Artykuł metodologiczny

Izolacja, hodowla i długotrwałe utrzymanie pierwotnych śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych z embrionalnych mózgów gryzoni

DOI:

10.3791/52475

⸱

19 lutego 2015

 ,  ,  , 
1Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London, 2Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Internal Medicine, Endocrinology, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przyczyny degeneracji neuronów dopaminergicznych śródmózgowia podczas choroby Parkinsona nie są w pełni zrozumiałe. Systemy hodowli komórkowych stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neurofizjologicznych tych neuronów. Poniżej przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który może być wykorzystany do modelowania neurodegeneracji in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Degeneracja śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych (mesDA) jest patologicznym znakiem rozpoznawczym choroby Parkinsona. Badanie procesów biologicznych związanych z funkcjami fizjologicznymi oraz podatnością i śmiercią tych neuronów jest pomocne w zrozumieniu przyczyn leżących u podstaw i odkryciu lekarstwa na tę powszechną chorobę neurodegeneracyjną. Pierwotne hodowle neuronów mesDA dostarczają narzędzia do badania właściwości molekularnych, biochemicznych i elektrofizjologicznych, w celu zrozumienia rozwoju, długoterminowego przeżycia i degeneracji tych neuronów w przebiegu choroby. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę izolacji, hodowli i utrzymania neuronów dopaminergicznych śródmózgowia z zarodków myszy E12.5 (lub szczura E14.5). Zoptymalizowane warunki hodowli komórkowej w tym protokole skutkują obecnością wypustek aksonalnych i dendrytycznych, połączeń synaptycznych i innych właściwości morfologicznych neuronów, które sprawiają, że kultury nadają się do badania fizjologicznych, biologicznych i molekularnych cech komórkowych tej populacji neuronów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrata neuronów dopaminergicznych z istoty czarnej pars compacta prowadzi do głównych objawów motorycznych choroby Parkinsona (PD), drugiego najbardziej rozpowszechnionego zaburzenia neurodegeneracyjnego. Podstawowa przyczyna wyginięcia tej populacji neuronów śródmózgowia nie jest znana. Do zbadania szlaków biochemicznych odpowiedzialnych za rozwój i modulację właściwości neurofizjologicznych oraz przeżycie neuronów mesDA wykorzystano kilka hodowli komórkowych i systemów modeli zwierzęcych. Unieśmiertelnione linie komórkowe, w tym szczurza linia komórek dopaminergicznych 1RB3AN27 (N27), ludzka linia komórkowa nerwiaka dopaminergicznego SH-SY5Y, mysia dopaminergiczna hybrydowa linia komórkowa MN9D i ludzkie śródmózgowiowe komórki LUHMES zostały wykorzystane do badań biochemicznych i ograniczonych badań mechanistycznych 1-5. Do badania specyficznej utraty neuronów mesDA opracowano kilka modeli opartych na neurotoksynach i modelach genetycznych 6-8. Pierwotne hodowle brzusznej części śródmózgowia stanowią niezbędne narzędzie do badania właściwości neuronalnych i synaptycznych neuronów dopaminergicznych oraz szlaków zaangażowanych w patogenezę tego powszechnego zaburzenia.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji śródmózgowiowych neuronów dopaminergicznych, który zawiera modyfikacje skutkujące wyższą przeżywalnością i zwiększoną wydajnością szkiełek nakrywkowych na zarodek. Zastosowanie przedwcześnie opracowanego śródmózgowia myszy E12.5 (E14.5 u szczurów) zwiększa przeżywalność. W tym wieku neurony nie rozwinęły jeszcze aksonów, co pozostawia komórki nienaruszone podczas sekcji i minimalizuje stres, co znacznie zwiększa żywotność. Ponadto staranna sekcja brzusznej części śródmózgowia, opisana w sekcji 2 niniejszego protokołu, dodatkowo zwiększa przeżywalność. W celu zwiększenia liczby szkiełek nakrywkowych na zarodek przedstawiono alternatywną metodę posiewu w sekcji 4 niniejszego protokołu. Prowadzi to do uzyskania do 10 szkiełek nakrywkowych na zarodek w porównaniu z 4 szkiełkami nakrywkowymi w standardowych warunkach posiewu, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt w jednym doświadczeniu.

Neurony w kulturze wykazują wzrost aksonów i dentytów, tworzą połączenia synaptyczne i ujawniają obecność markerów neuronalnych i synaptycznych, co czyni te kultury odpowiednimi do obrazowania żywych komórek, badań immunocytochemicznych i elektrofizjologicznych. Co więcej, wykorzystanie kultur neuronalnych ułatwia manipulacje genetyczne i farmakologiczne. Przerost neurytów od 2 dnia in vitro pozwala na badania rozwojowe. Co więcej, długotrwałe przetrwanie kultur (do sześciu tygodni) sprawia, że nadają się one do badania powolnej, postępującej degeneracji tych neuronów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zwierzęta były utrzymywane i traktowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, a wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Imperial College's Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) oraz Home Office i Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), zgodnie z przepisami federalnymi i stanowymi.

