzewidywalnym stanem związanym z encefalopatią niedotlenieniowo-niedokrwienną (HIE). Ogólnym celem tego protokołu jest zademonstrowanie modelu przeżywalności prosiąt w okołoporodowej encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej. Model ten może być wykorzystany do zbadania wpływu różnych stopni niedotlenienia-niedokrwienia na mózg noworodka oraz eksperymentalnego leczenia neuropatologii, rezonansu magnetycznego i spektroskopii (MRI i MRS) oraz biomarkerów w płynach ustrojowych, takich jak krew, płyn mózgowo-rdzeniowy i mocz. Model okazał się również przydatny do badania układu sercowo-naczyniowego, układu oddechowego, nerek i wątroby, z których wszystkie są dotknięte globalnym niedotlenieniem i niedokrwieniem.

Asfiksja okołoporodowa jest wynikiem nieprawidłowego dostarczania tlenu w trakcie porodu lub w bezpośrednim okresie po porodzie. Niedotlenienie śródporodowe odpowiada za 0,66 miliona zgonów na całym świecie każdego roku, co stanowi około jednej czwartej z 2,9 miliona zgonów noworodków na świecie w 2012roku. Szacuje się, że w 2010 roku u 1,15 miliona dzieci rozwinęła się encefalopatia noworodkowa po uduszeniuporodowym4. HIE zdefiniowana jako encefalopatia u niemowląt urodzonych po 34 tygodniu ciąży występuje u 1-3/1000 żywych urodzeń5 w krajach uprzemysłowionych i do 8,5/1 000 żywych urodzeń w krajach rozwijającychsię4. Ryzyko zgonu wynosi 10-60%, a ryzyko niepełnosprawności neurologicznej u osób, które przeżyły, 30-100%6,7. 50,2 miliona lat życia skorygowanych niepełnosprawnością (DALY) przypisuje się śródporodowym zdarzeniom niedotlenienia4. Obecnie jedynym sposobem leczenia innym niż wspomagające w HIE jest hipotermia pohipoksyjna. W związku z tym postęp w procedurach diagnostycznych i strategiach leczenia ma zasadnicze znaczenie dla poprawy leczenia HIE8.

Poprawa rokowania po okołoporodowej asfiksji i leczeniu uszkodzeń mózgu u noworodków opiera się na poszerzaniu wiedzy o mechanizmach leżących u podstaw choroby i możliwych metodach leczenia. Modele zwierzęce HIE są szczególnie przydatne, ponieważ różne zdarzenia kliniczne mogą prowadzić do HIE, a częstość występowania w każdym pojedynczym ośrodku porodowym jestniska5. Konfiguracja eksperymentalna, w której wpływ zmienności biologicznej może zostać zminimalizowany, jest niezbędna podczas testowania nowych narzędzi prognostycznych i diagnostycznych oraz strategii leczenia. Model zwierzęcy powinien jak najbardziej przybliżyć sytuację kliniczną, przyczyniając się w ten sposób do zrozumienia mechanizmów patologicznych leżących u podstaw wywołanego urazu oraz dynamicznego procesu związanego z chorobą i jej wynikiem9. Modele zwierzęce noworodków HIE obejmowały wiele gatunków, w tym gryzonie, jagnięta i świnie. Dla porównania, nowonarodzone prosię jest bardziej podobne do ludzkiego noworodka pod względem wielkości, układu sercowo-naczyniowego10 i dojrzałości mózgu w momencie porodu11,12. Monitorowanie, instrumentacja i ocena wyników w modelu prosiąt są podobne do tych stosowanych w opiece klinicznej nad niemowlętami z HIE. W związku z tym model ten ma duży stopień przełożenia na opiekę nad noworodkiem.

Modele okołoporodowego niedotlenienia i HIE dla prosiąt są używane przez wiele grup i różnią się w wielu obszarach13. Zgodnie z celem eksperymentu, należy zwrócić szczególną uwagę na dobór leków, metodę wywoływania niedotlenienia-niedokrwienia, metodę kontrolowania czasu trwania i ciężkości urazu, resuscytację i opiekę po zniewadze oraz ocenę wyników. Aby uniknąć błędu systematycznego, w badaniach interwencyjnych należy zawsze stosować randomizowany projekt badania.

Metoda stosowana przy wywoływaniu niedotlenienia niedokrwiennego jest ważna. Globalne niedotlenienie prowadzące do HIE często prowadzi do niewydolności wielonarządowej obejmującej mózg, serce, płuca, nerki i wątrobę. W zależności od ocenianych wyników, modele HIE powinny opierać się na globalnym niedotlenieniu i niedokrwieniu, a nie polegać na ogniskowym niedokrwieniu, np. przez podwiązanie tętnic szyjnych14. W niedawnym artykule zastosowano kombinację niedotlenienia (FiO2 12%) i ucisku tętnicy szyjnej przy jednoczesnym utrzymaniu średniego ciśnienia tętniczego krwi > 40 mm Hg2. Inna grupa indukowała globalne niedotlenienie o 8%O2 do ujemnego nadmiaru zasady > 20 mmol/L lub średniego ciśnienia tętniczego krwi (MABP) < 15 mm Hg i uśmiercała zwierzęta po 4 godzinach15. Niedotlenienie było również miareczkowane przez rzut serca (do 30-40% wartości wyjściowej), MABP (do 30-35 mm Hg) i pH tętnic (6,95-7,05)16.

