Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test biologiczny o małej objętości do oceny wspólnej hodowli bakterii i fitoplanktonu przy użyciu fluorometrii z modulacją amplitudy WATER-Pulse-Amplitude (WATER-PAM)

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52455

⸱

11 marca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alberta

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tej procedury jest wykazanie powtarzalności i zdolności adaptacyjnych stosowania formatu płytki do mikroglonów do badań przesiewowych. Ten szybki ekran łączy fluorometrię WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) w celu pomiaru wydajności fotosyntezy jako wskaźnika zdrowia Photosystem II (PSII) z kokulturami bakterii i glonów o małej objętości.

Streszczenie

Konwencjonalne metody eksperymentalnego manipulowania mikroalgami wykorzystywały duże objętości hodowli (od 20 ml do 5 l), dzięki czemu kultura może być podpróbkowana przez cały czas trwania eksperymentu1–7. Podpróbkowanie dużych objętości może być problematyczne z kilku powodów: 1) powoduje różnice w całkowitej objętości i stosunku powierzchni do objętości kultury podczas eksperymentu; 2) często stosuje się pseudoreplikację (tj. powtórzenie próbek z tej samej kolby do leczenia8) zamiast prawdziwych powtórzeń (tj. próbkowania z powtórzonych zabiegów); 3) czas trwania eksperymentu jest ograniczony całkowitą objętością; oraz 4) hodowle akseniczne lub zwykła mikrobiota bakteryjna są trudne do utrzymania podczas długotrwałych eksperymentów, ponieważ zanieczyszczenie często występuje podczas pobierania podpróbek.

Użycie płytek do mikromiareczkowania umożliwia użycie objętości 1 ml hodowli dla każdej kontrpróby, z maksymalnie 48 oddzielnymi zabiegami na płytce o wymiarach 12,65 x 8,5 x 2,2 cm, zmniejszając w ten sposób objętość eksperymentalną i pozwalając na rozległą replikację bez podpróbkowania jakiegokolwiek traktowania. Ponadto technika ta może być modyfikowana w celu dopasowania do różnych formatów eksperymentalnych, w tym: kokultur bakterii i glonów, testów fizjologii glonów i badań przesiewowych toksyn9-11. Próbki z pojedynczych studzienek z glonami, bakteriami i/lub kokulturami można pobierać do wielu procedur laboratoryjnych, w tym między innymi: fluorometrii WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM), mikroskopii, liczby jednostek tworzących kolonie bakteryjne (cfu) i cytometrii przepływowej. Połączenie formatu płytki do mikromiareczkowania i fluorometrii WATER-PAM pozwala na wielokrotne szybkie pomiary wydajności fotochemicznej i innych parametrów fotochemicznych przy niewielkiej zmienności między próbkami, wysokiej odtwarzalności i unikaniu wielu pułapek związanych z podpróbkowaniem balonu lub kolby stożkowej w trakcie eksperymentu.

Wprowadzenie

Fizjologia fitoplanktonu była tradycyjnie badana w eksperymentach na skalę mezoskalową od 20 ml w kolbach stożkowych do 5 ml w beczkach1–7. Ta skala eksperymentalna wymaga podpróbkowania do monitorowania eksperymentalnego, ponieważ poświęcanie próbek powtórzonych dla każdego punktu czasowego tworzy niemożliwą do opanowania konfigurację eksperymentalną.

Możliwość zwiększenia liczby niezależnych eksperymentów przy użyciu tej samej przestrzeni inkubatora dobowego poprzez miniaturyzację objętości eksperymentalnej do eksperymentów fizjologii glonów zmniejszy lub wyeliminuje ograniczenia podpróbkowania i pseudo-replikacji z dużych objętości. Opracowano format płytki do mikromiareczkowania do testów biologicznych glonów przy użyciu objętości 1 ml kultury do eksperymentalnego manipulowania glonami w zmiennych warunkach. Ta niewielka objętość doświadczalna pozwala na zwiększenie liczby kontrprób, zwiększa odtwarzalność eksperymentalną ze względu na zmniejszoną zmienność między próbkami powtórzonymi a eksperymentami oraz umożliwia prawdziwą replikację przy zachowaniu kontroli eksperymentalnej (tj. aksenicznych kultur glonów) przez 140 dni (Rysunek 2)12.

