Artykuł metodologiczny

Analiza wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów z przepływu

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52480

⸱

7 stycznia 2015

 ,  ,  , 
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Zdolność śródbłonka w stanie zapalnym do rekrutacji leukocytów z przepływu jest regulowana przez mezenchymalne komórki zrębu. Opisujemy dwa modele in vitro obejmujące pierwotne komórki ludzkie, które można wykorzystać do oceny rekrutacji neutrofili na podstawie przepływu i zbadania roli, jaką mezenchymalne komórki zrębu odgrywają w regulacji tego procesu.

Streszczenie

Komórki zrębu regulują rekrutację krążących leukocytów podczas stanu zapalnego poprzez wzajemne oddziaływanie z sąsiednimi komórkami śródbłonka. Tutaj opisujemy dwa "naczyniowe" modele in vitro do badania rekrutacji krążących neutrofili z przepływu przez komórki śródbłonka objęte stanem zapalnym. Główną zaletą tych modeli jest możliwość analizowania każdego kroku w kaskadzie adhezji leukocytów w kolejności, tak jak miałoby to miejsce in vivo. Opisujemy również, w jaki sposób oba modele można zaadaptować do badania roli komórek zrębu, w tym przypadku mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), w regulacji rekrutacji leukocytów.

Pierwotne komórki śródbłonka były hodowane samodzielnie lub razem z ludzkim MSC w bezpośrednim kontakcie na mikroszkiełkach Ibidi lub po przeciwnych stronach filtra Transwell przez 24 godziny. Hodowle były stymulowane czynnikiem martwicy nowotworu alfa (TNFα) przez 4 godziny i włączone do testu adhezji opartego na przepływie. Bolus neutrofili był perfundowany przez śródbłonek przez 4 minuty. Uchwycenie przepływających neutrofili i ich interakcji ze śródbłonkiem uwidoczniono za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.

W obu modelach, stymulacja cytokinami zwiększała rekrutację śródbłonka przepływających neutrofili w sposób zależny od dawki. Analiza zachowania rekrutowanych neutrofili wykazała zależny od dawki spadek toczenia i zależny od dawki wzrost transmigracji przez śródbłonek. W kohodowli MSC hamowało adhezję neutrofili do śródbłonka stymulowanego TNFα.

Nasze modele adhezji oparte na przepływie naśladują początkowe fazy rekrutacji leukocytów z krążenia. Oprócz leukocytów można je wykorzystać do badania rekrutacji innych typów komórek, takich jak terapeutycznie podawane MSC lub krążące komórki nowotworowe. Nasze wielowarstwowe modele współhodowli wykazały, że MSC komunikuje się ze śródbłonkiem, modyfikując ich odpowiedź na cytokiny prozapalne, zmieniając rekrutację neutrofili. Konieczne są dalsze badania z wykorzystaniem takich modeli, aby w pełni zrozumieć, w jaki sposób komórki zrębu z różnych tkanek i stanów (zaburzenia zapalne lub nowotwory) wpływają na rekrutację leukocytów podczas stanu zapalnego.

Wprowadzenie

Stan zapalny jest ochronną reakcją na infekcję mikrobiologiczną lub uszkodzenie tkanki, która wymaga ścisłej regulacji wchodzenia i wychodzenia leukocytów z tkanki objętej stanem zapalnym, aby umożliwić rozwiązanie1,2. Wzajemne oddziaływanie między komórkami śródbłonka (EC) wyściełającymi naczynia krwionośne, krążącymi leukocytami i komórkami zrębu rezydującymi w tkance jest niezbędne do koordynowania tego procesu3. Jednak niekontrolowana rekrutacja leukocytów i ich nieskuteczny klirens leżą u podstaw rozwoju przewlekłych chorób zapalnych4. Nasza obecna wiedza na temat rekrutacji leukocytów w zdrowiu i chorobie jest niekompletna i do analizy tego procesu potrzebne są bardziej solidne modele.