Modele globalnego niedotlenienia-niedokrwienia miareczkowanego przez tłumienie aEEG, podobne do tego przedstawionego w tym raporcie, wykazały encefalopatię, która jest klinicznie, elektrofizjologicznie i neuropatologicznie porównywalna do stanu występującego u uduszonego niemowlęciadonoszonego 17,18.

Stopień indukcji HIE jest niezbędny. Użyteczny model zwierzęcy HIE musi również umożliwiać testowanie nowych procedur diagnostycznych i opcji leczenia. Aby to umożliwić, modele powinny indukować umiarkowane HIE tam, gdzie istnieje potencjał terapeutyczny, ponieważ ciężkie uszkodzenie mózgu o niewielkim lub zerowym potencjale terapeutycznym byłoby mniej istotne przy ocenie nowych metod leczenia. Tolerancja na niedotlenienie różni się znacznie u badanych zwierząt. Wcześniejsze badania wykazały, że można osiągnąć bardziej konsekwentne uszkodzenie mózgu i że więcej zwierząt przeżywa17,19 poprzez indywidualizację indukowanego niedotlenienia zgodnie z odpowiedzią mózgową każdego prosiątka ocenianą za pomocą elektroencefalografii zintegrowanej amplitudy (aEEG), a nie przy użyciu ustalonej wartości FiO2 przez cały czas trwania hipoksji. Czas trwania supresji aEEG koreluje ze stopniem uszkodzenia mózgu, z niewielkimi zmianami histopatologicznymi przy < 20-minutowym tłumieniu aEEG i ciężkimi napadami nasilającymi się przy > 45-minutowym tłumieniu aEEG. Niedawny przegląd neuroprotekcyjnych metod leczenia HIE zidentyfikował potrzebę modeli przeżycia umożliwiających pomiary wyników behawioralnych w modelach zwierzęcych20.

Istnieje wiele zalet prezentowanego modelu prosiąt HI. Opiera się na gatunku, w przypadku którego wyniki z dużym prawdopodobieństwem przełożą się na fizjologię człowieka. Globalne modele niedotlenienia i niedokrwienia niewydolności wielonarządowej i miareczkowania niedotlenienia-niedokrwienia za pomocą aEEG indukuje stały stopień uszkodzenia mózgu z klinicznymi wynikami istotnymi dla przeżycia, tak że biomarkery, MRI i zachowanie mogą być oceniane w odpowiednich punktach czasowych.

Modele asfiksji okołoporodowej i HIE prosięt nie tylko znacząco przyczyniły się do obecnego wglądu w patofizjologię HIE, ale także skutecznie poprzedziły badania kliniczne, ostatecznie skutkując nowymi terapiami u ludzi. Badania na modelu prosiąt odegrały kluczową rolę w ustaleniu hipotermii jako metody leczenia HIE21 i są wykorzystywane w badaniach nad resuscytacją noworodków22. Różne grupy używały modeli prosiąt podczas wykonywania badań w obrębie asfiksji i HIE, a badania obejmują hipotermię23, hormon stymulujący alfa-melanocyty24, zatrzymanie akcji serca25, aktywność hydroksylazy tyrozyny26, powtarzającą się ekspozycję na hipoksję27, aktywność receptora NMDA14 i spektroskopię bliskiej podczerwieni28.

Model HIE prosiąt przedstawiony w tym raporcie jest technicznie trudny do pracy, ponieważ drobne poprawki w trakcie procedury mogą skutkować albo zbyt łagodnym, albo zbyt ciężkim uszkodzeniem mózgu29,2. Stwierdziliśmy, że w istniejącej literaturze brakowało wystarczająco dużo szczegółów, aby odtworzyć wcześniej opublikowane modele. W związku z tym w niniejszym raporcie demonstrujemy każdy etap procedur technicznych niezbędnych do ustanowienia modelu przeżycia prosiąt w ciągu 72 godzin, umożliwiając naukowcom ustanowienie tego zaawansowanego modelu do badania HIE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół został zatwierdzony przez duńską Inspekcję Eksperymentów na Zwierzętach (Danish Animal Experiments Inspectorate). Wszystkie zwierzęta testowe pozostawały pod narkozą przez cały czas trwania procedur. Powtórzenie tego protokołu musi być przeprowadzone zgodnie z krajowymi wytycznymi dotyczącymi etyki i dobrostanu zwierząt oraz zatwierdzone przez lokalne komisje etyczne.

