Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52460

⸱

17 lutego 2015

 , 
1Cardiovascular Research Institute, University of California

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Zarodki danio pręgowanego (Danio rerio) okazały się potężnym modelem do badania różnych procesów rozwojowych i chorobowych. Rozwój zewnętrzny i przezroczystość optyczna sprawiają, że zarodki te są szczególnie podatne na mikroskopię, a dostępne są liczne linie transgeniczne, które znakują określone typy komórek białkami fluorescencyjnymi, co czyni zarodek danio pręgowanego idealnym systemem do wizualizacji interakcji komórek naczyniowych, krwiotwórczych i innych podczas urazu i naprawy in vivo. Genetyka do przodu i do tyłu u danio pręgowanego jest dobrze rozwinięta, a manipulacja farmakologiczna jest możliwa. Opisujemy model mechanicznego uszkodzenia naczyń krwionośnych przy użyciu technik mikromanipulacji, który wykorzystuje kilka z tych cech do badania reakcji na uszkodzenie naczyń, w tym hemostazy i naprawy naczyń krwionośnych. Korzystając z połączenia mikroskopii wideo i timelapse, wykazaliśmy, że ta metoda uszkodzenia naczyń krwionośnych powoduje mierzalne i powtarzalne reakcje podczas hemostazy i gojenia się ran. Metoda ta zapewnia system do szczegółowego badania uszkodzeń i napraw naczyń krwionośnych w całym modelu zwierzęcym.

Wprowadzenie

Danio pręgowany był szeroko wykorzystywany do badania różnych tematów z zakresu biologii naczyniowej, w tym rozwoju naczyń, angiogenezy oraz rozwoju i patologii hematopoetycznej1-3. Zarodki rozwijają funkcjonalne krążenie, a także leukocyty i inne składniki wrodzonego układu odpornościowego do 1 dnia po zapłodnieniu (dpf) 1,4,5. Zachowanie odpowiedzi zapalnej i leukocytów na uraz sprawiło, że zarodek danio pręgowanego stał się modelem informacyjnym dla tak różnych procesów zapalnych, jak zakażenie gruźlicą, zapalenie jelit i regeneracja tkanek6-9. Zarodki danio pręgowanego wykorzystano do badania stanu zapalnego związanego z urazem, szczególnie w kontekście zranień nabłonka i odpowiedzi neutrofili10,11. Uszkodzenie zarodka powoduje wysoce konserwatywną odpowiedź komórkową komórek w miejscu uszkodzenia i wrodzonych komórek odpornościowych zrekrutowanych do reagowania na uraz i regulowania jego rozdzielczości11,12. Inne modele urazów wykorzystywały skupione impulsy laserowe do przestrzennej lokalizacji uszkodzeń określonych typów komórek, w tym neuronów, komórek mięśniowych i kardiomiocytów13-15.

Zarodki danio pręgowanego były używane jako model do badania hemostazy i zakrzepicy w warunkach farmakologicznej i genetycznej manipulacji, wykorzystując zarówno mechaniczne, jak i indukowane laserem tworzenie skrzepliny16-19. Składniki kaskady krzepnięcia wydają się być dobrze zachowane, a transgeniki pozwoliły na szczegółowe badania odkładania się trombocytów i fibryny w miejscu krzepnięcia17,20,21. Procedura przedstawiona w niniejszej pracy uzupełnia te metody, dostarczając system do badania mechanicznych uszkodzeń naczyń prowadzących do przerwania naczynia, powstania i ustąpienia skrzepliny oraz naprawy naczynia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Procedury z użyciem danio zebranego zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UCSF.

1. Przygotowanie narzędzi

  1. Włóż szpilkę minucji do uchwytu kołka i clamp kołek.
  2. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie zegnij końcówkę szpilki, aby utworzyć lekki haczyk.
  3. W celu manipulacji i stabilizacji zarodka podczas urazu, zegnij koniec igły o średnicy 28 cali i średnicy 1/2 cala zamontowanej na strzykawce insulinowej za pomocą szczypiec z wąskimi końcówkami.

2. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego do zranienia

  1. Ustaw pary hodowlane danio pręgowanego i zbieraj jaja w wodzie z jaj (60ug/ml soli akwariowych), jak pokazano wcześniej22.
  2. Dodaj 0,003% N-fenylotiomocznika (PTU) do wody jajowej, gdy zarodki są około 8 godzin po zapłodnieniu (hpf), aby zapobiec melanizacji.
  3. Dechorionacja zarodków dwa dni po zapłodnieniu (dpf) przed eksperymentem za pomocą kleszczyków z cienką końcówką.
    UWAGA: Zarodki mogą zostać uszkodzone w dowolnym momencie po rozpoczęciu krążenia. Przedstawione tutaj dane dotyczą zarodków o zawartości 2 dpf, ale technika ta została z powodzeniem zastosowana w przypadku zarodków o zawartości do 5 dpf.
  4. Znieczulić zarodki 0,02% buforowanym kwasem 3-aminobenzoesowym (Trikainą) na około 10 minut przed manipulacjami.

