Ten protokół opisuje, jak wytworzyć funkcjonalną tkankę węzłową zatok z mysich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Nadekspresja T-Box3 (TBX3) oraz dobór antybiotyków promotora miozyny o ciężkim łańcuchu (Myh6) prowadzi do wysoce czystych agregatów komórek rozrusznika serca. Te "indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe" ("iSAB") zawierają ponad 80% komórek rozrusznika serca, wykazują znacznie zwiększoną szybkość bicia i są w stanie nadawać tempo mięśnia sercowego ex vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generowanie agregatów komórek mysiego rozrusznika serca w oparciu o programowanie komórek ES w połączeniu z selekcją promotora Myh6
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Leczenie "zespołu chorej zatoki" opiera się na sztucznych rozrusznikach serca. Niosą one ze sobą zagrożenia, takie jak awaria baterii i infekcje. Co więcej, brakuje im reakcji hormonalnej, a cała procedura jest kosztowna. "Biologiczne rozruszniki serca" generowane z PSC mogą stać się alternatywą, jednak typowa zawartość komórek rozrusznika serca w ciałach embrionalnych (EB) jest niezwykle niska. Opisany protokół łączy "programowanie do przodu" mysich PSC za pośrednictwem induktora węzła zatokowego TBX3 z selekcją antybiotyków opartą na promotorze Myh6. W ten sposób uzyskuje się agregaty kardiomiocytów zgodne z >80% fizjologicznie funkcjonalnymi komórkami rozrusznika serca. Te "indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe" ("iSAB") spontanicznie kurczą się z jeszcze nieosiągniętymi częstotliwościami (400-500 uderzeń na minutę) odpowiadającymi komórkom węzłowym wyizolowanym z serc myszy i są w stanie nadawać tempo mysiemu mięśniowi sercowemu ex vivo. Za pomocą opisanego protokołu można wygenerować pojedyncze komórki węzłów zatokowych o wysokiej czystości, które można np. wykorzystać do testów narkotykowych in vitro. Co więcej, iSAB wygenerowane zgodnie z tym protokołem mogą stać się kluczowym krokiem w kierunku inżynierii tkankowej serca.
Wprowadzenie
Termin "zespół chorej zatoki" podsumowuje wiele chorób prowadzących do pogorszenia stanu układu rozrusznika serca. Obejmuje patologiczną, objawową bradykardię zatokową, blok zatokowo-przedsionkowy, zatrzymanie zatok, a także zespół tachykardia-bradykardia. W związku z tym "zespołowi chorej zatoki" często towarzyszą ogólne choroby serca, takie jak choroba niedokrwienna serca, kardiomiopatie lub zapalenie mięśnia sercowego. Obecnie podejścia terapeutyczne opierają się na wszczepianiu elektrycznych rozruszników serca. Wiąże się to jednak z szeregiem zagrożeń, takich jak infekcje i awaria baterii. Ogólnie rzecz biorąc, częstość występowania powikłań jest nadal bardzo wyso....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Zalecenia przed rozpoczęciem
- Nie należy stosować PSC zanieczyszczonych mykoplazmą, ponieważ nie będą one prawidłowo różnicować się w komórki węzła zatokowego. Test na skażenie mykoplazmą przed rozpoczęciem protokołu. Zrób to za pomocą zestawu PCR do szybkiego, bardzo czułego wykrywania mykoplazm i postępuj zgodnie z protokołem producenta.
- Dla każdej szalki Petriego (etap 2.3.4) pokryć jedną 10 cm2 naczynie do hodowli komórkowych sterylną 7 ml 0,1 % żelatyny ze skóry ryb zimnowodnych przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć żelatynę i pozostawić naczynie do wyschnięcia w sterylnych warunkach na sterylnej ławce.
- Zanim bę....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisany protokół umożliwia generowanie iSAB z PSC (pokazane na filmie) o częstotliwości skurczów wynoszącej około 450 bpm, co jest wartością zbliżoną do częstotliwości bicia serca myszy. Po dysocjacji iSAB (krok 2.8.8) zaobserwowane pojedyncze komórki wykazują typowy kształt komórek węzła zatokowego (komórki wrzecionowate i pająkowate), jak pokazano na Rysunku 1. Komórki te wykazują wysoką ekspresję białek uznanych za niezbędne dla funkcji węzła zatokowego, takich jak hiperpolaryzacyjnie aktywowany cykli.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zdolność do wytwarzania komórek rozrusznika serca pochodzących z komórek macierzystych może pozwolić na odtworzenie prawidłowego rytmu serca w sensie "biologicznych rozruszników serca". Podobnie testowanie narkotyków in vitro skorzysta na ich dostępności. PSC mogą dać początek każdemu typowi komórek w ciele ssaka, w tym kardiomiocytom o właściwościach komórek rozrusznikaserca 8,9,10,11,12,13. Jednak zazwyczaj populacje komórek w "ciałach zarodkowych" są wysoce niejednorodne, co nieuchronnie prowadzi do wymogu .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płynna pożywka Iscove ze stabilną glutaminą | Biochrom AG | FG 0465 | |
| Pożywka płynna DMEM bez na-pirogronianu, ze stabilną glutaminą | Biochrom AG | FG 0435 | |
| CLS typ IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 | |
| Aminokwasy endogenne | Biochrom AG | K 0293 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| Pirogronian sodu (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 | |
| G 418-BC płyn (roztwór gotowy do użycia), sterylny | Biochrom AG | A 2912 | |
| Zbiornik na odczynnik PP f. wielokanałowa pipe. 60ml, sterylny | Marka | 703409 | |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 | |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, pipeta elektroniczna | Eppendorf | 4861000155 | |
| Falcon Cell Strainer 40 µ m | Falcon | 352340 | |
| Penicylina/Streptomycyna | GE Healthcare | P11-010 | |
| Szalki Petriego | Greiner BioOne | 663102 | |
| DPBS bez Ca i Mg | PAN-Biotech | P04-36500 | |
| Surowica bydlęca | płodu PAN-Biotech | P30-3302 | |
| Czynnik hamujący białaczkę | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 | |
| Kwadratowe szalki Petriego | Roth | PX67.1 | |
| Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnych | SigmaAldrich | G7765 | |
| 2-Merkaptoetanol | SigmaAldrich | M3148 | |
| 1-Tioglycerol | SigmaAldrich | M6145 | |
| Naczynia do hodowli tkankowych | TPP | 93100 | |
| Kolba do hodowli tkankowych | TPP | 90076 | |
| Płytki do badania kultur tkankowych (24 dołki) | TPP | 92424 |
Bibliografia
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).
- David, R., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