1. Zwierzęta

  1. Prosięta rasy Danish Landrace w wieku < 24 h, o masie około 1,500 - 2,000 g.

2. Znieczulenie i płyny podtrzymujące

  1. Przygotuj sprzęt niezbędny do znieczulenia (Rycina 1): maskę do podawania sewofluranu, gaziki nasączone alkoholem, obwodowy kaniulę dożylną, gumkę recepturkę, strzykawki z solą fizjologiczną, propofol (5 mg/kg), fentanyl (10 µg/kg) oraz benzylpenicylinę procainową (15 000 IU/kg).
  2. Wprowadź znieczulenie, podając 1-2% sewofluranu przez maskę oddechową.
    1. Oceń głębokość znieczulenia, sprawdzając odruchy powiekowe oraz odruch cofania. Po upewnieniu się, że prosię jest głęboko znieczulone, wprowadź przez skórę obwodową kaniulę dożylną do żyły ucha.
    2. Aby potwierdzić drożność kaniuli dożylnej, przemyj ją 1-2 ml sterylnej 0.9% soli fizjologicznej. Podaj bolusy propofolu (5 mg/kg) i fentanylu (10 µg/kg). Po podaniu dawek bolusowych ponownie przemyj kaniulę dożylną, używając 1-2 ml sterylnej 0.9% soli fizjologicznej.
    3. Umieść strzykawki z propofolem (10 mg/ml) i fentanylem (10 µg/ml) w dwóch oddzielnych pompach infuzyjnych. Połącz przewody dożylne z obu pomp do trójdrożnego kurka, łącząc infuzje w jedną linię podłączoną do kaniuli dożylnej. Rozpocznij ciągłą infuzję dożylną propofolu (4-12 mg/kg/hr) i fentanylu (10 μg/kg/hr). Po uruchomieniu ciągłych infuzji nie podawaj kolejnych dawek bolusowych propofolu i fentanylu.
    4. Zaprzestań podawania znieczulenia gazowego sewofluranem.
    5. Wstrzyknij benzylpenicylinę procainową (15 000 IU/kg) podskórnie lub domięśniowo, zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi profilaktyki antybiotykowej. Powtarzaj codziennie. Na filmie pokazano podanie s.c., które u prosiąt skutkuje wyższym stężeniem w osoczu i dłuższym okresem półtrwania w porównaniu do podania i.m.
    6. Nałóż maść nawilżającą do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu. Delikatnie odciągnij dolną powiekę, tworząc kieszonkę. Wyciśnij niewielką ilość maści do wnętrza kieszonki. Zamknij oko, aby rozprowadzić maść. Co godzinę sprawdzaj, czy oczy nie są suche, i w razie potrzeby ponownie nałóż preparat.
    7. Rozpocznij ciągłą infuzję 5% glukozy/0.45% NaCl dożylnie w tempie 10 ml/kg/hr. Zredukuj tempo do 5 ml/kg/hr w trakcie i po hipoksji. Dostosuj tempo infuzji tak, aby utrzymać poziom glukozy we krwi w przedziale 2-10 mmol/L.

Narzędzia do znieczulenia na zielonej tkaninie, w tym strzykawki, rurki i worek Ambu do użytku medycznego.
Rycina 1. Sprzęt do znieczulenia i intubacji. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Intubacja i wentylacja

