Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Spektroskopia sił atomowych jest idealnym narzędziem do badania molekuł na powierzchniach i powierzchniach. Przedstawiono eksperymentalny protokół łączenia dużej liczby pojedynczych cząsteczek kowalencyjnie na końcówce AFM. W tym samym czasie końcówka AFM jest pasywowana, aby zapobiec niespecyficznym interakcjom między końcówką a podłożem, co jest warunkiem wstępnym do badania pojedynczych cząsteczek przyczepionych do końcówki AFM. Pokrótce przedstawiono analizy mające na celu określenie siły adhezji, długości adhezji i energii swobodnej tych cząsteczek na powierzchniach stałych i biointerfejsach, a także podano zewnętrzne odniesienia do dalszej lektury. Przykładowymi cząsteczkami są poli(aminokwas) polityrozyna, polimer przeszczepu PI-g-PS i fosfolipid POPE (1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina). Cząsteczki te są desorbowane z różnych powierzchni, takichjak CH, diament zakończony wodorem i dwuwarstwy lipidowe w różnych warunkach rozpuszczalnika. Na koniec omówiono zalety eksperymentów ze spektroskopą siłową pojedynczych cząsteczek, w tym sposoby decydowania, czy naprawdę pojedyncza cząsteczka została zbadana w eksperymencie.
Wprowadzenie
W ciągu ostatnich 30 lat, mikroskopia sił atomowych (AFM) okazała się cenną techniką obrazowania do badania biologicznych materiałów i powierzchni 1,2 i syntetycznych 3, ponieważ zapewnia molekularną rozdzielczość przestrzenną we wszystkich trzech wymiarach i może być używana w różnych środowiskach rozpuszczalników. Ponadto spektroskopia sił AFM-pojedynczej cząsteczki (SMFS) umożliwia pomiar sił w zakresie od pN do μN i dostarczyła bezprecedensowych informacji, na przykład na temat fałdowania białek 4,5, fizyki polimerów 6–8 i interakcji pojedynczej cząsteczki-powierzchnia9–12....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Przegląd przepływu procesu obejmujący etapy przygotowania, akwizycji danych i analizy danych znajduje się na Rysunku 2.
1. Przygotowanie odczynników
UWAGA: Wszystkie odczynniki chemiczne należy traktować z ostrożnością, dlatego należy stosować fartuch laboratoryjny, rękawiczki oraz ochronę oczu. Wszystkie czynności muszą być wykonywane w dygestorium. W szczególności, w przypadku użycia chloroformu, należy założyć specjalistyczne rękawiczki.
- Odczynniki o niskiej zawartości wody, takie jak suchy chloroform, należy wykorzystać szybko i przechowywać w stanie suchym, jednak nie dłuż....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Poniżej przedstawiono wyniki dla opisanych powyżej przykładowych cząsteczek, mianowicie polimerów poli(aminokwasu) polityrozyny, polimeru szczepionego PI-g-PS oraz fosfolipidu POPE. W pierwszej kolejności dla każdego przykładu podano szczegóły specyficzne dla eksperymentu dotyczące akwizycji i przygotowania danych. Następnie zaprezentowano przykładowe wyniki eksperymentów, w których cząsteczki te były desorbowane z różnych powierzchni (CH3-SAMs, diamentu zakończonego wodorem oraz dwuwarstw lipidowych).......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W ciągu ostatnich dziesięcioleci eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami dostarczyły bezprecedensowego wglądu w mechanizmy molekularne i okazały się nieocenionym podejściem w naukach przyrodniczych i nie tylko. Aby uzyskać dobre i znaczące statystyki z eksperymentów SMFS, najlepiej byłoby, gdyby jedna i ta sama cząsteczka była używana przez cały czas trwania eksperymentu. W przeciwieństwie do eksperymentów z zespołami molekuł, eksperymenty SMFS są w stanie wykryć rzadkie zdarzenia i ukryte stany molekularne. Kolejną zal.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy dziękują DFG (Hu 997/2-2) za wsparcie finansowe. FS uznaje Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr był wspierany przez Elitenetzwerk Bayern w ramach programu doktoranckiego Materiałoznawstwo Złożonych Interfejsów. SKi dziękuje SFB 863 za wsparcie finansowe.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaliczny płynny koncentrat (roztwór detergentu) | Hellma | ||
| RCA (woda ultraczysta, nadtlenek wodoru (35%), amoniak (32%); 5:1:1(v/v/v))Odczynnik | Sigma | ||
| Vectabond / APTES (3-Aminopropyl)trietoksysilan | Vectorlabs Suchy | ||
| aceton (< 50 ppm H< sub>2O) | Sigma | ||
| Suchy chloroform (> 99,9%) | Sigma | ||
| Trietyloamina | Sigma | ||
| Ultraczysta woda | Biochrom, Niemcy | ||
| Tetraboran di-sodu (> 99,5%) | Biochrom, Niemcy | ||
| Kwas borowy | Biochrom, Niemcy | ||
| Monofunkcyjny &alfa;-metoksy-ω-NHS PEG, 5 kDa, " metylo-PEG-NHS" | Rapp, Niemcy | ||
| Heterobifunkcyjny α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, " NHS-PEG-NHS" | Rapp, Niemcy | ||
| Heterobifunkcjonalny &alfa;-maleimidoheksanowy- ω-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS" | Rapp, Niemcy | ||
| Cząsteczka sondy (polimer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Wystarczająca ilość szklanych naczyń krystalizujących z dziobkiem (10 ml), szklane szalki Petriego (500 &mikro; l) i pokrywy szklane | VWR International GmbH, Niemcy | ||
| [nagłówek] | |||
| Piec laboratoryjny model UF30 | Memmert, Niemcy | ||
| Ultradźwiękowiec z kontrolowaną temperaturą | VWR International GmbH, Niemcy | ||
| System plazmowy "Femto", 100 W | Diener, Niemcy | ||
| Jedna oddzielna szklana strzykawka do każdego rozpuszczalnika organicznego | VWR International GmbH, Niemcy | ||
| Vortex mieszalnik | VWR International GmbH, Niemcy | ||
| Probówki do mikrowirówek (0,5 ml lub 1,5 ml) | Pipety Eppendorf | ||
| : 10-100 i mikro; l, 50-200 i mikro; l oraz 100-1,000 &mikro; l | Eppendorf | ||
| AFM z ogniwem płynowym o kontrolowanej temperaturze (np. MFP-3D z BioHeater | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Wsporniki wspornikowe miękkiego SiN, zwykle wykonane z azotku krzemu (SiN) (stała sprężystości mniejsza niż 100 pN/nm, np. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
Bibliografia
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