1. Konfiguracja odczynnika i sprzętu

  1. Rozmrozić, podwielokrotność i przechowywać 1 mg/ml roztworu Lamininy w temperaturze –80 °C. Rozpuścić 2 μl w 1 ml DMEM/F12, otrzymując stężenie powłoki 1-2 μg/cm2,
    UWAGA: Laminin rozmrażamy powoli na lodzie i rozpuszczamy w zimnym DMEM/F12 i natychmiast dodajemy do płytek/szkiełek nakrywkowych.
  2. Rozcieńczyć 75 ml 0,01% poli-L-ornityny w 425 ml PBS i przechowywać w temperaturze 4 ºC.
    UWAGA: Okres trwałości roztworu roboczego wynosi do jednego miesiąca.
  3. Rozpuścić 25% (wag./obj.) BSA w PBS, pH 7,4 i przechowywać w temperaturze 4 ºC przez okres do roku.
  4. Przygotuj 50% nośnik dezaktywacyjny FBS (w HBSS).
  5. Przygotować kompletną pożywkę, dodając 50 U/ml penicyliny i streptomycyny, 1x suplement N2, 5% (obj./obj.) FBS, 0,36% D-(+)-glukozy (wt/obj.), 0,25% BSA (wt/obj.) do DMEM/F12 i przechowywać w temperaturze 4 ºC.
    UWAGA: Okres przydatności do spożycia wynosi do 10 dni.
  6. Umieść szkiełka nakrywkowe we wrzącym 70% (obj./obj.) etanolu na co najmniej 30 minut, aby usunąć wszelkie ślady tłuszczu i autoklawu.
  7. Umieść szkiełka nakrywkowe na płytkach 24-dołkowych i dodaj 500 μl roztworu poli-L-ornityny do każdej studzienki. Inkubować przez 1 godzinę pod okapem do hodowli tkankowych w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3 razy 500 μl wody. Dodać 500 μl roztworu lamininy do każdej płytki i inkubować O/N w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Chociaż po leczeniu lamininą nie jest konieczne płukanie, mycie poli-L-ornityny mniej niż trzy razy powoduje śmierć komórek 24 godziny po hodowli.
  8. Wypoleruj końcówki szklanych pipet nad gazem ziemnym lub płomieniem palnika.
    UWAGA: Po tym kroku średnica końcówki powinna być około połowy jej normalnego rozmiaru.
  9. Odetnij nakrętki probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą autoklawowanych nożyczek i autoklawu.

2. Rozwarstwienie embrionalnej brzusznej części śródmózgowia

  1. Narkotyzować matki w ciąży w czasie (E12,5) przez wdychanie CO2 , a następnie poddać eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Spryskaj brzuch 70% etanolem i wykonaj nacięcie brzucha, aż wszystkie worki maciczne zostaną odsłonięte. Za pomocą kleszczy odetnij przyczep pochwy i usuń macicę. Umieść macicę w lodowatym HBSS, na 100-milimetrowej szalce Petriego.
  3. Usuń zarodki z macicy i worka owodniowego za pomocą kleszczy (ryc. 1C). Umieść zarodki w świeżym, lodowatym HBSS.
    UWAGA: Prostokąt na rysunku 1D wskazuje lokalizację embrionalnej brzusznej części śródmózgowia.
  4. Umieść zarodki pod mikroskopem preparacyjnym (10-krotne powiększenie) i wypreparuj łuk śródmózgowia, przecinając mózg na przesmyku i obszarze granicznym śródmózgowia i międzymózgowia, używając bionożyczek i kleszczy (Ryc. 1E, patrz Rycina 1A, aby zapoznać się z liniami nacięcia).
  5. Po usunięciu całego śródmózgowia wykonaj nacięcie w śródmózgowiu przyśrodkowym (ryc. 1F).
  6. Usuń opony mózgowe za pomocą dwóch kleszczy (Rysunek 1H).
    UWAGA: KROK KRYTYCZNY: Ten krok jest niezbędny dla optymalnej wydajności neuronów i przeżycia. Ponieważ warunki hodowli są optymalne dla komórek mózgowych, większość komórek z otaczającej tkanki obumiera po posiewaniu, a sygnał apoptotyczny z tej tkanki może uszkodzić integralność kultur.
  7. Spłaszcz tkankę śródmózgowia na szalce Petriego, aby obserwować kształt motyla i odetnij około połowy każdego skrzydła, używając wysterylizowanego ostrza do golenia (Rysunek 1H,I).
    UWAGA: Rycina 1J przedstawia izolowaną brzuszną część śródmózgowia.
  8. Przenieś fragment brzusznej części śródmózgowia do lodowatego HBSS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i kontynuuj z następnym zarodkiem.
    UWAGA: Kroki 2.1-2.8 nie powinny zająć więcej niż 1 godzinę. Trzymanie zarodków na lodzie dłużej niż ten czas znacznie zmniejsza żywotność komórek.