  1. Przygotuj sprzęt niezbędny do intubacji (Rysunek 1): bromek rokuronium (1 mg/kg) w celu rozluźnienia mięśni, pętlę z liny (zawiązać oba końce tej samej nylonowej liny o średnicy 4 mm, tworząc okrąg, jak przedstawiono w Rysunek 1) do otwierania pyska, patyczek bawełniany i weterynaryjny laryngoskop z prostym ostrzem, spray z ksylokainą (100 mg/ml), rurki endotrachealne z mankietem o różnych rozmiarach (rozmiary 3,0 mm, 2,5 mm, 2,0 mm), samorozprężający się worek 500 ml (maska z workiem i zaworem) do wentylacji, strzykawka 2 ml do pompowania mankietu oraz stetoskop.
  2. Wykonaj intubację zgodnie z poniższymi krokami:
    1. Umieść prosię w pozycji na plecach, podtrzymując szyję z każdej strony, aby zapewnić prosty dostęp do krtani w celu przeprowadzenia intubacji.
    2. Oszacuj długość rurki endotrachealnej, mierząc odległość od koniuszka nosa do wcięcia mostkowego (zazwyczaj około 13 cm).
    3. Założyć pętlę z liny wokół górnej szczęki (skierowanej w dół) i unieść dolną szczękę oraz język, aby utrzymać otwarcie pyska.
    4. Podaj rokuronium w formie bromku (1 mg/kg) dożylnie w celu wywołania rozluźnienia mięśni.
    5. Użyć laryngoskopu, aby unieść język do góry.
    6. Użyj patyczka z bawełnianą końcówką, aby uwolnić długą nagłośnię prosięcia, która może być wywinięta w stronę przełyku lub zaklinowana za podniebieniem miękkim.
    7. Przesunąć laringoskop do przodu, aby utrzymać nagłośnię uniesioną w stronę podstawy języka, co umożliwi pełny wgląd w chrząstki głosowe i więzadła głosowe.
    8. Nanieść miejscowo spray z ksylokainą (100 mg/ml) w obrębie krtani, aby zapobiec skurczom krtani.
    9. Przesuń rurkę endotrachealną przez fałdy głosowe. Aby ułatwić przejście przez wąskie chrząstki krtani, zastosuj ruch obrotowy. Wsuń rurkę na wcześniej zmierzoną odległość i podłącz ją do samorozprężającego się worka (maski z balonem i zaworem) w celu przeprowadzenia wentylacji manualnej. Aby zmniejszyć tarcie podczas intubacji, rozpyl na dystalną 1/3 rurki endotrachealnej spray z ksylokainą.
    10. Aby potwierdzić prawidłowe umiejscowienie rurki intubacyjnej: należy obserwować wszelkie oznaki trudności w oddychaniu, osłuchać klatkę piersiową, sprawdzając obustronny dopływ powietrza do obu płuc, wizualnie potwierdzić obecność kondensacji w proksymalnej części rurki intubacyjnej oraz zweryfikować obecność końcowego poziomu dwutlenku węgla za pomocą kolorymetrycznego detektora dwutlenku węgla lub poprzez pomiar CO2 w powietrzu wydychanym.2 odczyt z respiratora, jeśli jest dostępny. Prawidłowe stężenie dwutlenku węgla w powietrzu wydychanym na koniec wydechu (etCO2) wynosi około 5%. Wartość powyżej 2% wraz z prawidłowym kształtem krzywej potwierdza, że rurka endotrachealna znajduje się w tchawicy.
    11. Napompuj mankiet rurki endotrachealnej, aby zapobiec aspiracji. Ciśnienie pompowania mankietu powinno być niższe niż 25 cm H2O.2Aby uniknąć uszkodzeń niedokrwiennych otaczających tkanek, przytrzymując rurkę endotrachealną w odpowiedniej pozycji, owiń wokół niej kawałek taśmy, zamknij żuchwę i kontynuuj owijanie wokół pyska, aby unieruchomić rurkę. Delikatnie pociągnij za rurkę, aby upewnić się, że pozostaje ona na miejscu.
    12. Podłącz rurkę endotrachealną do respiratora.
  3. Dostosuj ustawienia respiratora: wentylacja sterowana objętością, objętość oddechowa (TV): 10 ml/kg [lub maksymalne ciśnienie wdechowe (PIP) 15 cm przy wentylacji sterowanej ciśnieniem]. Pozytywne ciśnienie końcowowydechowe (PEEP): 5 cm. Stosunek I:E 1:2. Częstotliwość oddychania: 35 (dostosuj częstotliwość w celu utrzymania końcowego stężenia CO22 (między 4,5 a 5,5 kPa).

4. Monitorowanie i pobieranie próbek płynów ustrojowych

Konfiguracja monitorowania medycznego, elektrody EKG, pulsoksymetr i kaniula dożylna na zielonym tle.
Rysunek 2. Sprzęt do monitorowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przygotuj sprzęt niezbędny do monitorowania (Rysunek 2): taśmę klejącą, sterylny lubrykant, sondę do ciągłego pomiaru temperatury rektalnej, elektrody do elektrokardiogramu (EKG), pulsoksymetr, brzytwę oraz elektrody EEG.
    1. Umieść sondę saturacyjną na tylnej kończynie, nasmaruj sondę do pomiaru temperatury rektalnej i wprowadź ją na 6 cm do odbytnicy, umieść nad zwierzęciem promiennik ciepła i/lub nadmuchiwany materac grzewczy, aby utrzymać temperaturę rektalną na poziomie fizjologicznym 38,5-39 °C, oraz umieść elektrody EKG.
    2. Ułóż prosię w pozycji brzusznej, aby ogolić obszary o wielkości 1 cm x 1 cm w celu umieszczenia podskórnych igłowych elektrod EEG; jedną przed każdym uchem oraz elektrodę referencyjną w linii środkowej tuż za oczami. Oczyść miejsce aplikacji elektrody wacikiem nasączonym alkoholem, a następnie wprowadź elektrodę igłową podskórnie. Zabezpiecz elektrody taśmą klejącą i ułóż prosię w pozycji grzbietnej.
    3. Włącz monitor aEEG.
      UWAGA: Amplitudowo zintegrowany EEG (aEEG) składa się z gęstego śladu z marginesami górnym i dolnym. Marginesy dolny i górny w tym modelu wynoszą zazwyczaj 15-50 μV, co często jest wartością wyższą niż u niemowląt. W czasie hipoksji należy zwrócić uwagę, że artefakty z EKG mogą fałszywie podnosić ślad aEEG. Leki podawane w bolusie (propofol lub fentanyl) mogą również przejściowo tłumić ślad aEEG i ich podawania należy w miarę możliwości unikać podczas eksperymentu. Podawanie leków oraz zdarzenia kliniczne powinny być zaznaczone, aby ułatwić interpretację śladu aEEG.
  2. Przygotuj sprzęt niezbędny do wprowadzenia cewników pępkowych w celu monitorowania centralnego ciśnienia tętniczego i pobierania krwi (Rysunek 3): sterylne rękawiczki, sterylne obłożenie, skalpel, waciki nasączone alkoholem, sterylne chusteczki, cewnik do żyły pępkowej (5 Fr), cewnik do tętnicy pępkowej (3,5 Fr), zestaw szewski z pincetą, zakrzywioną mikropincetą, nożyczkami, portaigłą i nicią chirurgiczną (np. rozmiar 3-0), przezroczysty plaster przylepny, strzykawki 5 ml do pobierania krwi.

