Artykuł metodologiczny

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

DOI:

10.3791/52456

⸱

27 lutego 2015

 ,  ,  , 
1Physik-Department E22a, Technische Universität München, 2IMETUM, Technische Universität München

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektroskopia sił atomowych jest idealnym narzędziem do badania molekuł na powierzchniach i powierzchniach. Przedstawiono eksperymentalny protokół łączenia dużej liczby pojedynczych cząsteczek kowalencyjnie na końcówce AFM. W tym samym czasie końcówka AFM jest pasywowana, aby zapobiec niespecyficznym interakcjom między końcówką a podłożem, co jest warunkiem wstępnym do badania pojedynczych cząsteczek przyczepionych do końcówki AFM. Pokrótce przedstawiono analizy mające na celu określenie siły adhezji, długości adhezji i energii swobodnej tych cząsteczek na powierzchniach stałych i biointerfejsach, a także podano zewnętrzne odniesienia do dalszej lektury. Przykładowymi cząsteczkami są poli(aminokwas) polityrozyna, polimer przeszczepu PI-g-PS i fosfolipid POPE (1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina). Cząsteczki te są desorbowane z różnych powierzchni, takichjak CH, diament zakończony wodorem i dwuwarstwy lipidowe w różnych warunkach rozpuszczalnika. Na koniec omówiono zalety eksperymentów ze spektroskopą siłową pojedynczych cząsteczek, w tym sposoby decydowania, czy naprawdę pojedyncza cząsteczka została zbadana w eksperymencie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich 30 lat, mikroskopia sił atomowych (AFM) okazała się cenną techniką obrazowania do badania biologicznych materiałów i powierzchni 1,2 i syntetycznych 3, ponieważ zapewnia molekularną rozdzielczość przestrzenną we wszystkich trzech wymiarach i może być używana w różnych środowiskach rozpuszczalników. Ponadto spektroskopia sił AFM-pojedynczej cząsteczki (SMFS) umożliwia pomiar sił w zakresie od pN do μN i dostarczyła bezprecedensowych informacji, na przykład na temat fałdowania białek 4,5, fizyki polimerów 6–8 i interakcji pojedynczej cząsteczki-powierzchnia9–12. Uzasadnieniem badania pojedynczych cząsteczek, a nie zespołu molekuł, jest uniknięcie efektów uśredniania, które często maskują rzadkie zdarzenia lub ukryte stany molekularne. Ponadto można uzyskać wiele parametrów molekularnych, takich jak długość konturu, długość Kuhna, energia swobodna adhezji itp. Jest to szczegółowo opisane w poniższych przykładach. W typowym eksperymencie AFM-SMFS cząsteczka sondy jest sprzężona z bardzo ostrą końcówką za pomocą cząsteczki łącznika. Sama końcówka znajduje się na końcu giętkiego wspornika. Jeśli końcówka zetknie się z powierzchnią, cząsteczka sondy będzie oddziaływać z tą powierzchnią. Obserwując ugięcie wspornika po cofnięciu końcówki, można określić siłę, a tym samym energię swobodną, która odrywa cząsteczkę od powierzchni. Aby uzyskać miarodajne statystyki, należy pozyskać dużą liczbę tak zwanych krzywych siła-odległość. Ponadto, aby przeprowadzić prawdziwe eksperymenty z pojedynczą cząsteczką (tj. przy użyciu jednej i tej samej cząsteczki sondy przez cały czas trwania eksperymentu), cząsteczka sondy powinna być sprzężona kowalencyjnie z końcówką AFM. W tym miejscu przedstawiono eksperymentalny protokół funkcjonalizacji wspornikowej pojedynczą cząsteczką za pomocą wiązania kowalencyjnego. Pojedyncza cząsteczka może być sprzężona za pomocą grupy aminowej lub tiolowej z końcówką AFM. Proces koniugacji można przeprowadzić w szerokiej gamie rozpuszczalników (organicznych i wodnych), aby uwzględnić właściwości solwatacyjne zastosowanych polimerów.