Ten format płytki do mikromiareczkowania można łatwo dostosować do różnych pytań eksperymentalnych, takich jak: czy bakteria ma symbiotyczne, neutralne lub chorobotwórcze interakcje ze swoim gospodarzem glonowym? Czy dodatek związku jest stymulujący czy toksyczny dla algi? Na te i inne pytania można odpowiedzieć w szybki i wydajny sposób, korzystając z nowego formatu9–11.

48-dołkowa płytka do hodowli mikromiareczkowej pozwala na to, aby każda 1 ml studzienki była niezależnym układem eksperymentalnym, który jest pobierany w jednym punkcie czasowym. Z tej objętości 1 ml można pobrać próbki różnych parametrów, w tym między innymi: fluorescencji chlorofilu i parametrów fotochemicznych za pomocą fluorometrii WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) (patrz tabela materiałów i sprzętu)13. Fluorometria WATER-PAM jest szybką i nieinwazyjną techniką, która może być stosowana do monitorowania eksperymentów przeprowadzanych na algach13. Umożliwia pomiar wydajności fotosyntezy i zdrowotności PSII od małej objętości kultury (150 - 300 μl kultury rozcieńczonej w pożywce do objętości 2 - 4 ml dla WATER-PAM)14,15. Oprócz fluorometrii WATER-PAM, ta konfiguracja może być używana do pomiaru wielu innych parametrów, w tym między innymi: mikroskopii w celu wizualizacji bakterii przyczepionych do komórek glonów i zmian w morfologii komórek glonów; liczba jednostek tworzących kolonie bakteryjne (CFU); i cytometria przepływowa do zliczania komórek glonów i identyfikacji subpopulacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Obliczenia dla układu eksperymentalnego

  1. Obliczyć objętość kultur glonów i/lub bakterii niezbędną do przygotowania kontroli wymaganych dla całego eksperymentu, korzystając z równania 1:
    Równowaga statyczna; równanie: V_control=(0.5ml/well)×(3wells/control)×(ycontrols/d)×(zd); schemat.
    Gdzie y oznacza liczbę kontroli potrzebnych na dzień, a z oznacza liczbę dni.
  2. Obliczyć objętość kultur glonów i/lub bakterii niezbędną do przygotowania kokultur do eksperymentu, korzystając z równania 2:
    Równanie dla objętości kokultury, V. Formuła ze zmiennymi do obliczeń systemu kultur.
    UWAGA: Możliwe jest zastąpienie eksperymentów z „kokulturami” dowolnym screeningiem związków; należy jedynie dostosować końcowe stężenia związku, rozpuszczalnika i glonów do projektu eksperymentalnego.
  3. Wykorzystać równania 1 i 2 do obliczenia końcowej objętości kultury glonów we wczesnej fazie wykładniczej (zazwyczaj 5 dni dla ~104 cells/ml, ale powinno to zostać określone poprzez wyznaczenie krzywej wzrostu glonów) wymaganej do eksperymentu (objętość ta jest niezbędna do kroku 2.3), korzystając z równania 3:
    Równanie pokazujące obliczanie objętości kultury glonów we wczesnej fazie wykładniczej; VA=Vcontrol+Vco-culture+10ml.
  4. Wykorzystać równania 1 i 2 do obliczenia końcowej objętości kultury bakterii o stężeniu 104 cfu/ml (lub pożądanego stężenia inokulum) wymaganej do eksperymentu (objętość ta jest niezbędna do kroku 4.2), korzystając z równania 4:
    Formuła obliczania objętości kultury bakterii: VB = Vcontrol + Vco-culture + 10 ml.
    UWAGA: Dodatkowe 10 ml w krokach 1.3 i 1.4 należy przeznaczyć na błędy pipetowania oraz wszelkie testy wykonywane (np. WATER-PAM, cytometria przepływowa, mikroskopia itp.) w dniu 0 d. Zwiększyć tę objętość w razie potrzeby, aby dostosować ją do projektu eksperymentalnego.
    UWAGA: Przykładowe obliczenia dla eksperymentu 8-dniowego znajdują się w sekcji 10. Przepisy na pożywki znajdują się w tabeli uzupełniającej.

