Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

17K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52469

⸱

2 lutego 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Department of Clinical Laboratory, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 4Department of Biochemistry, Nihon University School of Dentistry, 5Department of Biochemistry, Ohu University School of Pharmaceutical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Streszczenie

Progresja raka (inicjacja, wzrost, inwazja i przerzuty) następuje poprzez interakcje między złośliwymi komórkami a otaczającymi je komórkami zrębu. Mikrośrodowisko guza składa się z różnych typów komórek, takich jak fibroblasty, komórki odpornościowe, komórki śródbłonka naczyń krwionośnych, perycyty i komórki pochodzące ze szpiku kostnego, osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Fibroblasty związane z rakiem (CAF) pełnią rolę pronowotworową poprzez wydzielanie rozpuszczalnych czynników, angiogenezę i przebudowę ECM. Eksperymentalne modele przeżycia, proliferacji, migracji i inwazji komórek nowotworowych opierały się głównie na dwuwymiarowych monokomórkowych i jednowarstwowych kulturach tkankowych lub testach w komorze Boydena. Jednak eksperymenty te nie odzwierciedlają dokładnie fizjologicznych lub patologicznych warunków w chorym narządzie. Aby lepiej zrozumieć interakcje zrębu guza lub macierzy nowotworowej, hodowle wielokomórkowe i trójwymiarowe zapewniają potężniejsze narzędzia do badania komunikacji międzykomórkowej i zależnej od ECM modulacji zachowania komórek nowotworowych. Jako platformę do tego typu badań prezentujemy model eksperymentalny, w którym komórki nowotworowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w pierwotnych kulturach CAF.

Wprowadzenie

Tkanka nowotworowa może być postrzegana jako rodzaj narządu, który ewoluuje poprzez bliskie interakcje między rakiem a mikrośrodowiskiem zrębu guza, składającym się z fibroblastów związanych z rakiem (CAF), komórek odpornościowych, naczyń nowotworowych i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). CAF są głównym źródłem rozpuszczalnych czynników (cytokin, czynników wzrostu i chemokin), które wywierają działanie mitogenne, promigracyjne i proinwazyjne na komórki nowotworowe. Stymulują również tworzenie naczyń nowotworowych i rekrutują komórki prekursorowe, takie jak komórki pochodzące ze szpiku kostnego (BMDC). Aktywowane CAF biorą udział w produkcji i przebudowie ECM, sprzyjając w ten sposób wzrostowi i rozprzestrzenianiu się komórek rakowych1. CAF zapewniają również niszę, która ułatwia kolonizację komórek nowotworowych i przerzuty oraz są zdolne do nadawania fenotypów komórek macierzystych sąsiednim komórkom rakowym. Obserwacje patologiczne sugerują, że reakcje zrębowe lub zmiany zwłóknieniowe w tkankach nowotworowych wskazują na złe rokowanie. Ostatnie badania wykazały również, że cechy zrębu guza, takie jak sygnatura genowa, mogą przewidywać rokowanie pacjenta. Co więcej, czynniki pochodzące z CAF mogą modulować wrażliwość na chemioterapię, podkreślając rolę CAF w określaniu wrażliwości i oporności na leki2.

Ponieważ CAF odgrywają wieloaspektową rolę w promowaniu progresji nowotworu poprzez szlaki sygnałowe, które pośredniczą w interakcjach między CAF a różnymi typami komórek w mikrośrodowisku guza, przyciągają coraz większą uwagę jako nowe cele terapii przeciwnowotworowych. Niejednorodność populacji komórek w mikrośrodowisku nowotworowym stanowi przeszkodę w celowaniu w CAF. Zaproponowano kilka markerów CAF, takich jak aktyna α mięśni gładkich (α-SMA), białko aktywujące fibroblasty (FAP) i proten-1 specyficzny dla fibroblastów (FSP-1: zwany również S100A4); jednak te markery molekularne nie są specyficzne dla odróżnienia CAF od innych komórek obecnych w tkankach nienowotworowych3. Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby uzyskać więcej wiedzy na temat specyficznych właściwości CAF. W tym celu warto scharakteryzować pierwotne hodowane CAF w porównaniu z normalnymi fibroblastami dopasowanymi do pacjenta.

Ostatnio, analizy CAF pochodzące od pacjentów zostały zgłoszone w kilku typach raka, ujawniając unikalne wzorce ekspresji genów i zachowania komórek w porównaniu z fibroblastami pochodzącymi z tkanek nienowotworowych. Wykorzystując wyizolowane CAF z tkanek ludzkiego raka płuc, opracowaliśmy trójwymiarową metodę współhodowli, która umożliwiła nam ocenę właściwości CAF płuc. W tym modelu zbadaliśmy wpływ CAF na inwazję komórek raka płuc, proliferację i skurcz żelu kolagenowego, co eksperymentalnie podsumowało rolę CAFpłuc 4 w promowaniu nowotworu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: To badanie zostało zatwierdzone przez odpowiednie Komisje Bioetyczne.