Mechanizmy wspomagające rekrutację leukocytów z krwi przez naczyniowe EC w żyłkach pozakapilarnych zostały dobrze opisane1,2,5. Krążące leukocyty są wychwytywane przez wyspecjalizowane receptory (np. VCAM-1, E-selektyna, selektyna P), które są regulowane w górę na śródbłonku objętym stanem zapalnym. Te przejściowe interakcje umożliwiają leukocytom interakcję z chemokinami związanymi z powierzchnią i mediatorami pochodzącymi z lipidów (pochodzenia śródbłonkowego lub zrębowego), które aktywują integryny wyrażane przez leukocyty6-11. To z kolei stabilizuje adhezję i napędza migrację przez śródbłonek do tkanki12-15. W tkance rekrutowane leukocyty są poddawane działaniu czynników pochodzenia zrębowego, które wpływają na ich ruchliwość, funkcję i przeżycie16,17. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że sygnały odbierane na każdym etapie procesu rekrutacji warunkują leukocyty na kolejny. Jednak nasza wiedza na temat rekrutacji leukocytów pozostaje niekompletna i bardzo niewiele wiadomo na temat składników kształtujących ruch leukocytów w tkance.

W Birmingham opracowaliśmy kilka modeli "naczyniowych" in vitro do badania rekrutacji leukocytów z przepływu9,18,19. Teraz rozumiemy, że EC naczyniowe działają jako bezpośrednie regulatory rekrutacji leukocytów, reagując na zmiany w ich lokalnym mikrośrodowisku. W szczególności komórki zrębu rezydujące w tkance mogą aktywnie regulować odpowiedź zapalną, częściowo poprzez rozmowę z sąsiednim naczyniowym EC w celu wpływania na ich rolę w rekrutacji3. Wcześniej wykazaliśmy, że różne komórki zrębu modulują zdolność EC do wspierania adhezji i migracji leukocytów w sposób specyficzny dla tkanki, oraz że efekty te ulegają zmianie w chorobach przewlekłych13,16,20,21. W ten sposób komórki zrębu ustanawiają tkankowe "kody adresowe", które definiują kontekst każdej reakcji zapalnej22. Niedawno wykazaliśmy, że MSC pochodzące ze szpiku kostnego (BMMSC) silnie obniżają odpowiedź EC na cytokiny, prowadząc do zmniejszenia rekrutacji zarówno neutrofili, jak i limfocytów23.

Mechanizmy rządzące rekrutacją wyjaśnione in vitro w dużej mierze wykorzystywały testy obejmujące pojedynczy typ komórki (np. EC) lub białko w izolacji. Badania te nie uwzględniają jednak wpływu lokalnego środowiska tkankowego (tj. obecności komórek zrębu) na rekrutację leukocytów i ich późniejszą migrację do tkanki. W tym miejscu opisujemy dwie metody oparte na przepływie, w których komórki zrębu, w szczególności mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), są hodowane wspólnie z EC23. Takie modele pozwalają nam zbadać wpływ komórek zrębu na odpowiedzi śródbłonka, w szczególności ich zdolność do wspierania rekrutacji leukocytów z przepływu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja i hodowla pierwotnych komórek śródbłonka ludzkiego i mezenchymalnych komórek macierzystych