2. Hodowla komórek glonów do przygotowania eksperymentalnego

  1. Wyizolować lub pozyskać aktywnie rosnącą aseptyczną kulturę glonów.
  2. Aseptycznie przenieść 10% końcowej objętości kultury glonów do sterylnej pożywki dla glonów (np. L1 lub podobnej morskiej pożywki dla glonów, patrz tabela Materiały i Sprzęt), zapewniając rozcieńczenie kultury glonów w świeżej pożywce w stosunku 1:9. Hodować rozcieńczone glony w inkubatorze dobowym, stosując wcześniej ustalone warunki wzrostu dla danego szczepu (np. powszechnie stosuje się 18 °C z cyklem światło:ciemność 16:8 h).
  3. Gdy kultura osiągnie wczesną fazę wykładniczą, ponownie przenieść glony do tej samej sterylnej pożywki (np. L1 lub podobnej morskiej pożywki dla glonów), zapewniając końcowe rozcieńczenie 1:9 oraz taką końcową objętość glonów, aby była ona równa obliczonej wartości VA (krok 1.3).
    UWAGA: Ważne jest upewnienie się, że kultury te są aseptyczne. Wszystkie pożywki i butelki ze stokami glonów należy przetestować pod kątem kontaminacji, wysiewając alikwot 20 μl na ogólną morską pożywkę bakteryjną (np. Marine Broth 2216 uzupełnioną o 1,5% agaru lub podobną).
  4. Hodować kulturę glonów do wczesnej fazy wykładniczej (~104 komórek/ml).
    UWAGA: Każdy szczep glonów posiada unikalną krzywą wzrostu, zależną od warunków hodowli. Wczesną fazę wykładniczą (~104 komórek/ml) można wyznaczyć, sporządzając krzywą wzrostu glonów na podstawie gęstości komórek (tj. z wykorzystaniem cytometrii przepływowej lub mikroskopii).

3. Przygotowanie komórek bakteryjnych do inokulacji

  1. Wstępnie określ stężenie bakterii (cfu/ml) i gęstość optyczną (OD) bakterii w fazie stacjonarnej, wykonując krzywą wzrostu w wybranym podłożu bakteryjnym i w określonych warunkach wzrostu (np. Marine Broth 2216 w 25 °C i 160 rpm lub podobnych). Wykorzystaj te informacje do hodowli komórek (krok 3.3) oraz do późniejszego prawidłowego rozcieńczenia komórek w kroku 3.7.
  2. Aseptycznie przenieś wyizolowaną i świeżo wyhodowaną kolonię bakteryjną z płytki z 1,5% agarem (np. Marine Broth 2216 uzupełniony o 1,5% agaru lub podobne stałe podłoże dla bakterii morskich) do 5 ml płynnego podłoża bakteryjnego (np. Marine Broth 2216 lub podobnego podłoża dla bakterii morskich).
  3. Hoduj bakterie do fazy stacjonarnej na bębnie obrotowym lub wytrząsarce (~12–36 h, zależnie od gatunku bakterii). Zaplanuj eksperyment tak, aby bakterie osiągnęły fazę stacjonarną (~108 - 109 cfu/ml) w tym samym czasie, w którym komórki glonów osiągną wczesną fazę wykładniczą (~104 komórek/ml).
  4. Za pomocą pipety spłucz biofilm przytwierdzony do probówki do podłoża. Odpipetuj 1 ml dobrze wymieszanej kultury bakteryjnej do sterylnej mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przez 1 min przy 14,000 x g.
  5. Usuń i zutylizuj nadfiltr (podłoże bakteryjne), nie naruszając osadu (komórek bakteryjnych). Dodaj 1 ml sterylnego podłoża dla glonów (np. L1 lub podobnego) do mikroprobówki (z osadem). Wymieszaj mikroprobówkę w wortexie, aby resuspendować osad w podłożu dla glonów.
  6. Drugie przemywanie: powtórz krok 3.5.
    UWAGA: Krytyczne jest przemycie komórek bakteryjnych podłożem dla glonów w celu całkowitego usunięcia całego podłoża bakteryjnego, detrytusu komórkowego, wydzielonych białek i małych cząsteczek z komórek przed inokulacją glonów, ponieważ mogłoby to zmienić skład odżywczy podłoża dla glonów lub wprowadzić cząsteczki biologicznie czynne do badania.
  7. Wykonaj rozcieńczenia seryjne przemytych komórek bakteryjnych w podłożu dla glonów do stężenia końcowego, które jest 100-krotnie wyższe niż pożądane końcowe stężenie bakterii (cfu/ml). Zachowaj mikroprobówkę zawierającą komórki przemyte i rozcieńczone w podłożu dla glonów do kroku 4.2.
    UWAGA: Zaplanuj eksperyment, zakładając stosunek glonów do bakterii 1:1 w dniu 0. Aby to osiągnąć, pożądane początkowe stężenie bakterii dla eksperymentu powinno wynosić 104 cfu/ml, zatem w kroku 3.7 początkowe komórki należy rozcieńczyć seryjnie do 106 cfu/ml.