W pierwszej części opisany jest ogólny protokół kowalencyjnego dołączania pojedynczej cząsteczki ("cząsteczki sondy") za pomocą cząsteczki łącznikowej do końcówki AFM. W tym celu stosuje się organiczną chemię NHS lub maleimidową13. Wraz z protokołem dla trzech przykładowych cząsteczek opisano procesy pozyskiwania i analizy danych oraz podano odniesienia do dalszej lektury. Przykładowymi cząsteczkami są: (liniowy) polimer tyrozyna, polimer szczepiony PI-g-PS i lipid POPE. Obejmuje to niewielkie zmiany protokołu, na przykład w celu kowalencyjnego przyłączania cystein. Ponadto sekcja poświęcona jest przygotowaniu różnych powierzchni, takich jak powierzchnia diamentowa, samoorganizująca się monowarstwa CH3 i dwuwarstwy lipidowe. Interfejsy te okazały się dobrymi referencjami i przykładami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Rysunek 2, aby zapoznać się z przeglądem przepływu procesu obejmującego etapy przygotowania, akwizycji danych i analizy danych.

1. Konfiguracja odczynnika

UWAGA: Ze wszystkimi chemikaliami należy obchodzić się ostrożnie, dlatego należy używać fartucha laboratoryjnego, rękawic i ochrony oczu. Wszystkie operacje muszą być wykonywane w okapie laboratoryjnym. W szczególności należy nosić specjalne rękawice w przypadku stosowania chloroformu.

  1. Używaj szybko chemikaliów o niskiej zawartości wody, takich jak suchy chloroform, i przechowuj w suchym miejscu, ale nie dłużej niż tydzień. Przechowywać obie substancje chemiczne w temperaturze -20 °C i w atmosferze azotu lub argonu, ponieważ APTES ((3-aminopropylo)trietoksysilan) (patrz tabela 1) i PEG (glikol polietylenowy) są higroskopijne, a PEG ulega utlenianiu w powietrzu.
  2. Aby uniknąć częstego wystawiania materiału na działanie tlenu atmosferycznego i wilgoci, należy przygotować mniejsze porcje, najlepiej w systemie komory rękawicowej z atmosferą azotu.

2. Konfiguracja sprzętu

UWAGA: Aby uniknąć możliwego zanieczyszczenia krzyżowego, używaj świeżych i czystych naczyń na każdym etapie.

  1. Czyść szkło i pęsetę w roztworze detergentu przez 30 minut w kąpieli ultradźwiękowej w temperaturze 60 °C.
  2. Wypłucz i poddaj sonikacji sprzęt z kroku 2.1 dwa razy dokładnie ultraczystą wodą.
  3. Podgrzej urządzenia od kroku 2.1 w roztworze RCA (woda ultraczysta, nadtlenek wodoru i amoniak (5:1:1)) do 75 °C w piecu przez 45 minut, a następnie przepłucz je ultraczystą wodą.
  4. Na koniec osusz szkło i pęsetę pod strumieniem suchego azotu lub w piekarniku (100 °C, 3 godz.).

3. Funkcjonalizacja końcówki

UWAGA: Używaj pęsety, naczyń itp. wykonanych ze stali nierdzewnej, PTFE, szkła lub jakiegokolwiek innego materiału, który jest chemicznie stabilny w roztworach organicznych, jeśli to możliwe. O ile nie określono inaczej, należy wykonać wszystkie czynności w RT. Ilość potrzebnego roztworu do inkubacji zależy od liczby wiórów wspornikowych. Upewnij się, że wsporniki są przez cały czas zanurzone w odpowiednich rozwiązaniach.

UWAGA: Użyj kaptura, aby uniknąć wdychania oparów organicznych.

