Generowanie agregatów komórek mysiego rozrusznika serca w oparciu o programowanie komórek ES w połączeniu z selekcją promotora Myh6

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak wytworzyć funkcjonalną tkankę węzłową zatok z mysich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Nadekspresja T-Box3 (TBX3) oraz dobór antybiotyków promotora miozyny o ciężkim łańcuchu (Myh6) prowadzi do wysoce czystych agregatów komórek rozrusznika serca. Te "indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe" ("iSAB") zawierają ponad 80% komórek rozrusznika serca, wykazują znacznie zwiększoną szybkość bicia i są w stanie nadawać tempo mięśnia sercowego ex vivo.

Streszczenie

Leczenie "zespołu chorej zatoki" opiera się na sztucznych rozrusznikach serca. Niosą one ze sobą zagrożenia, takie jak awaria baterii i infekcje. Co więcej, brakuje im reakcji hormonalnej, a cała procedura jest kosztowna. "Biologiczne rozruszniki serca" generowane z PSC mogą stać się alternatywą, jednak typowa zawartość komórek rozrusznika serca w ciałach embrionalnych (EB) jest niezwykle niska. Opisany protokół łączy "programowanie do przodu" mysich PSC za pośrednictwem induktora węzła zatokowego TBX3 z selekcją antybiotyków opartą na promotorze Myh6. W ten sposób uzyskuje się agregaty kardiomiocytów zgodne z >80% fizjologicznie funkcjonalnymi komórkami rozrusznika serca. Te "indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe" ("iSAB") spontanicznie kurczą się z jeszcze nieosiągniętymi częstotliwościami (400-500 uderzeń na minutę) odpowiadającymi komórkom węzłowym wyizolowanym z serc myszy i są w stanie nadawać tempo mysiemu mięśniowi sercowemu ex vivo. Za pomocą opisanego protokołu można wygenerować pojedyncze komórki węzłów zatokowych o wysokiej czystości, które można np. wykorzystać do testów narkotykowych in vitro. Co więcej, iSAB wygenerowane zgodnie z tym protokołem mogą stać się kluczowym krokiem w kierunku inżynierii tkankowej serca.

Wprowadzenie

Termin "zespół chorej zatoki" podsumowuje wiele chorób prowadzących do pogorszenia stanu układu rozrusznika serca. Obejmuje patologiczną, objawową bradykardię zatokową, blok zatokowo-przedsionkowy, zatrzymanie zatok, a także zespół tachykardia-bradykardia. W związku z tym "zespołowi chorej zatoki" często towarzyszą ogólne choroby serca, takie jak choroba niedokrwienna serca, kardiomiopatie lub zapalenie mięśnia sercowego. Obecnie podejścia terapeutyczne opierają się na wszczepianiu elektrycznych rozruszników serca. Wiąże się to jednak z szeregiem zagrożeń, takich jak infekcje i awaria baterii. Ogólnie rzecz biorąc, częstość występowania powikłań jest nadal bardzo wysoka u pacjentów, którym wszczepiono sztuczny rozrusznik serca. Ponadto, w przeciwieństwie do endogennego rozrusznika serca, urządzenia te nie reagują na stymulację hormonalną.

Przyszła alternatywa może polegać na dostępności "biologicznych rozruszników serca", dla których PSC mogłyby służyć jako odpowiednie źródło komórkowe i które byłyby również bardzo cenne dla testów leków in vitro. Jednak główny problem polega na bardzo rzadkim pojawianiu się komórek węzłowych zatok w ciałach zarodkowych (EB) - zwykle nie przekracza to ~0,5%¹.

Poprzednio wykazano, że "programowanie do przodu" w kierunku określonych podtypów kardiomiocytów jest możliwe poprzez nadekspresję różnych wczesnych czynników transkrypcyjnych układu sercowo-naczyniowego, takich jak Mezoderma-specyficzna dla tylnej części ciała 1 (MesP1) i związana z czynnikiem transkrypcyjnym NK2, locus 5 (Nkx2.5)^2,3. Dla prawidłowej wielkości i funkcji węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) kluczowe znaczenie ma czynnik transkrypcyjny T-box Tbx3, który, jak wykazano, inicjuje program genu rozrusznika serca i kontroluje różnicowanie SAN⁴. Chociaż poprawiło to wygląd funkcjonalnych komórek rozrusznika serca, zawartość nadal nie przekraczała ~ 40% w całej populacji komórek kardiomiocytarnych.