4. Przygotowanie bakterii do układu eksperymentalnego

  1. Przygotuj 4 sterylne, autoklawowane szklane kolby stożkowe i opisz je następująco: a) „kolba kontrolna z algami”, b) „kolba z rozcieńczonym szczepem bakterii”, c) „kolba kontrolna z bakteriami” oraz d) „kolba do kokultury”.
  2. Rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną z krok 3.7 1:99 ze sterylną pożywką dla alg do objętości końcowej = VB (krok 1.4). Przygotować rozcieńczenie w kolbie z etykietą „rozcieńczony zapas bakterii” (krok 4.1).
    UWAGA: W poprzednim przykładzie (krok 4.2) to rozcieńczenie 1:99 daje końcowe stężenie 104 jtk/ml. Zamieszać zawartość kolby poprzez delikatne kręcenie, aby wymieszać komórki.
  3. Pipeta Vkontrola (krok 1.1) z rozcieńczonego zapasu bakterii i przenieść go do kolby z kontrolą bakteryjną.
  4. Pipeta Vkontrola sterylnego pożywki dla alg do kolby kontrolnej z bakteriami (jest to rozcieńczenie 1:1). Zakręć kolbą, aby wymieszać komórki, i odstaw do kroku 7.3.
  5. Pipeta Vkokultura z kolby z rozcieńczonymi bakteriami do kolby do kokultury; odstawić kolbę do etapu 6.1.
    UWAGA: Podczas jednoczesnego prowadzenia wielu współupraw na tej samej algie (t.j. w przypadku kokultury dwóch różnych izolatów bakteryjnych (z jedną kontrolą) konieczne jest ponowne obliczenie Vkokultura dla każdego szczepu osobno, a następnie powtórzyć krok 4.5 dla każdej kokultury z osobna. Konieczne jest również zwiększenie VA obliczone w kroku 1.3, aby objąć obie kokultury, zgodnie z równaniem 5:
    Equation for total volume in co-culture experiment, V_A=V_control+V_co-culture1+V_co-culture2+10ml.

5. Przygotowanie glonów do układu eksperymentalnego

  1. Delikatnie wymieszaj kulturę alg w wczesnej fazie wzrostu wykładniczego (z kroku 2.4) za pomocą końcówki pipety o szerokim wylocie, aż komórki zostaną dobrze wymieszane.
  2. Przenieś objętość Vcontrol z butelki z zapasem alg do kolby kontrolnej z algami. Do pipetowania użyj delikatnie pipety 10 ml. Następnie umieść butelkę z zapasem alg z powrotem w inkubatorze dobowym.
  3. Przenieś objętość Vcontrol sterylnego medium dla alg do kolby kontrolnej z algami (jest to rozcieńczenie 1:1). Zamieszaj kolbą i umieść ją w inkubatorze dobowym aż do momentu wykonania kroku 7.4.

6. Przygotowanie eksperymentalnej kokultury

  1. Delikatnie przenieś pipetą Vco-culture z kolby z zapasem alg do kolby z kokulturą bakteryjną z kroku 4.5. Przenieś kolbę z kokulturą z powrotem do inkubatora z cyklem dobowym do czasu wykonania kroku 7.5.
    UWAGA: Stężenie bakterii w kontroli bakteryjnej powinno być równe stężeniu bakterii w eksperymentalnej kokulturze. Analogicznie, stężenie alg w kontroli algowej powinno być równe stężeniu alg w eksperymentalnej kokulturze. Dzięki zastosowaniu tych samych początkowych stężeń bakterii i alg można porównywać gęstość populacji w trakcie całego eksperymentu.

7. Przygotowanie płytek mikrotitracyjnych

  1. Podziel sterylną płytkę mikrotitracyjną z 48 dołkami zgodnie z Rysunkiem 1. Oznacz zewnętrzne dołki zawierające rozcieńczalnik sterylny lub próbki niefotosyntetyzujące.
    UWAGA: W przypadku próbek pobranych tego samego dnia można zastosować randomizację dołków na płytce. Na przykład kwadrant 1 zostanie pobrany w 1 dniu eksperymentu; dołki podlegające randomizacji to B2 - 4 oraz C2 - 4. Pozostaw obwód płytki wypełniony sterylnym roztworem, jak pokazano na Rysunku 1.