3. Mechaniczne uszkodzenie naczyń krwionośnych zarodków

  1. Przenieś znieczulone zarodki do szkiełka depresyjnego na stereomikroskopie preparacyjnym za pomocą pipety transferowej.
  2. Używając krótkiej, płaskiej strony igły strzykawki do manipulowania zarodkiem ręką dominującą, ustaw zarodek na boku z powierzchnią brzuszną skierowaną w stronę przeciwną do igły.
  3. Umieść szpilkę minucji z końcówką skierowaną bezpośrednio na brzuszną powierzchnię ryby za otworem moczowo-płciowym. Umieść szpilkę minucji pod niewielkim kątem, tak aby zakrzywiona końcówka była w stanie przebić się przez perydermę bezpośrednio do żyły ogonowej (ryc. 1).
  4. Używając igły strzykawki do manipulowania zarodkiem, przebij żyłę ogonową szpilką do minucji, wbijając zarodek w szpilkę, aby lekko zaczepić szpilkę w żyle.
  5. Za pomocą igły strzykawki odciągnij zarodek od szpilki do drobnych drobiazgów, aby utworzyć małe rozdarcie w naczyniu.
    UWAGA: Udana kontuzja spowoduje natychmiastowe krwawienie z żyły.

4. Analiza hemostazy

  1. Do tej procedury wybieraj tylko zarodki z widocznie krążącymi krwinkami.
  2. Przygotuj się do uruchomienia stopera, gdy tylko szpilka minucji zostanie wyciągnięta z naczynia.
  3. Uruchom stoper, gdy tylko będzie można uwidocznić utratę krwi z rany. Gdy utrata krwi z rany ustanie, zatrzymaj stoper i zapisz całkowity czas jako czas krwawienia. Jeśli krzepnięcie jest zahamowane, należy zanotować czas, do którego nie ma już widocznie krążących krwinek.

5. Analiza gojenia się ran

  1. Przenieś zwierzęta po urazie na naczynia obrazowe ze szklanym dnem w celu mikroskopii.
  2. Usuń większość wody z jajka
    3. .
  3. Przykryj zarodki 0,3-1,2% niskotopliwą agarozą rozpuszczoną w wodzie jajecznej, podgrzaną do temperatury od 42 do 45 ºC i uzupełnioną 0,02% trikainy.
  4. Ułóż zarodki na boku za pomocą kleszczy.
  5. Po ostygnięciu agarozy napełnij naczynie 0,02% trikainy w wodzie jajecznej.
  6. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopii jasnego pola, epifluorescencji lub konfokalnej.
  7. Usuń zarodek z agarozy za pomocą kleszczy i przenieś z powrotem do wody jajecznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mechaniczne uszkodzenie naczyń przeprowadzono na embrionach w 2 dpf (Rysunek 2A-C). Uszkodzenie prowadzi do szybkiej i powtarzalnej odpowiedzi krzepnięcia, mierzonej jako czas do zatrzymania krwawienia (Rysunek 2D). Aby ustalić, czy można zmierzyć różnice w odpowiedzi krzepnięcia, embrionom podano przeciwzakrzepowy hirudyn poprzez wstrzyknięcie do przewodu Cuviera bezpośrednio przed zranieniem (5-10 nl hirudyny o stężeniu 1 jednostki na µl rozpuszczonej w wodzie) (demons...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Danio pręgowany był z powodzeniem stosowany jako model różnych rodzajów ran, w tym urazów laserowych13-15, zakrzepicy wywołanej laserem16 i zranień nabłonka10. Opisujemy metodę mechanicznego zranienia, która jest prosta do wykonania i powoduje kontrolowane uszkodzenie w modelu in vivo , który jest wysoce podatny na mikroskopię w czasie rzeczywistym. Uraz powoduje szybką i mierzalną odpowiedź hemostatyczną oraz powtarzalny program naprawy ran, który można monitorować za pomocą mik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Stephenowi Wilsonowi i Lisie Wilsbacher za pomocne dyskusje. Prace te były częściowo wspierane przez NIH HL054737.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Minutia PinsFine Science Tools26002-10Średnica końcówki 0,0125 mm, średnica pręta 0,1 mm
Uchwyt na szpilkiFine Science Tools26016-12
Dumont #5 Kleszczyki z cienką końcówkąFine Science Tools11254-20
Szklana zjeżdżalnia depresyjnaAquatic Eco-SystemsM30
Agaroza niskotopliwaLonza 50081Wstępnie podgrzany do 42 º C
N-fenylotiomocznik (PTU)Sigma AldrichP7629
Kwas 3-aminobenzoesowy (Trikaina)Sigma AldrichE10521
HirudinSigma AldrichH7016
Naczynia do obrazowania ze szklanym dnemMattekP35G-1.5-14-C
Mikroskop preparacyjnyOlympusSZH10
Mikroskop fluorescencyjnySole akwariowe ZeissAxio Observer
Instant Ocean
Insulin strzykawka z igłą 28,5 GBecton Dickinson 
329461

Bibliografia

  1. Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684(2012).
  2. Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
  3. Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
  4. Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
  5. Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
  6. Lieschke, G. J., Trede, N. S. Fish immunology. Curr Biol. 19 (16), R678-R682 (2009).
  7. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
  8. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
  9. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  10. LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Inflammation and wound repair. Semin Immunol. , (2014).
  11. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  12. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  13. Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
  14. Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351(2013).
  15. Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
  16. Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S. Laser-induced thrombosis in zebrafish. Methods Cell Biol. 101, 197-203 (2011).
  17. Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682(2013).
  18. Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
  19. Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
  20. Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
  21. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  23. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
  24. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 3-4 (1999).
  25. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
  26. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  27. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  28. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  29. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48(2007).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
  32. Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
  33. Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena hemostazymikroskopia poklatkowaanaliza gojenia rantechniki mikromanipulacyjnemikroskopia konfokalnalinie transgenicznepomiar czasu krwawieniamodel uszkodzenia naczyniowego
Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.