1. Pierwotna hodowla ludzkich fibroblastów płuc

  1. Pobieranie tkanki płucnej:
    1. Próbki ludzkiej tkanki płucnej należy pobierać bezpośrednio z sali operacyjnej. Zbierz około 1 cm3 bloki z rakowej i nienowotworowej tkanki płucnej, przy czym próbka nienowotworowa jest pobierana jak najdalej od guza.
    2. Zawiesić próbki w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej o 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B (pożywka wolna od surowicy). Zawieszone próbki należy przechowywać w sterylnych probówkach o pojemności 50 ml i przenieść do laboratorium.
      UWAGA: Fibroblasty są silnie migrujące i proliferacyjne w porównaniu z innymi typami komórek, takimi jak komórki nabłonka, śródbłonka i mięśni gładkich. Metoda wzrostu wykorzystuje te cechy fibroblastów, a wyrastające komórki z wycinków tkanek są obfite w fibroblasty. Po kilku pasażach komórkowych inne typy komórek nie przeżywają i nie rozmnażają się w DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), co skutkuje oczyszczonymi hodowlami komórek fibroblastów. Komórki można wykorzystać przez 3-7 pasaży po hodowli pierwotnej.
  2. Hodowla eksplantatów i kondycjonowanie w celu wzrostu komórek:
    1. Wykonaj pierwotną hodowlę fibroblastów przy użyciu wcześniej opisanego protokołu z modyfikacjami5.
    2. W laboratorium umieść próbkę tkanki na 10 cm naczyniu do hodowli tkankowych bez pożywki hodowlanej i pokrój na małe sekcje o wielkości ~2-3 mm za pomocą sterylnych kleszczyków i skalpela. Podczas tego procesu należy unikać wysuszania sekcji, w przeciwnym razie wydajność wzrostu komórek jest osłabiona.
  3. Oddzielenie warstwy komórek nabłonka i tkanki łącznej:
    1. Namoczyć pocięte skrawki tkanek w pożywce zawierającej 2 000 PU/ml dypazy I i hodować przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
    2. Przenieś skrawki tkanki do naczynia i oddziel warstwę komórek nabłonka od sąsiedniej tkanki łącznej. Przetwarzaj sekcje w czystym stole, aby uniknąć zanieczyszczenia mikroorganizmami.
      UWAGA: Jeśli potrzebna jest podstawowa hodowla komórek nabłonkowych, wykonaj krok 1.3. Jeśli mają być wyizolowane tylko fibroblasty, pomiń krok 1.3, ponieważ późniejsza hodowla eksplantatów i pasaże komórkowe są niekorzystne dla komórek nabłonkowych, które dają oczyszczone populacje fibroblastów.
  4. Mocowanie skrawków tkanki:
    1. Zmiel tkanki na kawałki o średnicy 1 mm za pomocą dwóch skalpeli. Jeśli kawałki nie są wystarczająco małe, łatwiej odrywają się od naczynia, a komórki nie wyrosną na powierzchni naczynia.
    2. Umieść małe odcinki tkanki płucnej oddzielnie od siebie, aby zachować pusty obszar otaczający każdy element. Wykonaj rysy na powierzchni naczynia do hodowli tkankowej za pomocą ostrza skalpela, aby ułatwić mocowanie skrawków tkanki.
      UWAGA: Wydaje się również, że drapanie ułatwia wzrost komórek, zapewniając ścieżki, wzdłuż których komórki mogą migrować.
      1. Alternatywnie, umieść kawałki tkanki mielonej pojedynczo w każdym dołku płytki 6-dołkowej i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Przymocuj szkiełko nakrywkowe do powierzchni płyty za pomocą smaru silikonowego.
      2. Umieść smar silikonowy w dwóch punktach oddalonych od siebie o 1,5 cm w każdym dołku za pomocą sterylnej szpilki. Pokrycie fragmentów tkanek zwiększa skuteczność wzrostu komórek i rozmnażania komórek po kilku pasażach.
  5. Późniejsza hodowla eksplantatów:
    1. Delikatnie dodaj pożywkę hodowlaną do naczynia, zanim skrawki tkanki wyschną, ponieważ w większości przypadków wydajny wzrost komórek jest tracony, jeśli próbki wyschną. Nie nalewaj pożywki zbyt szybko, ponieważ skrawki tkanki mogą się oderwać.
    2. Komórki hodowlane w DMEM z 10% FBS. Użyj wystarczającej ilości podłoża, aby tylko przykryć tkankę, ale nie za dużo, aby pozwalało na unoszenie się na wodzie, ponieważ dodatkowa wyporność sprzyja oderwaniu się od naczynia.
  6. Pasaż komórkowy:
    1. Z pożywką hodowlaną należy obchodzić się przez cały czas ostrożnie, ponieważ powtarzające się ruchy szalki hodowlanej mogą prowadzić do oderwania skrawków tkanki.
    2. Umieścić szalki hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5-7 dni. Odświeżaj pożywkę co drugi dzień i minimalnie obchodź się z naczyniami hodowlanymi podczas zmian pożywki. Fibroblasty wyrastają z krawędzi skrawków tkanek w ciągu następnych kilku tygodni.
      UWAGA: Po ~2-3 tygodniach wyrastające fibroblasty prawie osiągają konfluencję, w zależności od wielkości powierzchni.
    3. Umyj komórki 1x PBS i dodaj 1 ml trypsyny I do płytki.
    4. Po trypsynizacji odłącz komórki za pomocą 9 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS. Zebrać komórki zawieszone w pożywce w probówce o pojemności 10 ml razem z wycinkami tkanki. Po odwirowaniu w celu utworzenia granulek komórkowych, powstałe granulki należy ponownie zawiesić w nowym podłożu.
    5. Wysiewaj komórki i skrawki tkanek na nowej szalce hodowlanej, w którym to momencie tkanki nie przyczepiają się do szalki, podczas gdy komórki przylegają i rosną. Następnego dnia usuń pływające kawałki tkanki przez aspirację i zmień podłoże. Przyłączone fibroblasty rozmnażają się wraz z kolejnymi kulturami.