Siatka z kodowaniem kolorystycznym na schemacie analizy danych; metoda porównania wielowymiarowego; badania lub edukacja.
Rycina 1. Schematyczna reprezentacja rozmieszczenia próbek w 48-dołkowej płytce mikrotitracyjnej. Dołki należy wypełnić w następujący sposób: kolumny 1 i 6, dołki od A do F (Diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, ΣFy=0; wektory wskazują siły dla analizy strukturalnej, badanie inżynieryjne.) wypełnia się 1 ml 1x PBS (lub innym roztworem sterylnym/podłożem). Rzędy A i F, dołki 2-8 (Równowaga statyczna, ΣFx=0, MA=0, diagram fizyczny, analiza stabilności, badanie bilansu sił.) wypełnia się 1 ml kontroli bakteryjnej; rzędy B i E, dołki 2-8 (Diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, metoda; ilustracja zasad fizyki z siłami i wektorami.) wypełnia się 1 ml kontroli glonowej; rzędy C i D, dołki 2-8 (Diagram równowagi statycznej, ΣFx=0, ilustrujący zrównoważone siły i równania momentu obrotowego.) wypełnia się 1 ml kokultury. Płytka jest podzielona na 4 kwadranty (A2, A5, D2 i D5), z których każdy odpowiada konkretnym dniom pobierania próbek (1-4); rozmieszczenie to powinno być zrandomizowane pomiędzy płytkami i odpowiednio oznakowane. W obrębie każdego dnia zaleca się randomizację dołków z kontrolą glonową (Równowaga statyczna, ΣFx=0, ΣFy=0, diagram, analiza sił, zasady statyki, zastosowanie edukacyjne.) oraz kokulturą (Diagram równowagi statycznej, ΣF=0, MA=0, demonstrujący bilans sił na belce z podporami.) przy użyciu generatora liczb losowych. Należy zakleić pokrywkę nad dołkami z 1x PBS i/lub kontrolą bakteryjną, aby zapobiec zacienianiu kultur glonów.

  1. Do odpowiednich dołków, zgodnie ze wskazaniem na Ryc. 1, nanieś pipetą 1 ml 1x roztworu buforu fosforanowego (PBS, pH 7.4) lub innego sterylnego roztworu. Czynność tę wykonuj powoli i ostrożnie. PBS zmieni siłę jonową pożywki algowej i/lub kokultury, jeśli rozpryśnie się do innych dołków, dlatego należy z nim obchodzić się ostrożnie.
  2. Do dołków oznaczonych jako kontrola bakteryjna nanieś pipetą 1 ml kultury kontrolnej bakterii (Ryc. 1). Przed pipetowaniem na każdą płytkę zamieszaj kolbę z bakteriami, aby zapobiec ich osadzaniu się.
  3. Do dołków oznaczonych jako kontrola algowa nanieś pipetą 1 ml kultury kontrolnej alg, używając końcówki do pipety o szerokim wlocie (Ryc. 1). Kolbę z algami mieszaj tak samo regularnie jak kolbę z bakteriami. Jeśli algi mają tendencję do opadania lub wypływania na powierzchnię, mieszaj je tak często, jak jest to konieczne, aby utrzymać wizualnie jednorodną kulturę.
  4. Używając końcówki do pipety o szerokim wlocie, nanieś pipetą 1 ml kokultury do odpowiednich dołków (Ryc. 1). Kolbę z kokulturą mieszaj tak samo regularnie jak kolbę z algami.
  5. Uszczelnij każdą płytkę parafilmem i umieść w inkubatorze dobowym w żądanej temperaturze i przy dobowym cyklu świetlnym (zazwyczaj stosuje się 18 °C z cyklem światło:ciemność 16:8 h). Pozostaw płytki w inkubatorze dobowym do czasu wykonania pomiarów PAM (Sekcja 8). Upewnij się, że wszystkie płytki są zorientowane w tym samym kierunku, aby zapewnić spójną ekspozycję na światło.
  6. Pobierz 20 μl próbki PBS, pożywki algowej, zawiesiny algowej oraz kontroli algowej i wykonaj posiew na odpowiednim podłożu nieselektywnym (np. Marine Broth 2216 uzupełniony o 1.5% agar), a następnie inkubuj płytki w temperaturze 18 - 25 °C przez 72 h w celu sprawdzenia obecności zanieczyszczeń. Jeśli w którymkolwiek z roztworów, które nie powinny zawierać bakterii, pojawi się wzrost, dane te nie powinny być wykorzystane.
  7. Wykonaj pomiary fluorometrii PAM, wykorzystując pozostałe próbki z kolb kontroli algowej i kokultury dla eksperymentalnego pomiaru fluorometrii PAM w dniu 0 (patrz krok 8.1). Wszelkie inne pomiary w dniu 0 powinny być również wykonane z pozostałych próbek kontroli algowej, kontroli bakteryjnej i kokultury.

