Artykuł metodologiczny

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

DOI:

10.3791/52476

⸱

27 lutego 2015

 ,  ,  , 
1Centre d'Immunologie et des Maladies Infectieuses (CIMI), INSERM, U1135, CNRS, ERL 8255, Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CR7

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie wielofotonowe w czasie rzeczywistym stanowi doskonałą okazję do badania transportu komórkowego i interakcji między komórkami w ich fizjologicznym 3-wymiarowym środowisku. Aktywność biologiczna komórek odpornościowych zależy głównie od ich zdolności do ruchliwości. Monocyty krwi mają krótki okres półtrwania w krwiobiegu; Pochodzą one ze szpiku kostnego i są z niego konstytutywnie uwalniane. W stanie zapalnym proces ten ulega nasileniu, co prowadzi do monocytozy krwi, a następnie naciekania obwodowych tkanek zapalnych. Identyfikacja zdarzeń biomechanicznych kontrolujących transport monocytów ze szpiku kostnego w kierunku sieci naczyniowej jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia znaczenia fizjopatologicznego monocytów. Przeprowadziliśmy obrazowanie poklatkowe in vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej szpiku kostnego czaszki myszy Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). Mysz MacBlue ulega ekspresji fluorescencyjnego białka cyjanowego wzmocnionego reporterami (ECFP) pod kontrolą swoistego dla szpiku promotora 1, w połączeniu ze znakowaniem sieci naczyniowej. Opisujemy, w jaki sposób to podejście umożliwia śledzenie poszczególnych monocytów rdzeniowych w czasie rzeczywistym w celu dalszego ilościowego określenia zachowań migracyjnych w obrębie miąższu szpiku kostnego i naczyń krwionośnych, a także interakcji międzykomórkowych. Podejście to dostarcza nowych informacji na temat biologii podzbiorów monocytów szpiku kostnego i pozwala na dokładniejsze zbadanie, w jaki sposób można wpływać na te komórki w określonych stanach patologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szpik kostny odgrywa centralną rolę w hematopoezie i stanowi główny rezerwuar monocytów, które konstytutywnie recyrkulują między krwią a miąższem rdzeniowym, odnawiają pulę krążących monocytów o krótkiej żywotności 2,3 i uczestniczą w odtwarzaniu makrofagów tkankowych i komórek dendrytycznych w stanie stacjonarnym 4. Podczas zapalenia lub po przemijającej aplazji monocyty są aktywnie mobilizowane ze szpiku kostnego lub śledziony 5, 6, 7 i kolonizują narządy objęte stanem zapalnym. W proces mobilizacji komórek szpikowych ze szpiku kostnego zaangażowanych jest kilka osi chemoatraktantu 8, 5, 6,9. Poza przedziałem szpikowym szpik kostny jest również ważnym miejscem pobudzania limfocytów T 10 i niszą pamięci immunologicznej 11,12. W związku z tym tkanka ta ma kluczowe znaczenie dla licznych badań w dziedzinie hematologii i immunologii. Nasza wiedza na temat organizacji strukturalnej komórek szpiku rdzenia wynika głównie z analizy przekroju histologicznego tkanek utrwalonych 13. Ten statyczny widok nie pozwala na badanie dynamiki wymiany komórkowej między różnymi przedziałami szpiku kostnego, która jest podstawą jego aktywności funkcjonalnej.

Obrazowanie przyżyciowe stanowi ważny wkład biologiczny w badania mobilności komórek, adherencji komórek i interakcji między komórkami, które wcześniej były opisywane tylko z systemów in vitro. Wyzwania techniczne związane z prawidłowym obrazowaniem przyżyciowym obejmują zdolność dotarcia do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania z optycznego punktu widzenia oraz jej maksymalizację izolacji od dryftów fizjologicznych (oddech, skurcze mięśni lub perystaltyczne) lub mechanicznych (rozerwanie i wydłużenie tkanki po operacji oraz wystawienie na działanie obiektywu mikroskopu, a także zaburzenia temperatury i naczyń krwionośnych/natlenienia). Mikroskopijne dryfty mogą ograniczać zdolność do utrzymywania ostrości przez długi czas i mogą wprowadzać artefakty w kwantyfikacji ruchliwości komórek. Jedną z alternatyw, zwalidowaną dla kilku tkanek w celu zmniejszenia tych trudności technicznych, jest praca na eksplantowanej tkance inkubowanej w termostatowanym i natlenionym podłożu; Jednak całkowite zaburzenie krążenia limfatycznego i naczyniowego może być problematyczne. Obrazowanie przyżyciowe szpiku kostnego czaszki ma kilka zalet związanych z tymi kwestiami. Po pierwsze, wymaga minimalnego działania chirurgicznego. Po drugie, grubość kości w tym obszarze umożliwia bezpośrednią wizualizację nisz szpiku kostnego bez ścierania, zmniejszając w ten sposób zaburzenia fizjologiczne. Sieć rdzeniową można zobrazować w okolicy przystrzałkowej kości; Jednak sinusoidy są bardziej widoczne w okolicy czołowo-ciemieniowej, gdzie macierz kostna jest cieńsza 12,14.