Zestaw narzędzi chirurgicznych do procedur medycznych, zawierający strzykawki, nożyczki, skalpel i pęsetę.
Rysunek 3. Sprzęt do linii pępkowych i pobierania krwi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Zdezynfekuj i odizoluj pole wokół pępka. Używając skalpela, przetnij pępowinę jak najbliżej skóry. Jeśli w znieczulonym prosięciu nie odsłoni to naczyń pępkowych, nacinij skórę pępkową 2 mm poniżej pępowiny, aby odsłonić naczynia. Zidentyfikuj dwie małe tętnice pępkowe oraz jedną większą żyłę pępkową (Rysunek 4).
  2. Użyj zakrzywionej mikropincety, aby rozszerzyć tętnicę (Rysunek 4), a następnie wprowadź cewnik tętnicy pępkowej (3,5 Fr). Oszacuj długość wprowadzenia w cm według wzoru 3 x masa (kg) + 10 (wzór empiryczny oparty na prawidłowym umiejscowieniu w aorcie zstępującej powyżej tętnic nerkowych podczas sekcji).
  3. Wprowadź drugi cewnik 5 Fr na głębokość 5 cm do żyły pępkowej (Rysunek 4). Zweryfikuj wewnątrznaczyniowe umiejscowienie cewnika poprzez powrót krwi. Zabeziecz cewniki, wykonując szew w formie sznurowania wokół pępka; przełóż końce szwu wokół każdego z cewników pępkowych i zawiąż węzeł. Przykryj cewniki przezroczystym opatrunkiem samoprzylepnym.
  4. Pobierz próbki krwi w określonych punktach czasowych: 1) bezpośrednio przed hipoksją, 2) w 30 min po wystąpieniu niedotlenienia, 3) po zakończeniu 45 min niedotlenienia, 4) 2 h po niedotlenieniu. W zależności od celu eksperymentu można wybrać inne punkty czasowe pobierania krwi.
  5. Wykorzystaj analizę gazometryczną krwi tętniczej z próbek pobranych podczas hipoksji, aby zweryfikować zmiany gazowe wywołane niedotlenieniem i niedokrwieniem (Tabela 1). Należy pamiętać, że prosięta przy urodzeniu mają niski poziom hemoglobiny (około 8 g/dL) i mogą stać się anemiczne w wyniku częstego pobierania krwi. Pobieraj mniej niż 2 ml krwi/kg masy ciała podczas jednego pobrania oraz mniej niż 5 ml krwi/kg masy ciała w ciągu 24 h i przestrzegaj lokalnych wytycznych dotyczących pobierania krwi. Objawy anemii obejmują spadek hematokrytu oraz tachykardię.
  6. Podłącz linię tętniczą do monitora w celu ciągłego monitorowania wewnątrzarterialnego ciśnienia krwi (MABP). Linii żylnej używaj do podawania płynów i leków.

Zbliżenie procedury chirurgicznej, preparowanie tkanki pęsetą w warunkach operacji medycznej.
Rycina 4. Naczynia pępkowe. Żyła pępkowa (po prawej) i jedna z dwóch tętnic pępkowych (po lewej). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Hipoksja