8. Wykonywanie pomiarów fluorometrii PAM próbek zapasowych

  1. Przed wykonaniem pomiarów należy wyzerować urządzenie WATER-PAM przy użyciu sterylnej pożywki dla alg w czystej kuwecie8.
  2. Do czystej kuwety zawierającej 2,7 ml tej samej pożywki dla alg, której użyto w eksperymencie, należy pipetować 300 µl z kolb kontrolnych lub kokultur alg. Próbkę i rozcieńczalnik należy delikatnie wymieszać za pomocą końcówki do pipety o szerokim wlocie.
  3. Przed umieszczeniem kuwety w urządzeniu WATER-PAM należy wytrzeć chusteczką wszystkie odciski palców z zewnętrznej strony kuwety.
  4. Kuweetę należy umieścić w urządzeniu WATER-PAM. Próbkę należy przykryć zakrętką i poddać adaptacji do ciemności przez 3 min. Czas adaptacji do ciemności różni się w zależności od gatunku alg i musi zostać ustalony dla konkretnych alg użytych w eksperymencie. Należy unikać zbyt długiego czasu adaptacji do ciemności (>20 min), wykonując pomiary WATER-PAM w połowie cyklu ciemnego w inkubatorach do dobowej hodowli alg16,17.
  5. Po adaptacji do ciemności należy nacisnąć przycisk F0. Jeśli odczyty fluorescencji przekraczają 3 900, należy rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:1 w pożywce dla alg. Próbkę należy poddać dodatkowej adaptacji do ciemności przez 3 min i wykonać nowy pomiar. Jeśli odczyty F0 lub Fm nadal przekraczają 3 900, należy kontynuować rozcieńczanie próbki 1:1 w pożywce dla alg, aż odczyty F0 i Fm spadną poniżej 3 900.
    UWAGA: Należy pamiętać o uwzględnieniu tych rozcieńczeń podczas zapisywania końcowej fluorescencji: na przykład, jeśli próbka alg została rozcieńczona 1:9 podczas początkowego przeniesienia z dołka do probówki z rozcieczalnikiem, to odczyt fluorescencji alg wynoszący 500 należy pomnożyć przez odwrotność czynnika rozcieńczenia (w tym przypadku 10), zatem rzeczywista fluorescencja w probówce wynosi 5 000.
  6. Po ustawieniu F0 należy co 90 s wykonywać pomiar impulsem nasycającym (SAT-Pulse), naciskając przycisk SAT w celu uzyskania odczytów Fm. Odstęp czasowy między pomiarami można dostosować w zależności od szczepu alg. Próbkę należy zutylizować.
  7. Kroki 8.1 – 8.6 należy powtórzyć dla pozostałych próbek.

9. Wykonywanie pomiarów fluorometrii PAM z płytek mikrotitracyjnych

  1. Oznacz 6 sterylnych probówek do próbek o pojemności >3 ml dla dołków B2 - 4 (kontrola glonowa) oraz dołków C2 - 4 (kokultura bakteryjna) (patrz układ płyt na Rysunku 1).
  2. Do każdej probówki odmierz 2,7 ml sterylnego medium glonowego.
  3. Umieść probówki w inkubatorze dobowym i pozostaw je na 30 min, aby zaaklimatyzowały się do temperatury, w której hodowano glony.
  4. Przed wyjęciem płytki mikrotitracyjnej z inkubatora upewnij się, że przenikanie światła do dołków zaklimatyzowanych w ciemności jest ograniczone, zakrywając płytkę folią aluminiową (lub podobnym materiałem); zdejmuj folię tylko podczas aktywnego przenoszenia kultur z dołków do probówek z roztworem (kroki 9.5 - 9.7).
  5. Aseptycznie wymieszaj zawartość pierwszego dołka płytki mikrotitracyjnej (dołek B2) za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze, powoli pobierając i wydmuchując ciecz.
  6. Wyjmij probówki z inkubatora i aseptycznie przenieś 300 µl z dołka B2 (Rysunek 1) do odpowiadającej mu probówki za pomocą końcówki pipety o szerokim otworze (jest to rozcieńczenie próbki w medium glonowym w stosunku 1:9).
  7. Powtórz kroki 9.5 - 9.6 dla pozostałych dołków (B3, 4 oraz C2 - 4).
  8. Przykryj probówki z próbkami folią aluminiową i zwróć je do inkubatora dobowego aż do momentu rozpoczęcia pomiarów WATER-PAM.
  9. Wykonaj odczyty WATER-PAM zgodnie z opisem w krokach 8.1 - 8.7. Przed ponownym umieszczeniem płytki mikrotitracyjnej w inkubatorze zabezpiecz ją parafimbem.
  10. Powtarzaj odczyty w zaplanowanych odstępach czasu przez cały czas trwania eksperymentu. Częstotliwość i czas trwania pobierania próbek należy zaplanować na początku badania.