  1. Tworzenie grup OH na powierzchni wspornika ("aktywacja") (około 0,5 godziny):
    1. Za pomocą pęsety umieść świeże wióry wspornikowe (materiał: SiN, stała sprężystości: 10-100 pN/nm) na czystym szkiełku podstawowym i umieść je w komorze plazmowej (100 W).
    2. Komora ewakuacyjna (~0,1 mbar).
    3. Zalej komorę gazowym tlenem i ponownie się ewakuuj.
    4. Aktywuj proces plazmowy (moc: 20%, czas trwania: 15 min, ciśnienie procesu: 0,25 mbar).
  2. Aminosilanizacja wsporników (około 1 godz.):
    1. Przygotować 2,5 ml roztworu APTES (patrz Tabela 1) na szklanej szalce Petriego – najlepiej zrobić to podczas procesu plazmowego.
    2. Bezpośrednio po procesie plazmowym zanurz każdy wspornik na 1 sekundę w acetonie i natychmiast po tym umieść go w roztworze APTES.
    3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Ostrożnie opłucz wióry wspornikowe dwa razy w 10 ml acetonu i raz w 10 ml chloroformu.
    5. Opcjonalny krok końcowy: Umieść wióry wspornikowe z poprzedniego kroku na czystym szkiełku podstawowym i piecz je przez 30 minut w temperaturze 70 °C. Należy pamiętać, że istnieją również alternatywne strategie aktywacji powierzchniowej, np. obróbka UV 12.
  3. PEGylacja (około 2 godz.):
    UWAGA: Wykonaj kroki 3.3.1-3.3.4 podczas aminosilanizacji. NHS i grupy maleimidowe podlegają hydrolizie w środowisku wodnym, a sam PEG ulega utlenianiu w powietrzu. Dlatego czas (zwłaszcza między krokami) jest krytycznym parametrem. Więcej informacji można znaleźć w punkcie 13.
    1. Przygotować roztwór chloroformu (patrz Tabela 1).
    2. Aby uniknąć kondensacji, podgrzej proszki PEG do RT przed otwarciem podwielokrotności i zważeniem odpowiedniej ilości.
    3. W celu sprzężenia polimerów lub lipidów z grupami aminowymi oddzielnie rozpuść NHS-PEG-NHS (6 kDa) i metylo-PEG-NHS (5 kDa) w roztworze chloroformu, wirując je, aż do całkowitego rozpuszczenia. Stężenia, patrz tabela 1.
      1. Alternatywnie. do sprzęgania polimerów z grupami tiolowymi oddzielnie rozpuścić Mal-NHS-PEG i metylo-PEG-NHS w roztworze chloroformu.
    4. Wymieszaj roztwory zgodnie z wymaganiami, aby dostosować pewien stosunek liczbowy między NHS- lub maleimidem- a cząsteczkami PEG zakończonymi metylowo (zwykle 1:500). Należy zauważyć, że idealny stosunek musi być określany iteracyjnie w serii cykli przygotowawczo-eksperymentalnych.
    5. Inkubować wióry wspornikowe w roztworze PEG przez 1 godzinę w atmosferze nasyconej chloroformem, aby zapobiec parowaniu chloroformu.
  4. Koniugacja cząsteczek sondy (> 1 godz.):
    UWAGA: W poniższych 3.4.1-3.4.3 opisano trzy przykłady kowalencyjnego sprzężenia różnych cząsteczek sondy z końcówką AFM. Dla każdej cząsteczki protokół musi zostać dostosowany. Ponadto należy zauważyć, że w przykładach 1 i 3 stosuje się chemię NHS, podczas gdy w przykładzie 2 polimer >PI-g-PS funkcjonalizowany tiolem jest sprzężony z PEG za pomocą chemii maleimidu. Szczegółowe informacje znajdują się w punkcie 14.
    1. Dla poli(aminokwasu) poli-D-tyrozyny (40-100 kDa)
      1. Rozpuścić cząsteczkę sondy sprzężoną z polityrozyną w 1 M NaOH. Dostosować stężenie do 1 mg/ml.
      2. Wymienić NaOH na bufor boranu sodu (pH 8,1) za pomocą wirowych kolumn odsalających (7 kDa MWCO) bezpośrednio przed funkcjonalizacją
      3. Przepłukać wsporniki najpierw 5 ml chloroformu, następnie 5 ml etanolu, a na końcu 5 ml buforu boranowego.
      4. Inkubować wióry wspornikowe przez 1 godzinę w roztworze buforowym boranu polityrozyny, a następnie przepłukać buforem boranowym i ultraczystą wodą. Przechowywać w ultraczystej wodzie do czasu pomiaru.
    2. Do polimerów o liniowym kręgosłupie (poliizopren, 119 kDa) z szczepionymi łańcuchami bocznymi (polistyren, 88 kDa) 14
      1. Rozpuścić PI-g-PS w suchym chloroformie. Dostosować stężenie roztworu do koniugacji do 4 mg/ml.
      2. Przepłukać wsporniki 5 ml chloroformu i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w roztworze do koniugacji.
      3. Ponownie spłukać w 5 ml chloroformu i przechowywać w chloroformie w środowisku nasyconym chloroformem (aby zapobiec parowaniu chloroformu) do czasu pomiaru.
    3. Dla lipidowego POPE
      1. Rozpuść POPE w suchym chloroformie. Dostosuj stężenie do 20 mM.
      2. Przepłukać wsporniki 5 ml etanolu i 5 ml ultraczystej wody przed inkubacją wsporników przez 1 godzinę w roztworze lipidów.
      3. Po inkubacji przepłukać wsporniki 5 ml chloroformu, 5 ml etanolu i 5 ml ciepłej, ultraczystej wody (w tej kolejności), aby usunąć niezwiązane cząsteczki sondy i pozbyć się pozostałości chloroformu. Natychmiast korzystaj z funkcjonalnych końcówek. Alternatywnie przechowuj je w chloroformie, aż będą potrzebne.