  1. Odczekać 60 min po zakończeniu monitorowania. Wywołać hipoksję poprzez przełączenie na mieszaninę gazową 4% O2/96% N2. Ściśle monitorować parametry życiowe oraz aEEG i kontynuować hipoksję przez 45 min.
  2. Gdy zapis aEEG stanie się płaski (górna granica <7 µV), dostosować natlenienie poprzez zmianę frakcji tlenu w mieszaninie wdechowej (FiO2) oraz średniego ciśnienia w drogach oddechowych do najwyższego poziomu FiO2 utrzymującego płaski zapis aEEG zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 5. Dążyć do uzyskania MABP poniżej 70% wartości wyjściowej przez co najmniej 10 min i w razie potrzeby obniżyć FiO2, aby zapewnić hipotensję i niedokrwienie. Wykazano wcześniej w innych badaniach19,13,30, że opisany poziom hipotensji prowadzi do istotnego niedotleniczego i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu.
  3. W przypadku ciężkiej hipotensji (MABP <25 mm Hg) postępować etapowo w następujący sposób: krótko zwiększyć FiO2 o 1-5%, podać bolus soli fizjologicznej (10 ml/kg), włączyć wlew dopaminy (5-20 µg/kg/min) oraz wlew noradrenaliny (20 ng-1 µg/kg/min).
  4. W przypadku napadów trwających >10 min (napady kloniczne, toniczne lub miokloniczne, zazwyczaj ogniskowe lub wskazane przez nagłe zmiany amplitudy aEEG) postępować etapowo (zachowując 30 min odstępu przed kolejną iniekcją): powolny bolus fenobarbitalu i.v. 20 mg/kg, powtórzyć podanie fenobarbitalu i.v. 20 mg/kg oraz podać midazolam i.v. 0,5 mg/kg.
    1. Jeśli rozwiną się napady niepodatne na farmakoterapię, wskazana jest eutanazja.

Schemat blokowy przedstawiający proces regulacji FiO2 i Paw dla celów aEEG, HR i MABP w terapii oddechowej.
Rysunek 5. Schemat blokowy hipoksji-ischemii. Schemat blokowy przedstawiający regulację natlenienia (FiO2 i Paw) w zależności od odpowiedzi aEEG. Średnie ciśnienie w drogach oddechowych (Paw) regulowano poprzez zmianę PIP/TV (niższe PIP daje niższe Paw) oraz częstość oddechów (niższe RR daje niższe Paw). Docelowe aEEG = górna granica zapisu < 5 µV i dolna granica zapisu > 3 µV (średnio 4 µV). Docelowa częstość akcji serca (HR) = > 80. Docelone średnie ciśnienie tętnicze (MABP) = MABP > 25. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Przeżywalność po 72 h

  1. Ściśle monitoruj prosię po niedotlenieniu, stopniowo zmniejszając tempo infuzji propofolu i fentanylu. Wykonaj ekstubację w momencie, gdy zwierzę zacznie oddychać samodzielnie.
  2. W okresie przeżycia utrzymuj prosięta w jednostce doświadczalnej pod całodobowym nadzorem personelu przeszkolonego w zakresie intensywnej opieki i monitorowania. Podawaj dożylne infuzje glukozy w dawce 20 ml/kg co 2-3 godziny. W 26-48 godzinie po niedotlenieniu i niedokrwieniu można rozpocząć częściowe karmienie z butelki. W przypadku braku odruchu wymiotnego karmienie z butelki może doprowadzić do aspiracji do tchawicy i płuc.
  3. Jeśli jest to istotne dla eksperymentu, oceń stan neurologiczny za pomocą systemu punktowego opracowanego przez Thoresena et al., opisanego szczegółowo w oryginalnej publikacji17.

7. Ocena wyników

  1. Po 72 hr ponownie podać znieczulenie i zastosować wentylację zgodnie z opisem w sekcjach 2 i 3. Wykonać badanie MRI przy użyciu odpowiednich modalności obrazowania, zgodnie z opisem Munkeby et al.31 oraz innych autorów2.
  2. Na koniec eksperymentu przeprowadzić eutanazję prosiąt za pomocą śmiertelnej dawki pentobarbitalu (5 g/kg i.v.).
  3. Przygotować mózg do badania zgodnie z celem eksperymentu.
    1. Dla histologii mózgu na tkance utrwalonej w formalinie: zastosować perfuzję przezsercową 4% paraformaldehydu w PBS, a następnie przeprowadzić sekcję i potrwalanie w paraformaldehydzie zgodnie z opisem Robertson et al.2, Chakkarapani et al1 lub Liu et al.18 lub usunąć mózg i zanurzyć go w 4% paraformaldehydzie zgodnie z opisem Andresen et al.32
    2. Dla analiz wymagających tkanki błyskawicznie zamrożonej (np. analiza RNA lub testy aktywności enzymatycznej33): Usunąć mózg, wyciąć interesujące regiony mózgu i błyskawicznie zamrozić bloki tkanki o maksymalnym wymiarze 1 cm x 1 cm w ciekłym azocie zgodnie z opisem Munkeby et al.33

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wpływ niedotlenienia i niedokrwienia mózgu, który występuje podczas indukowanego urazu, dokumentuje się poprzez zapis śladu aEEG. Reprezentatywny ślad aEEG przedstawiono na Rysunku 6.