2. Trójwymiarowa kokultura ludzkich fibroblastów płuc i komórek rakowych

  1. Przygotowanie komórek i odczynników:
    1. W przybliżeniu użyj 2 x 105 komórek nabłonka i 2,5 x 105 fibroblastów na studzienkę. Przygotuj kolagen typu IA (3 mg/ml, pH 3), FBS (100%), bufor do rozpuszczenia (50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES), 5x DMEM, DMEM uzupełniony 10% FBS do hodowli fibroblastów oraz pożywkę do kohodowli 3D (mieszanina 1:1 pożywki hodowlanej fibroblastów i pożywki hodowlanej dla komórek rakowych).
    2. Hodowla komórek gruczolakoraka płuc A549, fibroblastów i kohodowli A549 3D w DMEM uzupełnionej 10% FBS.
  2. Tworzenie żelu kolagenowego:
    1. Umyj fibroblasty wyhodowane na 10 cm naczyniu 1x PBS i dodaj 1 ml trypsyny I do płytki. Po trypsynizacji przez ~5 min w temperaturze 37 °C, odłącz komórki za pomocą 9 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS. Zebrać komórki zawieszone w pożywce w probówce o pojemności 10 ml i odwirować je przy 200-300 x g, aby utworzyć granulki komórek.
    2. Ponownie zawiesić powstałe granulki w 100% FBS o gęstości 5 x 105/ml.
    3. Przygotuj żel kolagenowy na lodzie. Schłodzić odczynniki, pipety i probówki w lodówce przed wykonaniem następnej procedury. Nawet na lodzie mieszanina zestala się do pewnego stopnia, a całkowita objętość jest mniejsza niż suma wszystkich składników.
    4. W każdym dołku przygotuj żel kolagenowy, mieszając 0,5 ml zawiesiny fibroblastów (2,5 x 105 komórek) z FBS, 2,3 ml kolagenu typu IA, 670 μl 5x DMEM i 330 μl buforu do rekonstytucji. Pozwól żelom łatwo stwardnieć w temperaturze pokojowej.
      1. Energicznie pipetować, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas pipetowania.
    5. Dodać mieszaninę (3 ml) do każdego dołka na płytce 6-dołkowej i pozostawić do żelowania w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez zakłóceń przez 30-60 minut.
  3. Hodowla komórek rakowych na żelu kolagenowym:
    1. Wykonaj trójwymiarową kokulturę przy użyciu wcześniej zgłoszonego protokołu z modyfikacjami6.
    2. Ponownie zawiesić komórki rakowe w pożywce do kohodowli 3D (lub w DMEM z 10% FBS w przypadku komórek A549) o gęstości 1 x 105/ml.
    3. Wlać 2 ml roztworu zawieszonych komórek (2 x 105 komórek) na powierzchnię każdego żelu. Modyfikuj liczbę komórek rakowych lub fibroblastów w kokulturze w zależności od warunków eksperymentalnych.
  4. Skurcz żelu:
    1. Inkubuj żele przez noc w temperaturze 37 °C, aby komórki rakowe mogły przylegać do żelu kolagenowego. Odłącz każdy żel i wygeneruj "pływającą kulturę" w każdym dołku płytki 6-dołkowej.
      UWAGA: Stosując pływającą hodowlę, różne zmiany wielkości żelu są indukowane przez napięcie mechaniczne i degradację kolagenu, w których pośredniczy interakcja komórkowa między współhodowanymi komórkami rakowymi a fibroblastami.
    2. Użyj kątowej igły 21 G lub małej szpatułki, aby oddzielić każdy żel od krawędzi studzienki. Co 2-3 dni odświeżaj studzienki 2 ml pożywki do kohodowli 3D. Mierz rozmiar każdego żelu codziennie przez 5 dni.
  5. Analiza żeli kolagenowych:
    1. Zmierz zawartość kolagenu w każdym żelu za pomocą metod oznaczania ilościowego kolagenu, takich jak test Sircol. Wykonaj analizę transkryptomiczną lub ilościowy RT-PCR po pobraniu RNA z żeli5.