figure-protocol-1
Rysunek 1. (A) Schemat przedstawiający proces funkcjonalizacji końcówki na przykładzie chemii NHS. (B) Wiązanie chemiczne stosowane do przyłączenia cząsteczki sondy do końcówki za pośrednictwem grupy aminowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie powierzchni

  1. Samodzielny montaż monowarstwowy (SAM)
    UWAGA: Jako powierzchnię dla pierwszego przykładu wybrano samoorganizującą się monowarstwę. Szczegółowe informacje można znaleźć w literaturze 15.
    1. Szkiełka podstawowe należy czyścić roztworem detergentu, a następnie dwukrotnie w ultraczystej wodzie w kąpieli ultradźwiękowej przez 30 minut każde. Następnie, jako dodatkowy etap czyszczenia, umieść je w roztworze RCA (patrz krok 2.3) w temperaturze 75 °C na 15 minut.
    2. Pokryj szkiełka chromem, niklem 10 nm i złotem 100 nm w powlekarce próżniowej. Następnie przechowuj w lodówce i ponownie wyczyść w roztworze RCA bezpośrednio przed następnym krokiem.
    3. Inkubować szkiełka z poprzedniego etapu w 2 mM roztworze 1-dodekantiolu/etanolu przez 12 godzin. Grupy tiolowe wiążą się z powierzchnią złota, a hydrofobowa monowarstwa samoczynnie się składa. Opłucz szkiełka etanolem i ultraczystą wodą, a następnie wysusz strumieniem gazowego azotu. Potwierdź hydrofobowość przygotowanej powierzchni za pomocą statycznych pomiarów kąta zwilżania w goniometrze z kamerą CCD10.
  2. Diament zakończony wodorem
    UWAGA: Jako powierzchnię dla drugiego przykładu wybrano diament zakończony wodorem. Przygotowanie powierzchni wykonano zgodnie z opisem poprzednio16.
  3. Obsługiwana dwuwarstwa lipidowa
    UWAGA: W ostatnim przykładzie jako powierzchnię użyto dwuwarstwy lipidowej podpartej powierzchniowo (SLB). Aby uzyskać taką powierzchnię, metodą ekstruzji uformowano roztwór (0,1 mg/ml) dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV) składających się z fosfolipidu POPC. Następnie 50 μl roztworu LUV umieszczono na świeżo rozdrobnionym arkuszu miki (A = 1 cm²) i inkubowano przez 30 minut. Na koniec roztwór przepłukano 20 ml ultraczystej wody. Patrz 17,18 w celu uzyskania szczegółowego opisu przygotowania SLB.