Obrazowanie przyżyciowe opiera się na dostępności najdokładniejszego fluorescencyjnego reportera oznaczającego badaną populację. Znakowanie in vitro oczyszczonej populacji komórek przed transferem adoptywnym doprowadziło do istotnej charakterystyki nisz krwiotwórczych komórek macierzystych 15 lub mikrodomen śródbłonka szpiku kostnego sprzyjających wszczepieniu guza 16 i dostarczyło kilku podstawowych danych wejściowych w zakresie kluczowych pojęć w immunologii 17 . Jednak takie podejście zwykle wymaga setek tysięcy komórek, aby mieć szansę na ich późniejsze wykrycie in vivo. Można to wytłumaczyć wysoką śmiertelnością po barwieniu, rozcieńczeniem w całym ciele i zmianą stanu aktywacji, co może prowadzić do tendencyjnego naprowadzania. Endogenne znakowanie z transgenicznego systemu myszy znacznie przezwycięża te ograniczenia i umożliwia zobrazowanie zachowania endogennych osteoblastów 8, megakariocytów 18 lub podzbiorów linii szpikowej 6 . Niemniej jednak należy zachować ostrożność przy rozważaniu swoistości reportera fluorescencyjnego wśród badanego podzbioru.

Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, zwany myszą MacBlue 1, jest cennym transgenicznym systemem do badania monocytów rdzeniowych za pomocą obrazowania w czasie rzeczywistym 6. Dożylne wstrzyknięcie rodaminy-dekstranu o dużej masie cząsteczkowej odróżnia miąższ rdzeniowy od naczyniowej sieci sinusoidalnej szpiku kostnego. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest śledzenie zachowania monocytów w różnych przedziałach rdzenia w określonym kontekście fizjopatologicznym. Ponadto proponujemy dodatkową strategię porównywania dynamiki monocytów z dynamiką neutrofili poprzez znakowanie in vivo przy użyciu specyficznego przeciwciała.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie protokoły eksperymentów zostały zatwierdzone przez Francuski Komitet ds. Doświadczeń i Etyki na Zwierzętach oraz zatwierdzone przez "Service Protection et Santé Animales, Environnement" pod numerem A-75-2065. Wielkość próby jest dobierana tak, aby zapewnić powtarzalność eksperymentów i zgodnie z 3R regulacji etycznych zwierząt.