Dlatego też wprowadziliśmy dodatkowy etap⁵ selekcji antybiotyków oparty na promotorze Myh6. To ostatecznie prowadzi do powstania nieobserwowanych jeszcze agregatów kardiomiocytów ("indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe"; "iSAB"), które wykazują znacznie zwiększoną częstotliwość uderzeń (>400 uderzeń na minutę) in vitro, po raz pierwszy zbliżoną do częstotliwości mysiego serca i porównywalną z hodowanymi in vitro komórkami węzłowymi zatok wyizolowanymi z mysiego serca⁶. Przy podawaniu izoprenaliny osiąga się nawet częstotliwość dudnienia 550 uderzeń na minutę. Warto zauważyć, że iSAB składają się w ponad 80% z funkcjonalnych komórek węzłowych, jak wynika z obszernych analiz fizjologicznych⁷. Ostatnio opisano kilka podejść do generowania komórek węzłowych zatok za pomocą bezpośredniego przeprogramowania¹⁹, markerów powierzchniowych¹⁴ lub leczenia farmakologicznego małymi cząsteczkami^16,17. Jednak żadna z tych metod nie doprowadziła do tak wysokiej czystości komórek rozrusznika serca i częstotliwości bicia zbliżonych do mysiego serca, jak obserwowano w iSAB.

Ponadto, w modelu ex vivo hodowanych wycinków komorowych dorosłej myszy, które utraciły swoją spontaniczną aktywność bicia, iSAB są zdolne do integracji z tkanką plastru, pozostając tym samym spontanicznie aktywnymi i silnie pobudzając plastry serca do skurczów⁷. Szczegółowy protokół generowania tych iSAB jest opisany w tym artykule.

Protokół

1. Zalecenia przed rozpoczęciem

1. Nie należy stosować PSC zanieczyszczonych mykoplazmą, ponieważ nie będą one prawidłowo różnicować się w komórki węzła zatokowego. Test na skażenie mykoplazmą przed rozpoczęciem protokołu. Zrób to za pomocą zestawu PCR do szybkiego, bardzo czułego wykrywania mykoplazm i postępuj zgodnie z protokołem producenta.
2. Dla każdej szalki Petriego (etap 2.3.4) pokryć jedną 10 cm² naczynie do hodowli komórkowych sterylną 7 ml 0,1 % żelatyny ze skóry ryb zimnowodnych przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć żelatynę i pozostawić naczynie do wyschnięcia w sterylnych warunkach na sterylnej ławce.
3. Zanim będzie można rozpocząć protokół różnicowania, potrzebny jest podwójnie transfekowany, stabilny klon linii komórkowej ES myszy zawierający następujące cechy: i) Konstytutywna nadekspresja TBX3 przy użyciu wektora ekspresji ssaków. ii) Gen oporności na G418 pod kontrolą promotora Myh6⁵.
4. Niezróżnicowane komórki PSC powinny być hodowane wspólnie z napromieniowanymi komórkami zasilającymi w normalnych warunkach, jak opisano ^{w punkcie 1}.

