Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Danio pręgowany był szeroko wykorzystywany do badania różnych tematów z zakresu biologii naczyniowej, w tym rozwoju naczyń, angiogenezy oraz rozwoju i patologii hematopoetycznej^1-3. Zarodki rozwijają funkcjonalne krążenie, a także leukocyty i inne składniki wrodzonego układu odpornościowego do 1 dnia po zapłodnieniu (dpf) ^1,4,5. Zachowanie odpowiedzi zapalnej i leukocytów na uraz sprawiło, że zarodek danio pręgowanego stał się modelem informacyjnym dla tak różnych procesów zapalnych, jak zakażenie gruźlicą, zapalenie jelit i regeneracja tkanek^6-9. Zarodki danio pręgowanego wykorzystano do badania stanu zapalnego związanego z urazem, szczególnie w kontekście zranień nabłonka i odpowiedzi neutrofili^10,11. Uszkodzenie zarodka powoduje wysoce konserwatywną odpowiedź komórkową komórek w miejscu uszkodzenia i wrodzonych komórek odpornościowych zrekrutowanych do reagowania na uraz i regulowania jego rozdzielczości^11,12. Inne modele urazów wykorzystywały skupione impulsy laserowe do przestrzennej lokalizacji uszkodzeń określonych typów komórek, w tym neuronów, komórek mięśniowych i kardiomiocytów^13-15.

Zarodki danio pręgowanego były używane jako model do badania hemostazy i zakrzepicy w warunkach farmakologicznej i genetycznej manipulacji, wykorzystując zarówno mechaniczne, jak i indukowane laserem tworzenie skrzepliny^16-19. Składniki kaskady krzepnięcia wydają się być dobrze zachowane, a transgeniki pozwoliły na szczegółowe badania odkładania się trombocytów i fibryny w miejscu krzepnięcia^17,20,21. Procedura przedstawiona w niniejszej pracy uzupełnia te metody, dostarczając system do badania mechanicznych uszkodzeń naczyń prowadzących do przerwania naczynia, powstania i ustąpienia skrzepliny oraz naprawy naczynia.

UWAGA: Procedury z użyciem danio zebranego zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UCSF.

1. Przygotowanie narzędzi

1. Włóż szpilkę minucji do uchwytu kołka i clamp kołek.
2. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie zegnij końcówkę szpilki, aby utworzyć lekki haczyk.
3. W celu manipulacji i stabilizacji zarodka podczas urazu, zegnij koniec igły o średnicy 28 cali i średnicy 1/2 cala zamontowanej na strzykawce insulinowej za pomocą szczypiec z wąskimi końcówkami.

2. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego do zranienia

1. Ustaw pary hodowlane danio pręgowanego i zbieraj jaja w wodzie z jaj (60ug/ml soli akwariowych), jak pokazano wcześniej²².
2. Dodaj 0,003% N-fenylotiomocznika (PTU) do wody jajowej, gdy zarodki są około 8 godzin po zapłodnieniu (hpf), aby zapobiec melanizacji.
3. Dechorionacja zarodków dwa dni po zapłodnieniu (dpf) przed eksperymentem za pomocą kleszczyków z cienką końcówką.
   UWAGA: Zarodki mogą zostać uszkodzone w dowolnym momencie po rozpoczęciu krążenia. Przedstawione tutaj dane dotyczą zarodków o zawartości 2 dpf, ale technika ta została z powodzeniem zastosowana w przypadku zarodków o zawartości do 5 dpf.
4. Znieczulić zarodki 0,02% buforowanym kwasem 3-aminobenzoesowym (Trikainą) na około 10 minut przed manipulacjami.

3. Mechaniczne uszkodzenie naczyń krwionośnych zarodków

1. Przenieś znieczulone zarodki do szkiełka depresyjnego na stereomikroskopie preparacyjnym za pomocą pipety transferowej.
2. Używając krótkiej, płaskiej strony igły strzykawki do manipulowania zarodkiem ręką dominującą, ustaw zarodek na boku z powierzchnią brzuszną skierowaną w stronę przeciwną do igły.
3. Umieść szpilkę minucji z końcówką skierowaną bezpośrednio na brzuszną powierzchnię ryby za otworem moczowo-płciowym. Umieść szpilkę minucji pod niewielkim kątem, tak aby zakrzywiona końcówka była w stanie przebić się przez perydermę bezpośrednio do żyły ogonowej (ryc. 1).
4. Używając igły strzykawki do manipulowania zarodkiem, przebij żyłę ogonową szpilką do minucji, wbijając zarodek w szpilkę, aby lekko zaczepić szpilkę w żyle.
5. Za pomocą igły strzykawki odciągnij zarodek od szpilki do drobnych drobiazgów, aby utworzyć małe rozdarcie w naczyniu.
   UWAGA: Udana kontuzja spowoduje natychmiastowe krwawienie z żyły.