1. Przygotowanie myszy

  1. znieczulenie
    1. W przypadku krótkiego okresu obrazowania (mniej niż 1 godzina) znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 200 μl roztworu soli fizjologicznej zawierającego ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg).
    2. Alternatywnie, w przypadku dłuższego okresu obrazowania (do 4 godzin), znieczulić mysz inhalacją izofluranu 2,5% odparowanego w mieszaninie 70/30 O2/N2O, przez dostosowaną maskę.
    3. UWAGA: W ten sposób zapewnia bardziej stabilną utratę przytomności i pozwala uniknąć seryjnego wstrzykiwania leków do otrzewnowej.
    4. Po znieczuleniu myszy sprawdź, czy nie straciła przytomności poprzez stymulację opuszki stopy szczypcami.
  2. Barwienie naczyń krwionośnych/dodatkowe barwienie
    1. Barwienie naczyń krwionośnych: Wstrzyknąć dożylnie do żyły ogonowej 200 μl dekstranu rodaminy (2 MDa, 10 mg/ml w buforze soli fizjologicznej).
    2. Do barwienia neutrofili: wstrzyknąć dożylnie 2 μg Ly6G-PE (klon 1A8) do 100 μl roztworu soli fizjologicznej do żyły ogonowej.
  3. Unieruchomienia
    1. Do unieruchomienia należy użyć specjalnie wykonanego uchwytu stereotaktycznego dostosowanego do mikroskopu i inhalatora z gazem anestezjologicznym.
      UWAGA: Uchwyt sterotaktyczny to metalowy wspornik z dwoma metalowymi wspornikami, z których jeden jest zamocowany, a drugi zdejmowany i regulowany, w celu dokręcenia głowy zwierzęcia.
    2. Zamontuj główkę myszy między płytami mocującymi, aby zapewnić izolację od ruchów oddechowych. Zaciśnij uszy między płytkami mocującymi a głową, aby rozciągnąć skórę. Sprawdzić stabilność i dobrostan oddychania zwierzęcia.
  4. Usuń skórę głowy
    1. Ostrożnie użyj etanolu 70%, aby zwilżyć włosy skóry głowy sterylnym aplikatorem, unikając kontaktu z oczami.
    2. Przetnij skórę sterylnymi nożyczkami i szczypcami, aby całkowicie usunąć skórę głowy od tyłu kości ciemieniowej do kości czołowej. Przechowywać w odległości do 3 mm od oczu i uszu, aby zapobiec obfitemu krwawieniu. Usuń luźną tkankę łączną pokrywającą czaszkę (okostną). Zmyj pozostałe włosy ciepłym ręcznikiem papierowym nasączonym PBS.
  5. Konfiguracja systemu zanurzeniowego
    1. Wklej gumowy pierścień o średnicy 18 mm z klejem chirurgicznym bezpośrednio na czaszkę za pomocą igły o małej średnicy, aby kontrolować dystrybucję. Przyklej cały obwód gumowego pierścienia, aby zapobiec wyciekom (30 μl powinno wystarczyć).
    2. Wyczyść czaszkę pod pierścieniem po raz ostatni ręcznikiem papierowym nasączonym PBS, a następnie dodaj 37 °C PBS, aby całkowicie zanurzyć czaszkę. Dodaj kroplę 0,9% roztworu NaCl lub specjalnej maści okulistycznej na każde oko myszy, aby uniknąć wysuszenia oczu. Przeciągnij uchwyt stereotaktyczny pod obiektyw.
    3. W przybliżeniu ustaw pole za pomocą okularu mikroskopu poprzez bezpośrednią transmisję.