Wynik elektroforezy; wykres przedstawia rozdzielenie białek; analiza danych; detekcja piku; badania laboratoryjne.
Rysunek 6. Reprezenta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ze względu na swoją złożoność, opisany model może być wdrożony tylko w placówkach akredytowanych i doświadczonych w badaniach na zwierzętach. Przed rozpoczęciem doświadczeń należy uzyskać zgodę lokalnych komisji bioetycznych i przez cały czas należy zapewnić optymalny dobrostan zwierząt. Ponieważ model opiera się na przeżywalności badanych zwierząt, ważne jest, aby podczas zabiegów inwazyjnych utrzymywane było sterylne środowisko, aby zapobiec infekcjom.

Wybór znieczulenia jest ważny, ponieważ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Johnowi Kristensenowi i Sørenowi Braadowi Andersenowi z Wydziału Komunikacji Szpitala Uniwersyteckiego w Aarhus w Danii za wyjątkową pomoc przy filmowaniu i montażu. Zootechnik Diana Gyldenløve i weterynarz Birgitte Kousgaard, Instytut Medycyny Klinicznej Szpitala Uniwersyteckiego w Aarhus, Dania za pomoc w opiece nad zwierzętami. Badanie to było wspierane przez Fundację Lundbecka, Fundację Laerdal na rzecz Medycyny Doraźnej, Fundację Badawczą Regionu Danii Środkowej, Fundację Augustinus, Fundację Aase i Ejnara Danielsensów, Instytut Medycyny Klinicznej Szpitala Uniwersyteckiego w Aarhus, Fundację Brødrene Hartmanns, Fundację Karen Elise Jensens, Fonden til Lægevidenskabens Fremme oraz Marie Dorthea og Holger From, Haderslevs Fond.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ciepły w dotyku koc pediatrycznyCovidien5030840
Samoprzylepna zasłona apertrueBarrier915447
Obłożenie użytkowe (sterylne) 75x80 cmBariera800530
NeoflonBD - Luer391350
LaryngoskopMiller85-0045
Rurka dotchawicza 2,5 mm Covidien111-25
Rurka dotchawicza 3,0 mm z mankietemUnomedicalMM61110030
Rurka dotchawicza 3,5 mm z mankietemUnomedicalMM61110035
Aparat do znieczuleniaGE Healthcare1009-9002-000
EEG - elektrody/jednorazowa podskórna elektroda igłowaCephalonACCE120550
EKG - elektrodymedtronic3010107-003
Elektrody EKG do rezonansu magnetycznegoPhilipsACCE120550
Próbnik krwi tętniczej - aspiratorRadiometr medyczny ApS956552
Poliuretanowy cewnik do żyły pępowinowej (5 Fr/CH)Covidien8888160341
Poliuretanowy cewnik do żyły pępowinowej (3,5 Fr/ch)Covidien8888160333
Zestaw do szycia (rozmiar 3-0)Covidien8886 623341
BD Igła do kręgosłupa 0,7x38mmIgły BD405254
Gaz z 96% azotem / 4% tlenemAir Liquidewykonane na zamówienie
System NeuroMonitor (CFM)Natus Medical IncorporatedOBM70002