10. Przykładowy eksperyment

Przykładowy eksperyment polega na 10-dniowej kokulturze bakterii (Phaeobacter gallaeciensis BS107) i mikroalgi (Emiliania huxleyi szczep (CCMP3266)). Obejmuje on kontrolę algową, kontrolę bakteryjną oraz eksperymentalną kokulturę bakteryjno-algową.

  1. Oblicz objętości wymaganych zawiesin bakterii i alg (kroki 1.1 - 1.4)
    Obliczenia objętości ko-kultury algowo-bakteryjnej, równania dla kontroli i eksperymentu w badaniach naukowych.
  2. Przygotuj zawiesinę alg o objętości VA wynoszącej 40 ml, inokulując 4 ml alg w 36 ml pożywki i inkubując do osiągnięcia wczesnej fazy wzrostu wykładniczego z gęstością komórek ok. 104 cells/ml (kroki 2.1 - 2.4).
  3. Przygotuj kolbę z zawiesiną bakterii, rozcieńczając 400 μl bakterii o stężeniu 106 cfu/ml otrzymanych w sekcji 3 do objętości VB równej 40 ml przy użyciu pożywki dla alg (końcowe stężenie bakterii wyniesie 104 cfu/ml).
  4. Przenieś połowę (20 ml) zawiesiny bakterii do kolby kontrolnej z bakteriami i dodaj 20 ml pożywki dla alg, aby przygotować kontrolę bakteryjną. Przenieś połowę (20 ml) zawiesiny alg do kolby kontrolnej z algami i dodaj 20 ml pożywki dla alg, aby przygotować kontrolę algową (sekcja 5). Przenieś pozostałe 20 ml zawiesiny bakterii do kolby z ko-kulturą i zmieszaj z pozostałymi 20 ml zawiesiny alg, aby utworzyć ko-kulturę (sekcja 6).
  5. Pipetuj 1x PBS (pH 7.4), kontrole oraz ko-kulturę do dwóch wcześniej oznakowanych płytek mikrotitracyjnych (Rysunek 1), po 1 ml na dołek. Wykorzystaj 3 ml pozostałych kontroli i ko-kultur do pomiarów w dniu 0 (liczenie cfu, WATER-PAM (sekcja 8), obserwacja mikroskopowa morfologii komórek alg oraz fiksacja komórek alg do cytometrii przepływowej).
  6. Wykonuj pomiary WATER-PAM dla kontroli algowej i ko-kultury raz dziennie przez 10 d, zawsze o tej samej godzinie, w której wykonano pomiary w dniu 0 (sekcja 8).

11. Inne istotne parametry

  1. Oznaczenie stężenia cfu bakterii: przeprowadzić rozcieńczenia seryjne kontroli bakteryjnej oraz kokultury w sterylnym 1x PBS (lub podobnym), następnie nanieść próbki metodą kropelkową na pożywkę Marine Broth 2216 uzupełnioną o 1,5% agaru (lub podobną) i odczytać liczbę wyrośniętych cfu, aby określić liczbę cfu/ml dla każdej studni18.
  2. Ocena stężenia komórek alg: utrwalić kontrolę alg oraz kokulturę, stosując glutaraldehyd w końcowym stężeniu 0,15%. Inkubować przez 10 min w ciemności, następnie gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wszystkie próbki poddać analizie na cytometrze przepływowym (FACS Calibur lub podobnym) w celu zliczenia komórek alg.
  3. Obserwacja morfologii komórek alg: analizować kultury alg oraz kokulturę bakteryjno-algową za pomocą mikroskopii (t.j. mikroskopii świetlnej, epifluorescencyjnej lub podobnej).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Odczyty fluorometrii WATER-PAM.