3. Dysocjacja komórek brzusznego śródmózgowia

  1. Przenieś kawałki brzusznej śródmózgowia pod kaptur z przepływem laminarnym. Usunąć HBSS i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej (37 ºC) 0,05% trypsyny-EDTA do stożkowej probówki (objętość wystarczająca na maksymalnie 12 kawałków brzusznej śródmózgowia). Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
  2. Usuń trypsynę-EDTA pod maską i dodaj 1 ml pożywki dezaktywującej (surowica dezaktywuje trypsynę) do tkanki.
  3. Usunąć pożywkę dezaktywującą i dwukrotnie umyć chusteczkę w 1 ml kompletnego podłoża.
    UWAGA: Należy unikać wyjmowania całego podłoża z probówki i pipetowania tkanki, aby zapobiec wyrzuceniu zdysocjowanych komórek.
  4. Dodać 1 ml kompletnej pożywki i rozetrzeć tkankę za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo. Unikać tworzenia się pęcherzyków i kontynuować rozcieranie, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.
    UWAGA: Zwykle do całkowitej dysocjacji wymagane jest 8-10 przejść przez ograniczoną końcówkę.
  5. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć pożywkę.
  6. Ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnego podłoża, powoli pipetując w górę i w dół do czterech razy.

4. Poszycie komórek brzusznego śródmózgowia

  1. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 90 μl roztworu błękitu trypanowego i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Na tym etapie można również sprawdzić żywotność komórek.
  2. Umieść wysterylizowane nakrętki probówek do mikrowirówek na szalkach Petriego o średnicy 100 mm i przenieś szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-ornityną/laminą, używając kleszczyków, pojedynczo na wierzch nakrętek.
    UWAGA: Nie myj szkiełek nakrywkowych i unikaj suszenia lamininy, ponieważ może to spowodować nierówne hodowle i zmniejszenie przeżywalności komórek.
  3. Dostosuj objętość do 1 500 komórek na 1 μl, dodając kompletną pożywkę i dodaj 100 μl (łącznie 150 000 komórek) zawiesiny komórek na wierzch każdego szkiełka nakrywkowego (objętość jest optymalna, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego bez rozlewania). Zamknąć szalki Petriego i inkubować je przez 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ).
    UWAGA: ETAP KRYTYCZNY: Ten etap jest wymagany w celu poprawy przyczepności i żywotności komórek oraz zwiększenia liczby szkiełek nakrywkowych na zarodek. Alternatywnie, komórki można przenieść bezpośrednio do studzienek (zawierających szkiełka nakrywkowe), ale liczba komórek powinna zostać zwiększona do 350 000 na studzienkę (zamiast 150 000). Innymi słowy, przy użyciu tej metody można uzyskać 8-10 szkiełek nakrywkowych, podczas gdy transfer bezpośredni daje około 3-4 szkiełka nakrywkowe ze względu na komórki, które przyczepiają się do płytek (obok lub pod szkiełkami nakrywkowymi). Średnia żywotność kultur przy użyciu tej metody wynosiła około 90%.