2. Procedura różnicowania

1. Dwa dni przed różnicowaniem - Usuń PSC z komórek zasilających.
   1. Odessać pożywkę, przemyć komórki 10 ml PBS z roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, dodać 7 ml roztworu kolagenazy dożylnej i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Umieścić sterylny filtr 40 μm w probówce o pojemności 50 ml.
   2. Ostrożnie wypłucz kolonie PSC (unikaj usuwania komórek zasilających), pipetując roztwór kolagenazy 5 razy w górę iw dół.
   3. Przenieść zawiesinę komórek do filtra 40 μm, przepłukać filtr trzykrotnie 8 ml PBS. Odwróć filtr i umieść go do góry nogami na szalce Petriego. Usunąć kolonie komórek PSC, odpipetowując 10 ml PBS na dno filtra.
   4. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 300 x g.
   5. Usunąć PBS, zawiesić komórki w 1 ml Accutase i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   6. Dodać 10 ml PBS, wymieszać roztwór komórkowy, pipetując go 5 razy w górę i w dół, i odwirować przez 5 minut przy 300 x g.
   7. Usunąć PBS, zawiesić komórki w 10 ml pożywki hodowlanej i określić liczbę komórek.
   8. Wysiewaj 15 000 komórek/^cm2 na kolbie filtracyjnej o średnicy 75^cm2 i hoduj je przez 2 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Po 2 dniach kolba powinna być zlewająca się w 50-70%.
2. Dzień 0 - Początek różnicowania
   1. Usunąć pożywkę i przemyć komórki 10 ml PBS.
   2. Odessać PBS, dodać 2 ml Accutazy i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Umieścić sterylny filtr 40 μm w probówce o pojemności 50 ml.
   3. Dodać 10 ml PBS, przenieść zawiesinę komórek do filtra 40 μm, przepłukać filtr przez dodanie 10 ml PBS i odwirować przepływ przez 5 minut przy 300 x g.
   4. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki różnicującej i określić liczbę komórek.
   5. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową pożywką różnicującą do końcowego stężenia 20 000 komórek/ml.
   6. Odpipetować pipetą 20 ml wody i 5 ml roztworu do zawieszania kropli (HD) na kwadratowej szalce Petriego, aby uniknąć wysuszenia HDs.
      UWAGA: Dla każdej płytki 24-dołkowej zawierającej iSAB (patrz sekcja 2.8.6.4/2.8.7) należy rozpocząć od 16 szalek Petriego.
   7. Pipetować do 50 ml zawiesiny komórek w tacy.
   8. Odwróć pokrywę szalki Petriego. Umieść 180 HD każdy, z których każdy zawiera 20 μl (400 komórek/HD) zawiesiny komórek na pokrywie za pomocą 12-kanałowej pipety.
   9. Ostrożnie odwróć pokrywkę i umieść ją na szalce Petriego.
      UWAGA: Szybkość obracania pokrywy jest bardzo ważna. Jeśli pokrywka jest obracana zbyt wolno lub zbyt szybko, napięcie powierzchniowe zawiesiny komórek nie jest wystarczająco wysokie, aby zatrzymać wiszące krople na pokrywie. Zanim spróbujesz wyprodukować HD po raz pierwszy, poćwicz obracanie pokrywki z 20 μl kropli podłoża.
   10. Hodować komórki przez 2 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 ,} aby mogły utworzyć EBs.
       UWAGA: Umieść jedną szalkę Petriego wypełnioną wodą na szczycie stosu 5 szalek Petriego. W przeciwnym razie HD w górnej szalce Petriego wyschnie.
3. Dzień 2
   1. Ostrożnie obrócić pokrywę kwadratowej płytki Petriego i przenieść EB pochodzące z dwóch płytek Petriego (360 EBs) do probówki o pojemności 50 ml.
   2. Odczekaj 10 minut, aby EB osiadły na dnie probówki (nie odwirowuj EBs).
   3. Odessać jak najwięcej pożywki, zawiesić EB w 10 ml pożywki różnicującej i przenieść zawiesinę na 10-centymetrową szalkę Petriego.
4. Dzień 2-6 Posiew zawiesiny
   1. Uprawiać EB w zawiesinie przez 4 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 ,} zmienić podłoże po 2 dniach.
      UWAGA: Mimo że szalka Petriego nie jest pokryta (w przeciwieństwie do szalki do hodowli komórkowych), EB często przyczepiają się do powierzchni. Codziennie kontroluj szalki Petriego pod kątem dołączonych EB i w razie potrzeby odłącz EB od powierzchni poprzez delikatne pipetowanie. Opcjonalnie: Potrząsaj szalkami Petriego w sposób ciągły w okresie hodowli zawiesiny. Uważaj na prędkość wytrząsarki. EB nie powinny gromadzić się w środku ani unosić się do granicy szalek Petriego.
5. Dzień 6
   1. Przenieść EB z jednej szalki Petriego na jedną pokrytą żelatyną 10 cm² naczynie do hodowli komórkowych.
6. Dzień 7-12
   1. Komórki powinny zacząć bić po 8-12 dniach. Sprawdzaj, czy ogniska bicia komórek są codziennie pod mikroskopem. Komórki zaczynają tworzyć warstwę.
   2. Zmieniaj medium codziennie.
      UWAGA: Po zmianie podłoża komórki potrzebują 3-4 godzin, aby się zregenerować i ponownie zacząć bić.
7. Dzień 12-15 Selekcja komórek węzłowych zatok.
   1. Trzy dni po tym, jak komórki zaczną bić (około 12-15 dnia), odessać pożywkę i odpipetować 10 ml świeżej pożywki różnicującej zawierającej 400 μg/ml G418 do komórek.
8. Cztery dni po rozpoczęciu selekcji zdysocjuj warstwę komórki.
   UWAGA: Możliwe, że warstwa komórkowa jest już oderwana od powierzchni.
   1. Ostrożnie usunąć pożywkę, nie zasysając warstwy komórek.
   2. Dodać 10 ml PBS i ostrożnie usunąć PBS bez zasysania warstwy komórek.
   3. Dodać 10 ml roztworu kolagenazy dożylnej, przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   4. Energicznie wymieszać zawiesinę, pipetując w górę i w dół 10 razy, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Powinno dojść do zawieszenia małych skupisk. Jeśli pozostały jeszcze duże części warstwy, powtórz krok 2.8.4 jeszcze dwa razy.
   5. Dodać 20 ml PBS i wirować przez 10 minut przy 300 x g.
   6. Ostrożnie zassać PBS.
      UWAGA: Jeśli mają zostać wygenerowane iSAB, przejdź do kroku 2.8.7. Jeśli mają zostać wygenerowane pojedyncze komórki węzłowe zatok pochodzące z iSAB, przejdź do kroku 2.9.
   7. Zawiesić komórki w 12 ml pożywki różnicującej zawierającej 400 μg/ml G418 i wysiać je w 6 dołkach pokrytych żelatyną w 24 dołkach (2 ml / studzienkę).
9. Generowanie pojedynczej komórki węzłowej.
   1. Zawiesić komórki z etapu 2.8.6 w 5 ml Accutazy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   2. Energicznie wymieszać zawiesinę, pipetując w górę i w dół 10 razy, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   3. Dodać 20 ml PBS i wirować przez 5 minut przy 300 x g.
   4. Zawiesić komórki w 12 ml pożywki różnicującej zawierającej 400 μg/ml G418 i wysiać je w 6 dołkach 24 dołków pokrytych żelatyną (2 ml/dołek).
10. Dzień 2 po dysocjacji odessać pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki PBS. Dodać 1 ml pożywki/dołka różnicującego.
11. Dzień 4-8 po dysocjacji zmieniaj pożywkę co 2 dni. W 10 dniu po dysocjacji dostępne są pojedyncze komórki węzłowe zatok iSAB lub pochodzące z iSAB do dalszej analizy.