3. Kultura interfejsu powietrze-ciecz i test inwazji

  1. Po wyhodowaniu żeli kolagenowych w temperaturze 37 °C przez 5 dni, należy wystawić zakontraktowane żele na działanie powietrza, umieszczając je na siatce (porów o wielkości 70 μm) w nowych płytkach 6-dołkowych. Wykonać siatkę z dostępnych w handlu filtrów komórkowych używanych do cytometrii przepływowej.
  2. Delikatnie napełnij każdą studzienkę 11 ml pożywki do kohodowli 3D.
  3. Umieść żele na siatce za pomocą sterylnej łyżki i usuń pozostałe podłoże z żeli. Pod tym warunkiem zanurz żele w podłożu, wystawiając górną powierzchnię żelu na działanie powietrza. Zdefiniuj ten warunek hodowli jako interfejs powietrze-ciecz.
    UWAGA: Po 5-7 dniach utrzymywania kultury na granicy faz powietrze-ciecz w temperaturze 37 °C w inkubatorze, inwazyjne komórki nowotworowe migrują do żelu. W zależności od typu komórki i w wyniku interakcji komórkowych, różne stopnie zmian morfologicznych w komórkach nowotworowych są indukowane przez hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz.
  4. W celu oceny histologicznej utrwal żel w roztworze formaliny przez noc w temperaturze pokojowej i zanurz w parafinie. Wybarwić pionowe odcinki (4 μm) hematoksyliną i eozyną (H&E). Przeprowadzić analizę immunohistochemiczną na sekcjach4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ta metoda kokultury, naśladująca mikrośrodowisko guza, jest użytecznym narzędziem do badania oddziaływań między komórkami nowotworowymi a fibroblastami osadzonymi w żelach kolagenowych. W poprzednim badaniu w tym modelu eksperymentalnym oceniono trzy parametry: kurczliwość żelu kolagenowego, inwazję komórek nowotworowych oraz zmiany morfologiczne. Proliferację komórek nowotworowych oszacowano również za pomocą immunobarwienia Ki674. Próbki tkanki płucnej pobrano z obszarów nowotworowych i nienowotworowych wyci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

CAF stanowią główny składnik ECM otaczającego komórki rakowe i nie tylko stanowią rusztowanie dla guza, ale także aktywnie uczestniczą w rozwoju guza7. Gromadzenie dowodów ujawnia wpływ CAF lub powiązanych z nimi cząsteczek na ostateczne rokowanie, podkreślając krytyczną rolę progresji nowotworu za pośrednictwem CAF8.

W poprzednim badaniu zastosowaliśmy metodę wzrostu do wyizolowania CAF4 w płucach. W tym eksperymencie kluczowe znaczenie ma utrzymanie adhezji w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 i 25460137).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMSigma-AldrichD5796
FBSGIBCO10437
Kolagen typu IANitta gelatin Inc.CELL-1A
Bufor do rozpuszczeniażelatyny Nitta Inc.
Szkiełko nakrywkoweNUNC174934
Smar silikonowyDow Corning ToraySmar
Dispase IWAKO386-02271
Płytka 6-dołkowaBD Falcon353046
Sitko do komórek (70 μ m)BD Falcon352350
wysokopróżniowy

Bibliografia

  1. Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).
  2. Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).
  3. Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62(2014).
  4. Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
  5. Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).
  6. Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).
  7. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
  8. Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
  9. Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).
  10. Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).
  11. Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5 (5), e10747(2010).
  12. Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).
  13. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
  14. Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).
  15. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla w elu kolagenowymfibroblasty zwi zane z nowotworemmikro rodowisko guzakom rki gruczolaka p ucainterfejs powietrze ciecztest inwazji kom rkowejmacierz zewn trzkom rkowaanaliza histologiczna

Powiązane artykuły