2. Akwizycja obrazowania dwufotonowego

  1. Użyj mikroskopu wielofotonowego sprzężonego z laserem kryształowym Ti:Sapphire, który dostarcza impulsy światła NIR o prędkości 140 fs, selektywnie przestrajalnego od 680 do 1,080 nm, oraz modulatorem akustyczno-optycznym do kontroli mocy lasera. Użyj konfiguracji obejmującej 3 zewnętrzne detektory niedescanned (NDD) (które umożliwiają jednoczesny zapis 3 kanałów fluorescencyjnych) z kombinacją 2 zwierciadeł dichroicznych (565 nm i 690 nm), filtrów pasmowoprzepustowych 565/610 i 500/550 oraz filtra krótkoprzepustowego 485, z obiektywem do zanurzenia w wodzie o planapochromatycznym ×20 (NA = 1).
  2. Ustaw komorę grzewczą tak, aby umożliwić dobrą hometermię znieczulonej myszy.,
    UWAGA: Temperaturę można ustawić na 1 godzinę przed sesją obrazowania, aby uzyskać lepszą stabilność. W naszym przypadku wybrano 32 °C, aby uzyskać optymalną temperaturę ciała znieczulonej myszy (36-37 °C) i utrzymuje się ona do 4 godzin. Temperatura ta może być dostosowana do zastosowanego systemu (do sprawdzenia tego punktu można użyć sondy cyfrowej). Ponadto zastosowana komora grzewcza jest ciemna/i zakrywa część systemu (obiektywy i płytę z napędem), aby uniknąć zanieczyszczenia światłem zewnętrznym.
  3. Włącz system
    1. Włącz laser Ti:Sapphire, a następnie cały system mikroskopu. Uruchom oprogramowanie do akwizycji. Ustaw zakres długości fali lasera na 870 nm. Wybierz odpowiedni NDD do nagrywania.
      UWAGA: W naszym przypadku generacja drugiej harmonicznej (SHG) 19i cyjanowe białko fluorescencyjne (ECFP) są wykrywane przez NDD po filtrze krótkoprzepustowym 485. ECFP jest również wykrywany przez NDD po filtrze pasmowoprzepustowym 500/550, a rodamin-dekstran jest wykrywany przez NDD po filtrze pasmowoprzepustowym 565/610.
  4. Dostosowywanie ustawień pobierania
    1. Użyj polecenia obrazowania "akwizycja na żywo" w oprogramowaniu i korzystając ze sterowania kierunkowego mikroskopu, dostosuj ostrość do obszaru z sygnałem ECFP i rodaminy. Ustaw moc lasera na minimum, aby uzyskać najlepszy stosunek sygnału do szumu przy minimalnych uszkodzeniach fotograficznych.
      UWAGA: Używane ustawienie mocy różni się w zależności od głębokości obszaru zainteresowania. Zazwyczaj ustawienia AOM są ustawione na około 20%, co oznacza moc lasera poza obiektywem około 15 mW. Lepiej jest zwiększyć moc wzmocnienia PMT dla każdego NDD, aby zmniejszyć fotowybielanie i fotouszkodzenia. Typowe ustawienia akwizycji to pojedyncze skanowanie z czasem przebywania piksela 1,58 μs i rozdzielczością 512 x 512 pikseli przy powiększeniu 1,5.
  5. Wybierz regiony zainteresowania
    1. Po ustawieniu parametrów rejestracji należy ponownie użyć polecenia akwizycji "na żywo" i zbadać tkankę, aby wybrać żądane pole (x,y,z) do monitorowania w czasie rzeczywistym.
      UWAGA: Zazwyczaj wybieramy pole obejmujące zarówno obszary naczyniowe, jak i miąższowe.
    2. Zarejestruj pole za pomocą polecenia programowego "position".
      UWAGA: To polecenie zapamiętuje współrzędne x,y,z różnych odległych pól.
    3. Wybierz i zarejestruj dodatkowe pola zainteresowań (do 3) przy użyciu tej samej procedury.
    4. Ustaw stos z 3D za pomocą polecenia oprogramowania "z-stack" na pierwszej zapamiętanej pozycji zgodnie z wymaganą objętością z wybranym powiększeniem. Zapamiętaj najpierw głębszą pozycję, a następnie najwyższą pozycję. Normalizuj moc lasera z głębokością.
      UWAGA: W przypadku wielokrotnego jednoczesnego obrazowania pola uzyskujemy 5 warstw oddzielonych krokami z 3 μm dla każdego pola, aby uzyskać objętość o grubości 12 μm. Ustawienia te można dostosować do typu badanej komórki.
  6. Wprowadzenie na rynek akwizycji
    1. Wybierz polecenie programowe "szeregi czasowe" i wybierz czas trwania przedziału czasu oraz liczbę cykli. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe zgodnie z wymaganym upływem czasu i czasem trwania, wybierając polecenie oprogramowania "rozpocznij eksperyment".
      UWAGA: W naszym przypadku uzyskujemy jeden wolumin co 30 sekund podczas 60 cykli reprezentujących 30 minut czasu rzeczywistego. Można wykonać mniejszy upływ czasu, aby śledzić szybkie toczenie się komórek w naczyniu krwionośnym. W tym przypadku cieńszy stos z i nie więcej niż 2 różne pola mogą być rejestrowane w tym samym czasie.
    2. Regularne monitorowanie konfiguracji.
      1. Zawsze monitoruj zwierzę, aby upewnić się, że jest nieprzytomne.
        UWAGA: Potrząsanie wąsami lub nogami zwierzęcia jest wskaźnikiem przebudzenia. W przypadku, gdy oddech zwierzęcia jest nierówny, ilość izofluranu może być nieznacznie zmniejszona. Silny dryf tkanek podczas akwizycji jest wskaźnikiem odrodzenia myszy.
      2. Upewnij się, że obiektyw jest prawidłowo zanurzony. Odnowić PBS w temperaturze 37 °C między dwoma akwizycjami (30 min).
        UWAGA: Postępujący zanik sygnału podczas akwizycji jest wskaźnikiem wycieku PBS.
  7. Zakończenie procedury
    1. Po nagraniu wymaganych filmów należy szybko poddać zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy przed resuscytacją.
      UWAGA: gojenie się ran prowadzi do powstania strupa w ciągu 24 do 48 godzin, co ogranicza możliwość wykonania obrazowania podłużnego.