Bibliografia

  1. Chakkarapani, E., et al. Xenon enhances hypothermic neuroprotection in asphyxiated newborn pigs. Annals of. 68, 330-341 (2010).
  2. Robertson, N. J., et al. Melatonin augments hypothermic neuroprotection in a perinatal asphyxia model. Brain : a journal of neurology. 136, 90-105 (2013).
  3. Lawn, J. E., et al. Every Newborn: progress, priorities, and potential beyond survival. Lancet. 384, 189-205 (2014).
  4. Lee, A. C., et al. Intrapartum-related neonatal encephalopathy incidence and impairment at regional and global levels for 2010 with trends from 1990. Pediatric research. 74, Suppl 1. 50-72 (2013).
  5. Kurinczuk, J. J., White-Koning, M., Badawi, N. Epidemiology of neonatal encephalopathy and hypoxic-ischaemic encephalopathy. Early human development. 86, 329-338 (2010).
  6. Shankaran, S., Woldt, E., Koepke, T., Bedard, M. P., Nandyal, R. Acute neonatal morbidity and long-term central nervous system sequelae of perinatal asphyxia in term infants. Early human development. 25, 135-148 (1991).
  7. Robertson, C. M., Finer, N. N., Grace, M. G. School performance of survivors of neonatal encephalopathy associated with birth asphyxia at term. The Journal of pediatrics. 114, 753-760 (1989).
  8. Bennet, L., Booth, L., Gunn, A. J. Potential biomarkers for hypoxic-ischemic encephalopathy. Seminars in feta., & neonatal medicine. 15, 253-260 (2010).
  9. Yager, J. Y., Ashwal, S. Animal models of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Pediatric neurology. 40, 156-167 (2009).
  10. Buckley, N. M. Maturation of circulatory system in three mammalian models of human development. Comparative biochemistry and physiology. A, Comparative. 83, 1-7 (1986).
  11. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early human development. 3, 79-83 (1979).
  12. Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Archives of disease in childhood. 48, 757-767 (1973).
  13. Foster, K. A., et al. An improved survival model of hypoxia/ischaemia in the piglet suitable for neuroprotection studies. Brain research. 919, 122-131 (2001).
  14. LeBlanc, M. H., Li, X. Q., Huang, M., Patel, D. M., Smith, E. E. AMPA antagonist LY293558 does not affect the severity of hypoxic-ischemic injury in newborn pigs. Stroke; a journal of cerebral circulation. 26, 1908-1914 (1995).
  15. Andresen, J. H., et al. Nicotine affects the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the hippocampus of hypoxic newborn piglets. J Perinat Med. 37, 553-560 (2009).
  16. Cheung, P. Y., Gill, R. S., Bigam, D. L. A swine model of neonatal asphyxia. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  17. Thoresen, M., et al. A piglet survival model of posthypoxic encephalopathy. Pediatric research. 40, 738-748 (1996).
  18. Liu, X., Tooley, J., Loberg, E. M., Suleiman, M. S., Thoresen, M. Immediate hypothermia reduces cardiac troponin I after hypoxic-ischemic encephalopathy in newborn pigs. Pediatric research. 70, 352-356 (2011).
  19. Bjorkman, S. T., et al. Hypoxic/Ischemic models in newborn piglet: comparison of constant FiO2 versus variable FiO2 delivery. Brain research. 1100, 110-117 (2006).
  20. Robertson, N. J., et al. Which neuroprotective agents are ready for bench to bedside translation in the newborn infant. The Journal of pediatrics. 160, 544-552 (2012).
  21. Jacobs, S. E., et al. Cooling for newborns with hypoxic ischaemic encephalopathy. Cochrane Database Syst Rev. 1, CD003311(2013).
  22. Andresen, J. H., et al. Resuscitation with 21 or 100% oxygen in hypoxic nicotine-pretreated newborn piglets: possible neuroprotective effects of nicotine. Neonatology. 93, 36-44 (2008).
  23. Karlsson, M., et al. Delayed hypothermia as selective head cooling or whole body cooling does not protect brain or body in newborn pig subjected to hypoxia-ischemia. Pediatric research. 64, 74-78 (2008).
  24. Kovacs, J., et al. Asphyxia-induced release of alpha-melanocyte-stimulating hormone in newborn pigs. Peptides. 22, 1049-1053 (2001).
  25. Varvarousi, G., et al. Asphyxial cardiac arrest, resuscitation and neurological outcome in a Landrace/Large-White swine model. Laboratory animals. 45, 184-190 (2011).
  26. Tammela, O., Pastuszko, A., Lajevardi, N. S., Delivoria-Papadopoulos, M., Wilson, D. F. Activity of tyrosine hydroxylase in the striatum of newborn piglets in response to hypocapnic hypoxia. Journal of neurochemistry. 60, 1399-1406 (1993).
  27. Cote, A., Barter, J., Meehan, B. Age-dependent metabolic effects of repeated hypoxemia in piglets. Canadian journal of physiology and pharmacology. 78, 321-328 (2000).
  28. Tichauer, K. M., et al. Assessing the severity of perinatal hypoxia-ischemia in piglets using near-infrared spectroscopy to measure the cerebral metabolic rate of oxygen. Pediatric research. 65, 301-306 (2009).
  29. Jasani, M. S., Salzman, S. K., Tice, L. L., Ginn, A., Nadkarni, V. M. Anesthetic regimen effects on a pediatric porcine model of asphyxial arrest. Resuscitation. 35, 69-75 (1997).
  30. Chakkarapani, E., Thoresen, M., Liu, X., Walloe, L., Dingley, J. Xenon offers stable haemodynamics independent of induced hypothermia after hypoxia-ischaemia in newborn pigs. Intensive care medicine. 38, 316-323 (2012).
  31. Munkeby, B. H., et al. A piglet model for detection of hypoxic-ischemic brain injury with magnetic resonance imaging. Acta radiologica. 49, 1049-1057 (2008).
  32. Andresen, J. H., et al. Newborn piglets exposed to hypoxia after nicotine or saline pretreatment: long-term effects on brain and heart. J Matern Fetal Neonatal Med. 22, 161-168 (2009).
  33. Munkeby, B. H., et al. Resuscitation with 100% O2 increases cerebral injury in hypoxemic piglets. Pediatric research. 56, 783-790 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zintegrowana amplituda EEGobrazowanie rezonansem magnetycznymbadanie neuropatologicznewentylacja mechanicznawprowadzenie cewnika pępkowegoindukcja znieczuleniaindukcja hipoksjikwantyfikacja uszkodzenia mózgu
Model prosięcia encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.