Wyniki

Opisany protokół pozwala na generowanie iSAB o częstotliwości dudnienia około 450 uderzeń na minutę z PSC (pokazanych na filmie), co jest zbliżone do częstotliwości bicia serca myszy. Po dysocjacji iSAB (krok 2.8.8) obserwowane pojedyncze komórki wykazują typowy kształt komórek węzła zatokowego (wrzeciona i pająka), jak pokazano na rysunku 1. Komórki te wykazują wysoką ekspresję białek, o których wiadomo, że są niezbędne do funkcjonowania węzła zatokowego, takich jak aktywowany hiperpolaryzacją cykliczny...

Dyskusja

Zdolność do wytwarzania komórek rozrusznika serca pochodzących z komórek macierzystych może pozwolić na odtworzenie prawidłowego rytmu serca w sensie "biologicznych rozruszników serca". Podobnie testowanie narkotyków in vitro skorzysta na ich dostępności. PSC mogą dać początek każdemu typowi komórek w ciele ssaka, w tym kardiomiocytom o właściwościach komórek rozrusznika^{serca 8,9,10,11,12,13}. Jednak zazwyczaj populacje komórek w "ciałach zarodkowych" są wysoce niejednorodne, co nieuchronnie prowadzi do wymogu ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płynna pożywka Iscove ze stabilną glutaminą	Biochrom AG	FG 0465
Pożywka płynna DMEM bez na-pirogronianu, ze stabilną glutaminą	Biochrom AG	FG 0435
CLS typ IV, CLS IV	Biochrom AG	C4-22
Aminokwasy endogenne	Biochrom AG	K 0293
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
Pirogronian sodu (100 mM)	Biochrom AG	L 0473
G 418-BC płyn (roztwór gotowy do użycia), sterylny	Biochrom AG	A 2912
Zbiornik na odczynnik PP f. wielokanałowa pipe. 60ml, sterylny	Marka	703409
Accutase	eBioscience,Inc.	00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, pipeta elektroniczna	Eppendorf	4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µ m	Falcon	352340
Penicylina/Streptomycyna	GE Healthcare	P11-010
Szalki Petriego	Greiner BioOne	663102
DPBS bez Ca i Mg	PAN-Biotech	P04-36500
Surowica bydlęca	płodu PAN-Biotech	P30-3302
Czynnik hamujący białaczkę	Phoenix Europe GmbH	LIF-250
Kwadratowe szalki Petriego	Roth	PX67.1
Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnych	SigmaAldrich	G7765
2-Merkaptoetanol	SigmaAldrich	M3148
1-Tioglycerol	SigmaAldrich	M6145
Naczynia do hodowli tkankowych	TPP	93100
Kolba do hodowli tkankowych	TPP	90076
Płytki do badania kultur tkankowych (24 dołki)	TPP	92424