3. Analiza danych

  1. Korekcja dryftu
    1. Użyj oprogramowania Imaris Bitplane do automatycznego śledzenia 3D.
    2. Otwórz sekwencję obrazów 3D w Imaris. Wybierz polecenie "spot" i wygeneruj ręczne śledzenie (kliknięcie myszą + shift) dla wszystkich punktów czasowych dla co najmniej 4 różnych punktów kotwiczenia, jeśli to możliwe, równomiernie rozmieszczonych w terenie.
    3. Zastosuj korekcję dryfu za pomocą polecenia "correct drift" w zakładce "edytuj ścieżkę".
    4. Sprawdź jakość poprawki w x, y, a zwłaszcza w z, aby uniknąć sztucznych wahań.
      UWAGA: Jeśli korekta nie jest zadowalająca, wypróbuj inne punkty kontrolne lub wyklucz film z analizy.
  2. Śledzenie komórek
    1. Użyj polecenia "dodaj nowe miejsca" i wybierz ustawienie algorytmu "śledź miejsca w czasie". Przejdź do następnego kroku.
    2. Zastosuj procedurę automatycznego śledzenia komórek na całym interesującym Cię kanale za pomocą polecenia "kanał źródłowy". Ustaw średnicę obiektów (np. komórek) na 10 μm. Przejdź do następnego kroku.
      UWAGA: Wybór będzie zależał od rozróżnienia między obiektami i specyficzności mierzonego sygnału. Krótko mówiąc, automatyczne śledzenie na całym kanale jest możliwe tylko wtedy, gdy wykryty sygnał jest specyficzny dla obiektu zainteresowania. Ponieważ zarówno SHG, jak i ECFP są wykrywane przez NDD po filtrze krótkoprzepustowym 485, śledzenie będzie bardziej szczegółowe i wydajne przy użyciu sygnału ECFP zarejestrowanego przez NDD po filtrach pasmowoprzepustowych 500/550. Zgrupowane lub gęsto upakowane obiekty będą wymagały ręcznego wyboru pojedynczych obiektów, podobnie jak w kroku 3.1.2.
    3. Wybierz typ filtra "jakość", ustaw próg, aby wykluczyć śledzenie nieokreślonych obiektów. Przejdź do następnego kroku.
    4. Wybierz "Ruch algorytmu Browna" z dokładnymi parametrami "Maksymalna odległość" i "Rozmiar przerwy" między dwoma punktami. Sprawdź poprawność generowania ścieżek.
    5. Po automatycznym obliczeniu ścieżek wybierz typ filtra "czas trwania ścieżki", ustaw próg, aby wyeliminować ścieżki krótsze niż 120 sekund (reprezentujące 4 punkty czasowe).
    6. Obowiązkowe: Po automatycznym śledzeniu sprawdź jakość ścieżek.
      1. Rozwiń pasek czasu, aby sprawdzić, czy obiekty podążają ścieżkami ścieżek. Jeśli nie, skorzystaj z opcji korekcji punktów trasy dostępnych w zakładce "edytuj": Usuń fałszywe lub niewłaściwe ścieżki za pomocą polecenia "usuń" (usuń dowolny punkt trasy pojedynczo za pomocą polecenia "rozłącz"). Jeśli ścieżka trasy jest nieciągła, należy dodać brakujące punkty czasowe (kliknięcie myszką+shift), zaznaczyć wszystkie punkty na danej trasie, a następnie użyć komendy "połącz" w zakładce "edytuj ścieżkę".
  3. Parametry kwantyfikacji
    1. Wybierz zakładkę "Statystyka" w poleceniu "Preferencje", wybierz interesujące Cię parametry dynamiczne z listy. Wybierz polecenie "Eksportuj wszystkie statystyki do pliku" i zapisz wygenerowany plik Excel.
      UWAGA: Kilka parametrów dynamicznych jest uzyskiwanych bezpośrednio z oprogramowania, takich jak długość toru, prędkość chwilowa, prędkość średnia i prostoliniowość toru. Współczynnik ruchliwości 6,20 można określić, ale nie jest on bezpośrednio dostarczany przez oprogramowanie.
    2. Dla każdej komórki oblicz średnią przemieszczeń dla każdego okresu czasu (δt) (dla 30-sekundowego filmu poklatkowego δt będzie wynosić 30, 60, 90 sekund itd.). Wykreślić średnią przemieszczenia kwadratowego w funkcji przedziału czasu. Uzyskaj współczynnik ruchliwości, obliczając nachylenie liniowej części krzywej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktura czaszki myszy stanowi dobrą okazję do badania fizjologii szpiku kostnego poprzez obrazowanie przyżyciowe. Ponieważ kość jest cienka wokół przedniej części ciemieniowej, możliwe jest uzyskanie dostępu do nisz rdzeniowych bez ścierania kości. Rycina 1 przedstawia szerokie pole 2D czaszki transgenicznej myszy MacBlue. Macierz kostna składa się głównie z kolagenu I, łatwo wykrywalnego przez SHG 19. Iniekcja rodaminy-dekstranu barwi sieć naczyniową szpiku kostnego i pozwala na identyfikac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytycznymi punktami metodologii obrazowania in vivo jest zapewnienie stabilności ostrości w celu maksymalizacji czasu trwania