5. Akwizycja danych

UWAGA: Do eksperymentów użyj AFM, który daje możliwość pomiaru w cieczach. Procedury akwizycji i analizy danych mają zastosowanie niezależnie od zastosowanego modelu AFM. Ponadto w niektórych eksperymentach korzystna jest możliwość kontrolowania temperatury wewnątrz ogniwa cieczowego. Ugięcie wysięgnika wykryto za pomocą metody odchylania wiązki laserowej 19. Stałe sprężystości wyznaczono metodą szumu termicznego 20.

  1. Włóż funkcjonalny wspornik do uchwytu wspornika AFM, który jest odpowiedni do pomiaru w płynach.
  2. Powierzchnię (przygotowanie patrz wyżej), z której ma zostać pobrana próbka, umieścić w AFM i zalać ją płynem. Zarówno wspornik, jak i powierzchnię należy teraz zanurzyć w cieczy z końcówką wspornika skierowaną w stronę powierzchni. Należy pamiętać, że w wielu przypadkach wystarczy kropla płynu. W każdym przypadku należy unikać parowania płynu, np. poprzez zastosowanie zamkniętej celi płynowej.
  3. W razie potrzeby wyreguluj żądaną temperaturę na sterowniku.
  4. Pozwól systemowi zrównoważyć się przez co najmniej pół godziny.
  5. Zarejestrować widmo szumu termicznego wspornika przy wysięgniku daleko od powierzchni, aby wykluczyć jakiekolwiek efekty tłumienia powierzchni. Należy pamiętać, że zwykle trzeba zgromadzić 10 lub więcej widm, aby uzyskać wystarczający stosunek sygnału do szumu.
  6. Podejdź do powierzchni. Należy pamiętać, że w celu zachowania geometrii końcówki i funkcjonalności końcówki, proces podejścia musi być przeprowadzony ostrożnie. Można to osiągnąć, na przykład zbliżając się w trybie przerywanego kontaktu.
  7. Określ odwrotną czułość dźwigni optycznej (InvOLS) mierzoną w nm/wolt. W tym celu należy docisnąć końcówkę wspornika do twardej powierzchni.
    1. Określ InvOLS, mierząc nachylenie drogi przesuwu piezoelektrycznego w funkcji zmiany napięcia fotodiody. Dopasuj linię do części krzywej siła-odległość, w której końcówka wspornika styka się z powierzchnią. W doświadczeniach obejmujących miękką powierzchnię, taką jak dwuwarstwy lipidowe, należy wykonać ten krok na obszarach, które nie są pokryte dwuwarstwą lipidową ("plamy defektów").
  8. Określ stałą sprężystości (pN/nm), dopasowując oscylator harmonicznych do widma szumu termicznego. Użyj zautomatyzowanej funkcji oprogramowania do określania stałej sprężystości; w przeciwnym razie zapoznaj się z literaturą 20.
  9. Rozpocznij eksperyment.
    1. Rejestruj liczne krzywe siła-odległość w każdym warunku eksperymentalnym. Zazwyczaj stosuje się następujące wartości dla parametrów eksperymentalnych: częstotliwość próbkowania 5 kHz, prędkość końcówki 1 μm/s, odległość wycofania 1 μm.
      UWAGA: Czasami, w zależności od dynamiki badanego eksperymentu, może być konieczne odczekanie pewnego czasu przy kontakcie końcówki z powierzchnią ("czas przebywania").
      UWAGA: Parametry specyficzne dla eksperymentu mogą znacznie odbiegać od wartości podanych powyżej.
    2. Podczas długotrwałych pomiarów należy od czasu do czasu wyzerować pozycję lasera na fotodiodzie, zmieniając położenie fotodiody.
    3. Opcjonalnie: Po każdej krzywej siły przesuń końcówkę AFM do innej pozycji x-y.
    4. Pod koniec eksperymentu ponownie określ czułość i stałą sprężystości, aby sprawdzić spójność i stabilność systemu.
      UWAGA: Porównanie stałej sprężystości i czułości przed i po eksperymencie jest również sposobem na zapewnienie, że właściwości systemu i właściwości końcówki pozostały niezmienione w trakcie eksperymentu. Jeśli różnica stałych sprężystości nie jest zbyt duża (<=15%), można je uśrednić, ponieważ wewnętrzna niepewność wyznaczenia stałej sprężystości wynosi również około 15%. W przypadku większych różnic zaleca się najpierw znalezienie i wyeliminowanie przyczyny zmiany pozornej stałej sprężystości przed kontynuowaniem dalszych eksperymentów.