5. Rozwój i utrzymanie kultury

  1. Po 1 godzinie inkubacji ostrożnie przenieść szkiełka nakrywkowe wraz z pożywką na płytki 24-dołkowe, zawierające 400 μl wstępnie podgrzanej (do 37 °C) kompletnej pożywki (całkowita objętość: 500 μl). Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C.
  2. W ciągu 24 godzin po inkubacji studzienek delikatnie dodać 500 μl kompletnej pożywki do każdej studzienki.
    UWAGA: Pierwsze kilka godzin jest najbardziej krytycznym etapem dla przeżycia neuronów dopaminergicznych, a liczba komórek, które przeżyły, nie zmienia się znacząco poza tym punktem.
  3. Nie dodawaj dodatkowych pożywek do kultur przez pierwsze dwa tygodnie lub do momentu, gdy podłoże stanie się żółte. Jeśli hodowla trwa dłużej niż dwa tygodnie lub kolor podłoża zmienia się na żółty, należy wymienić połowę pożywki (500 μl) na świeżą, kompletną, wstępnie ogrzaną pożywkę (zwykle co dwa tygodnie).
    UWAGA: Neurony dopaminergiczne w kulturach przetrwałyby w tych warunkach dłużej niż 6 tygodni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunohistochemia przeciwko tyrozynohydroksylazie (Th) wykazuje, że od 0,5-1% komórek w hodowli ma charakter dopaminergiczny. Projekcje neuronalne pojawiają się w ciągu 2 hr po wysianiu, a do pierwszego dnia aksony i dendryty są rozróżnialne (Rycina 2) przy użyciu przeciwciał przeciwko tyrozynohydroksylazie (TH) i białku Map2 (Microtubule-Associated Protein 2) (Rycina 3). Neurony przeżywają ponad sześć tygodni i wykazują rozległy wzrost wypustek. Stosunek neuronów do gleju w hodowlach je...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony dopaminergiczne w śródmózgowiu są głównym źródłem dopaminy w ośrodkowym układzie nerwowym. Są one podzielone na trzy grupy: istota pars compacta (SNpc), brzuszna powierzchnia nakrywki (VTA) i pole zaskrobowe (RRF) 10,11. Neurony w SNpc i VTA dają początek głównym szlakom dopaminergicznym, mezokortykalnym, mezolimbicznym i nigro-prążkowiowym, zaangażowanym w funkcje takie jak kontrola emocji, motywacja i zachowanie motoryczne. Upadek neuronów w SNpc i funkcjonalne zaburzenie układu nigrostria...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wykonana przy użyciu funduszy startowych Wydziału Nauk o Mózgu, Wydziału Medycyny, Imperial College London dla K.N.A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zmodyfikowana mieszanka składników odżywczych Eagle firmy Dulbecco F-12Invitrogen11330
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) (1X), płynInvitrogen24020-117
Surowica bydlęca, inaktywowana termicznie (FBS)Suplement Invitrogen16140
N2 (100X), płynInvitrogen17502-048
D-(+)-Glukoza roztwór (45% (wag./obj.) w wodzieSigmaG8769
Albumina surowicy bydlęcej BSASigmaA9430
Laminina z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-SwarmSigmaL2020
Penicylina/streptomycynaInvitrogen15070
Trypsyna (0,05% (wag./vol)Invitrogen25300
Surowica bydlęca albumina (BSA) badana hodowla komórkowaSigma A9418
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaP3813
Przeciwciało przeciwko hydroksylazie (Th) anty-tyrozynyPel-Freez BiologicalsP60101-0 
Poli-L-ornityna, roztwór 0,01% SigmaP4957
Przeciwciało anty-Map2 (białko związane z mikrotubulami-2A i -2B)Przeciwciało MilliporeMAB3418
Przeciwciało anty-synapsyny-1MilliporeAB1543P
Alexa Fluor 488 osioł anty-królik IgG    przeciwciałoSondy molekularneA-21206
Alexa Fluor 594 osioł anty-królik IgG    przeciwciałoSondy molekularneA-21207
Alexa Fluor 488 osł anty-owca IgG    przeciwciałoSondy molekularneA-11015
Alexa Fluor 594 osioł anty-owce IgG    przeciwciałoSondy molekularneA-11016
Alexa Fluor 594 osioł anty-mysie IgG    przeciwciało Sondy molekularneA-21203
Roztwór błękitu trypanowego (0,4% (wag./vol))Biowhittaker17-942E
Carl ZeissStemi 2000-C
Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazamiCarl ZeissAxiovert 40 C
Kleszcze DumontFine Scientific ToolsMay-45
Kleszczyki do szkiełek nakrywkowych – DumoxelFine Scientific Tools11251-33
Dwa kleszcze Dumont # 45 – DumoxelFine Scientific Tools11245-30
Uchwyt ostrza / młot Płaski uchwyt - 11 cmFine Scientific Tools10052-11
Nożyczki do irysów dla studentów - proste 11,5 cmFine Scientific Tools91460-11
Światłowodowy oświetlacz halogenowyNikonMKII
Jednorazowe pipety Pasteura ze szkła borokrzemianowegoFisherbrand13-678-20C
HemocytometrProscitechSVZ2NIOU
0,2 i mikro; m sterylne jednostki filtracyjneNalgeneNL-CE-156-4020
100x20 mm szalki PetriegoBD Biosciences351005
Okrągłe szkiełko nakrywkowe #1 Grubość Szkło niemieckie 12 mmBellco Glass1943-10012 
Mikroskop stereoskopowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
  2. Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
  3. Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
  4. Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11(2009).
  5. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
  6. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
  7. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
  8. Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
  9. Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
  10. Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
  11. Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27(2014).
  12. Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
  13. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
  16. Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
  17. Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pierwotna hodowla neuron wsekcja brzusznej cz ci r dm zgowiadysocjacja tkankimikroskopia immunofluorescencyjnabarwienie na hydroksylaz tyrozynowtest ywotno ci kom rekprzygotowanie szkie ek nakrywekpowlekanie laminind ugoterminowe utrzymanie neuron w

Powiązane artykuły