4. Analiza hemostazy

1. Do tej procedury wybieraj tylko zarodki z widocznie krążącymi krwinkami.
2. Przygotuj się do uruchomienia stopera, gdy tylko szpilka minucji zostanie wyciągnięta z naczynia.
3. Uruchom stoper, gdy tylko będzie można uwidocznić utratę krwi z rany. Gdy utrata krwi z rany ustanie, zatrzymaj stoper i zapisz całkowity czas jako czas krwawienia. Jeśli krzepnięcie jest zahamowane, należy zanotować czas, do którego nie ma już widocznie krążących krwinek.

5. Analiza gojenia się ran

1. Przenieś zwierzęta po urazie na naczynia obrazowe ze szklanym dnem w celu mikroskopii.
2. Usuń większość wody z jajka
.
3. Przykryj zarodki 0,3-1,2% niskotopliwą agarozą rozpuszczoną w wodzie jajecznej, podgrzaną do temperatury od 42 do 45 ºC i uzupełnioną 0,02% trikainy.
4. Ułóż zarodki na boku za pomocą kleszczy.
5. Po ostygnięciu agarozy napełnij naczynie 0,02% trikainy w wodzie jajecznej.
6. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopii jasnego pola, epifluorescencji lub konfokalnej.
7. Usuń zarodek z agarozy za pomocą kleszczy i przenieś z powrotem do wody jajecznej.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia zostało przeprowadzone na 2 zarodkach dpf (Rysunek 2A-C). Uraz powoduje szybką i niezawodną reakcję krzepnięcia, mierzoną czasem do ustania krwawienia (ryc. 2D). Aby ustalić, czy można zmierzyć różnice w odpowiedzi krzepnięcia, przeciwzakrzepowy hirudyna została podana do zarodków przez wstrzyknięcie do przewodu Cuviera bezpośrednio przed zranieniem (5-10 nl z 1 jednostki na μl hirudyny rozpuszczonej w wodzie) w celu wykazania wstrzyknięć do przewodu Cuviera, patrz poprzedni artykułJoVE 23)24. Podanie hirudyny przed urazem spowodowało znaczne wydłużenie czasu krwawienia w porównaniu z kontrolą nośnika (ryc. 2D).

Dowody uszkodzenia naczyń krwionośnych i krzepnięcia można zobaczyć bezpośrednio po urazie, używając transgenicznych linii dla markerów śródbłonka (KDRL:EGFP) i czerwonych krwinek (GATA1A:DSRED)25,26. Obrazy były rejestrowane sekwencyjnie co 5 minut przez okres 12 godzin przy użyciu epifluorescencji. Reprezentatywne obrazy nieruchome są pokazane na różnych etapach gojenia się rany (ryc. 3). Wykorzystując kombinację różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) i mikroskopii fluorescencyjnej, możliwe jest zmierzenie różnych parametrów gojenia się ran. W celu ustalenia, czy gojenie się ran przebiegało zgodnie z powtarzalnym wzorcem we wszystkich eksperymentach, czas do przywrócenia przepływu krwi mierzono w 4 grupach ryb. Uszkodzenie naczynia spowodowało wiarygodną stereotypową reakcję 253 ± 16 min na przywrócenie przepływu krwi przez uszkodzone naczynie (n = 4-5 ryb na eksperyment, średnia ± SEM).

Rycina 1: Schemat zarodka o ciśnieniu 2 dpf przedstawiający rozmieszczenie szpilki do wykonania mechanicznego uszkodzenia żyły ogonowej (CV). Przedział naczyniowy jest zacieniowany na szaro

Rysunek 2: Czas krwawienia można zmierzyć wizualnie po urazie mechanicznym. Kadry z filmu w czasie rzeczywistym przedstawiającego uszkodzenie naczynia danio pręgowanego na 2 zarodkach dpf. Obrazy są wyświetlane w momencie urazu (A), podczas czynnej utraty krwi z rany (B) oraz po ustaniu utraty krwi (C). Wszystkie podane czasy są podane w sekundach. Zarodki są zorientowane bocznie, z przednią u góry i brzuszną powierzchnią skierowaną w lewo. Podziałka 100 μm. Podanie przeciwzakrzepowego hirudyny prowadziło do znacznego wydłużenia czasu krwawienia w porównaniu z kontrolą nośnika (D) (p <0,0001, test t-Studenta). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Wizualizacja uszkodzeń mechanicznych i naprawy za pomocą markerów transgenicznych. Zdjęcia z poklatkowej mikroskopii DIC i mikroskopii fluorescencyjnej po uszkodzeniu naczynia przy użyciu markerów śródbłonka naczyniowego (kdrl:egfp) i czerwonych krwinek (gata1a:dsred) w 2 zarodkach dpf. Obrazy wykazały lukę w naczyniach i miejscowe nagromadzenie czerwonych krwinek (t = 25), częściową naprawę z przywróconym przepływem krwi (t = 210) i pozornie całkowite przywrócenie normalnej struktury naczyń (t = 615). Czas jest wskazywany w minutach. Zarodki są zorientowane bocznie, z przednią u góry i brzuszną powierzchnią skierowaną w lewo. * wskazuje położenie aorty grzbietowej. Uraz (grot strzały) przerwał żyłę ogonową i część splotu ogonowego. Podziałka 25 μm.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.