obrazowania oraz zminimalizowania ryzyka zanieczyszczenia bakteryjnego i stanu zapalnego, które mogą wpływać na dynamikę komórek zapalnych. Obrazowanie szpiku kostnego czaszki jest zgodne z tymi celami, ponieważ operacja wykonywana w celu uzyskania dostępu do szpiku kostnego jest minimalna. Stosowanie sterylnego materiału i środków antyseptycznych jest niezbędne, aby ograniczyć r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Anne Daron i Pierre'owi Louisowi Loyherowi za pomoc redakcyjną, Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) za pomoc przy mikroskopie dwufotonowym oraz Animal Facility "NAC" i Camille Baudesson za pomoc w hodowli myszy. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (7PR/2007-2013) na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 304810 – RAID oraz nr 241440-Endostem od Inserm, od Université Pierre et Marie Curie "Emergence", od la "Ligue contre le cancer", od "Association pour la Recherche sur le Cancer" oraz od "Agence Nationale de la Recherche" Programme Emergence 2012 (ANR-EMMA-050). P.H. był wspierany przez la "Ligue contre le cancer".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KetaminMerial100 mg/ml, środek znieczulający
XylazinBayer HealthCare10 mg/ml, środek znieczulający
IsofluranBaxter2,5%, środek znieczulający
O2/NO270/30, środek znieczulający
Rhodamin-DextranInvitrogen2 MDa, 10 mg/ml, Barwienie naczyń krwionośnych
Ly6G-PEKlon Becton-Dickinson1A8, barwienie neutrofili
Uchwyt stereotaktycznyDomowachirurgia
Etanol 70%
chirurgii Chirurgia sterylnych nożyczek i szczypiec
Gumowy pierścieńo średnicy 18 mm, chirurgia
Glubran 2Queryo Medycznyklej chirurgiczny, mocowanie pierścienia gumowego
Igły o małej średnicyChirurgia Terumo
Mikroskop wielofotonowy Zeiss LSM 710 NLO Mikroskop Carl Zeiss
Ti:Szafirowy kryształ laserowy Spójne impulsy Chameleon Ultra140 fsec światła NIR
Zen 2010Carl ZeissAcquistion Software
Imaris Bitplane płaszczyzny bitowej, automatyczne śledzenie 3D
PBS 1XChirurgiaDutschera
Komora termostatycznaCarl Zeissobrazowanie przyżyciowe
Oprogramowanie do analizy D.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
  2. Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death. J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).
  3. Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19, 71-82 (2003).
  4. Robbins, C. S., Swirski, F. K. The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation. Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).
  5. Shi, C., et al. Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands. Immunity. 34, 590-601 (2011).
  6. Jacquelin, S., et al. CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice. Blood. 122, 674-683 (2013).
  7. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  8. Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
  9. Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).
  10. Milo, I., et al. Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow. 122, 193-208 (2013).
  11. Cavanagh, L. L., et al. Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells. Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).
  12. Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
  13. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).
  14. Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J Exp Med. 188, 465-474 (1998).
  15. Rashidi, N. M., et al. In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells. Blood. , (2014).
  16. Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
  17. Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
  18. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
  19. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).
  20. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  21. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).
  22. Yost, C. C., et al. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood. 113, 6419-6427 (2009).
  23. Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nat Med. 19, 107-112 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie dwufotonowemysz reporterowa CSF1Rznakowanie sieci naczyniowejledzenie w czasie rzeczywistymanaliza ruchu kom rekmobilizacja monocyt wmikroskopia intravitalnaszpik kostny czaszkifluorescencyjne ledzenie kom rek

Powiązane artykuły