Fluorometria z modulacją amplitudy impulsów (PAM) jest szybką i wydajną metodą określania fluorescencji (wskaźnika zawartości chlorofilu) oraz wydajności fotosyntetycznej (stanu PSII) kultur glonów. Oprogramowanie PAM WinControl generuje arkusz z surowymi wartościami danych dla (poniejsze są podstawowe parametry dla próbek glonów zaadaptowanych do ciemności):

    F0 = fluorescencja komórek zaadaptowanych do ciemności

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wzrost alg w formacie zminiaturyzowanym.

Miniaturyzacja kultur glonów do objętości 1 ml w płytce mikrotitracyjnej pozwala na zwiększenie liczby powtórzeń w ramach eksperymentu. Ważne jest, aby upewnić się, że glony pozostają zdrowe przez cały czas trwania badania; należy przeprowadzić krzywą wzrostu (Rycina 2), wykorzystując format płytki mikrotitracyjnej do oceny różnych pożywek dla glonów, aby upewnić się, że ich zapotrzebowanie żywieniowe jest zaspokojone. Dodatkowo może być i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) oraz Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) dla RJC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 stóp sześciennych Inkubator dzienny (6012-1)Caron Corporate112310-6012-1-11www.caronproducts.com
Nunc EasYFlask 25 cm2, Nasadka odpowietrzająca/zamykająca, objętość robocza 7 ml, 200/csThermo Fisher ScientificN156340www.fishersci.ca
Wielodołkowe płytki TC – 48-dołkoweoprogramowanie laboratoryjne BD Biosciences Discovery353078www.bdbiosciences.com
P1000 Gilson Standard pipetowania— Gilson's PipetmanMandel Scientific Company Inc.GF-F123602www.mandel.ca
P10mL Gilson Standard do pipetowania— Gilson's PipetmanMandel Scientific Company Inc.GF-F161201www.mandel.ca
Końcówki kryz o szerokim otworze niesterylne [100– 1,250 &mikro; l]VWR International89079-468www.ca.vwr.com
Końcówki ultracienkie niesterylne [100– 1,250 &mikro; l]VWR International89079-470www.ca.vwr.com
Finntip 10 ml [Vol: 1 - 10 ml]Thermo Fisher Scientific9402151www.fishersci.ca
WATER-Modulacja amplitudy impulsów (Water-ED)Heinz Walz GmbH, Effeltrich, NiemcyEDEE0232www.walz.com
15 mm kuweta ze szkła kwarcowego (WATER-K)Caron Corporatewww.caronproducts.com
Chlorek sodu (krystaliczny/certyfikowany ACS), Fisher ChemicalThermo Fisher ScientificThermo Fisher Scientific www.fishersci.ca
BD Difco Marine Broth 2216BD Biosciences Discovery LabwareBD Biosciences Discovery Labwarewww.bdbiosciences.com
BD Bacto AgarBD Biosciences Discovery LabwareBD Biosciences Discovery Labwarewww.bdbiosciences.com
L1 Medium Kit, 50 LNCMA [Narodowe Centrum Alg Morskich i MikrobiotyNCMA [Krajowe Centrum Glonów Morskich i Mikrobiotywww.ncma.bigelow.org

Bibliografia

  1. Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition? Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
  2. Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
  3. Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
  4. Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
  5. Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
  6. Lv, J. -M., Cheng, L. -H., Xu, X. -H., Zhang, L., Chen, H. -L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
  7. Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
  8. MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
  9. Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
  10. Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
  11. Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
  12. Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
  13. Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
  14. Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
  15. Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
  16. WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , Heinz Walz GmbH. Germany. Available at: http://www.walz.com/downloads/manuals/water-pam/waterp3e.pdf (2013).
  17. Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  18. Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165341 121-129 (2001).
  19. Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), Available at: http://www.springerlink.com/index/r3689k5w72782r50.pdf 147-150 (1990).
  20. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence--a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
  21. Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
  22. Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
  23. Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
  24. Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Analiza na płytkach mikrotitracyjnychkokultura bakterii i algtesty fizjologii algpomiar wydajności fotochemicznejprotokół adaptacji do ciemnościtechnika rozcieńczeń seryjnychanaliza cytometrycznajednostka tworząca kolonię
Test biologiczny o małej objętości do oceny wspólnej hodowli bakterii i fitoplanktonu przy użyciu fluorometrii z modulacją amplitudy WATER-Pulse-Amplitude (WATER-PAM)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.