6. Przygotowanie danych

UWAGA: W tej sekcji opisane są ogólne kroki przygotowania danych, które zazwyczaj są przeprowadzane niezależnie od konkretnego rodzaju eksperymentu, w celu przeliczenia jednostek na niutony i nanometry, a także w celu poprawienia danych. Analizy danych specyficznych dla danego eksperymentu zostały pokrótce opisane poniżej w odpowiedniej sekcji dotyczącej reprezentatywnego przykładu.

  1. Zazwyczaj wszystkie etapy przygotowania i analizy danych są wykonywane automatycznie za pomocą algorytmu napisanego przez dom, np. opartego na oprogramowaniu IGOR Pro 6.
  2. Przelicz surowy sygnał odchylenia (Defl) [V] na siłę, mnożąc go przez InvOLS [nm/V] i stałą sprężystości [nN/nm].
  3. Przesunąć siłę w taki sposób, aby siła działająca na wspornik w wystarczającej odległości od powierzchni (nieobciążony wspornik) osiągnęła wartość 0 nN.
  4. Obliczyć rzeczywistą pozycję końcówki (nazywaną również separacją, gdy jest mierzona względem powierzchni) z*, która uwzględnia zginanie wspornika:
    figure-protocol-2
  5. Przesunięcie z* w taki sposób, że z* = 0 odpowiada położeniu z powierzchni.
    UWAGA: Tutaj F jest siłą, która działa na końcówkę, a tym samym zgina wspornik (określona w kroku 6.2.), z jest zmierzoną pozycją czujnika z (bezpośrednio podaną przez przyrząd), a k reprezentuje stałą sprężystości (określoną w kroku 5.8).

figure-protocol-3
Rysunek 2. Diagram przepływu procesu przedstawiający przygotowanie próbki, akwizycję danych i analizę danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniżej przedstawiono wyniki dla wyżej opisanych przykładowych cząsteczek, a mianowicie polimerów poli(aminokwasu) polityrozyny, polimeru przeszczepu PI-g-PS i fosfolipidu POPE. Najpierw dla każdego przykładu podane są szczegółowe informacje o eksperymencie dotyczącym pozyskiwania i przygotowywania danych. Następnie przedstawiono przykładowe wyniki eksperymentów, w których cząsteczki te zostały zdesorbowane z różnych powierzchni(CH, 3-SAM, dwuwarstwy diamentowe zakończone wodorem i lipidowe). Wprowadz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich dziesięcioleci eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami dostarczyły bezprecedensowego wglądu w mechanizmy molekularne i okazały się nieocenionym podejściem w naukach przyrodniczych i nie tylko. Aby uzyskać dobre i znaczące statystyki z eksperymentów SMFS, najlepiej byłoby, gdyby jedna i ta sama cząsteczka była używana przez cały czas trwania eksperymentu. W przeciwieństwie do eksperymentów z zespołami molekuł, eksperymenty SMFS są w stanie wykryć rzadkie zdarzenia i ukryte stany molekularne. Kolejną zal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują DFG (Hu 997/2-2) za wsparcie finansowe. FS uznaje Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr był wspierany przez Elitenetzwerk Bayern w ramach programu doktoranckiego Materiałoznawstwo Złożonych Interfejsów. SKi dziękuje SFB 863 za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materials
Hellmanex III alkaliczny płynny koncentrat (roztwór detergentu)Hellma
RCA (woda ultraczysta, nadtlenek wodoru (35%), amoniak (32%); 5:1:1(v/v/v))OdczynnikSigma
Vectabond / APTES (3-Aminopropyl)trietoksysilanVectorlabs Suchy
aceton (< 50 ppm H< sub>2O)Sigma
Suchy chloroform (> 99,9%)Sigma
TrietyloaminaSigma
Ultraczysta wodaBiochrom, Niemcy
Tetraboran di-sodu (>  99,5%)Biochrom, Niemcy
Kwas borowyBiochrom, Niemcy
Monofunkcyjny &alfa;-metoksy-ω-NHS PEG, 5 kDa, " metylo-PEG-NHS"Rapp, Niemcy
Heterobifunkcyjny α,ω-bis-NHS PEG, 6  kDa, " NHS-PEG-NHS"Rapp, Niemcy
Heterobifunkcjonalny &alfa;-maleimidoheksanowy- ω-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS"Rapp, Niemcy
Cząsteczka sondy (polimer, lipid, etc.)
Equipment
Wystarczająca ilość szklanych naczyń krystalizujących z dziobkiem (10  ml), szklane szalki Petriego (500 &mikro; l) i pokrywy szklaneVWR International GmbH, Niemcy
 
 
 
 
 
 
[nagłówek]
Piec laboratoryjny model UF30Memmert, Niemcy
Ultradźwiękowiec z kontrolowaną temperaturąVWR International GmbH, Niemcy
System plazmowy "Femto", 100 WDiener, Niemcy
Jedna oddzielna szklana strzykawka do każdego rozpuszczalnika organicznegoVWR International GmbH, Niemcy
Vortex mieszalnikVWR International GmbH, Niemcy
Probówki do mikrowirówek (0,5 ml lub 1,5 ml)Pipety Eppendorf
: 10-100 i mikro; l, 50-200 i mikro; l oraz 100-1,000  &mikro; lEppendorf
AFM z ogniwem płynowym o kontrolowanej temperaturze (np. MFP-3D z BioHeaterAsylulm Research, Santa Barbara
Wsporniki wspornikowe miękkiego SiN, zwykle wykonane z azotku krzemu (SiN) (stała sprężystości mniejsza niż 100 pN/nm, np. MLCT)Bruker AXS, Santa Barbara
)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
  2. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
  3. Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
  4. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
  5. Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
  6. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  7. Zhang, W., Zhang, X. Single molecule mechanochemistry of macromolecules. Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).
  8. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301(2005).
  9. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
  10. Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
  11. Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
  12. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
  13. Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
  14. Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
  15. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
  16. Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
  17. Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
  18. Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
  19. Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868(1993).
  21. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  22. Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
  23. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
  24. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  25. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  26. Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
  27. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
  28. Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Funkcjonalizacja ko c wki AFMcznik polietylenoglikolowykowalencyjne sprz ganie cz steczekkrzywe si a odleg opomiar si y adhezjianaliza d ugo ci adhezjiwyznaczanie energii swobodnejpojedyncza sonda polimerowa

Powiązane artykuły