  1. Izolacja i hodowla komórek śródbłonka żyły pępowinowej człowieka (HUVEC):
    1. Połóż pępowinę na tacy z ręcznikami papierowymi i spryskaj 70% etanolem. Umieścić w kapturze do hodowli tkankowej. Zidentyfikuj żyłę i kanelację na obu końcach. Umieść opaskę kablową wokół kaniulowanego końca, aby go zabezpieczyć.
    2. Zmyć krew żylną za pomocą PBS za pomocą strzykawki. Napełnić strzykawkę powietrzem i przepuścić przez żyłę, aby usunąć i wyrzucić resztki PBS.
    3. Rozmrozić 10 mg/ml kolagenazy typu Ia i rozcieńczyć w stosunku 1:10 w PBS (z chlorkiem wapnia i magnezu) do końcowego stężenia 1 mg/ml. Przepuścić roztwór kolagenazy do żyły, aż obie kaniule zostaną wypełnione. Zamknij zaciski na kaniulach na obu końcach.
    4. Przykryj tacę chusteczką i spryskaj 70% etanolem. Umieść przewód w inkubatorze na 20 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    5. Wyjmij przewód z inkubatora i dokręć opaski kablowe. Delikatnie masuj pępowinek przez 1 minutę. Przepłukać zawiesinę komórkową 10 ml PBS i zebrać w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    6. Napełnić strzykawkę powietrzem i przepuścić przez żyłę w celu dwukrotnego usunięcia pozostałości PBS, zbierając PBS do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml użytej w kroku 1.1.5. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnego podłoża EC. Pożywka EC składa się z M199 uzupełnionego 35 μg/ml siarczanu gentamycyny, 10 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu, 1 μg/ml hydrokortyzonu, 2,5 μg/ml amfoterycyny B i 20% płodowej surowicy cielęcej.
    8. Dodać 4 ml pożywki EC i zawiesinę EC do kolby o średnicy25 cm2. Zmień podłoże następnego dnia, a następnie co 2 dni.
    9. EC wykazują morfologię podobną do kostki brukowej (ryc. 1Ai). W przypadku testów adhezji EC są zazwyczaj wysiewane, gdy osiągną 100% zbieżności (patrz sekcja 1.4).
  2. Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych Galaretki Whartona (WJMSC) z ludzkiej pępowiny:
    1. Wyizoluj galaretowaty MSC Whartona (WJMSC) ze świeżych pępowiny lub z pępowiny, które zostały już użyte do wyizolowania EC. Przetnij pępowinę na kawałki o długości 5 cm. Przetnij każdy kawałek wzdłuż, aby odsłonić naczynia krwionośne (2 tętnice [białe, sztywne] i 1 żyła [żółta, rozdęta]).
    2. Za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy usuń naczynia krwionośne i wyrzuć. Pokrój całą tkankę na 2 - 3 mm3 kawałki. Za pomocą kleszczy umieść 2 - 3 mm3 kawałki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    3. Rozmrozić 100 mg/ml kolagenazy podstawowej typu II i rozcieńczyć w stosunku 1:100 w 10 ml PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml. Rozmrozić 20 000 U/ml hialuronidazy podstawowej i rozcieńczyć w stosunku 1:400 do końcowego stężenia 50 U/ml w roztworze kolagenazy.
    4. Dodać koktajl enzymatyczny do probówki wirówkowej zawierającej fragmenty tkanki. Inkubować fragmenty tkanek przez 5 godzin w temperaturze 37 °C na wolnym rotatorze.
    5. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:5 w PBS. Umieść filtr porowy o wielkości 100 μm w nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Wlej zawiesinę komórek na filtr porowy 100 μm.
      UWAGA: Pozostałe fragmenty tkanek zostaną zatrzymane na filtrze, a komórki zostaną zebrane w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    6. Wyrzuć filtr. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad WJMSC w 12 ml kompletnej pożywki hodowlanej WJMSC (DMEM o niskiej zawartości glukozy, 10% FCS i 100 U/ml penicyliny + 100 μg/ml mieszaniny streptomycyny).
    7. Wysiać wszystkie komórki w kolbie do hodowli tkankowych o długości 75cm2. Po 24 godzinach zmienić pożywkę na 12 ml kompletnej pożywki hodowlanej WJMSC. Wymieniaj podłoże co 2 - 3 dni. Komórki powinny osiągnąć 70 - 80% zbieżności w ciągu 2 tygodni. Pasaż, gdy WJMSC osiąga 70 - 80% konfluencji (patrz punkt 1.4).
  3. Ekspansja MSC pochodzącego ze szpiku kostnego (BMMSC):
    1. Wyizolować MSC pochodzące z ludzkiego szpiku kostnego (BMMSC), jak opisano wcześniej24. Dodać 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej MSC (MSCGM) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    2. Rozmrozić fiolkę p2 BMMSC, umieszczając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 2 minuty. Dodać zawiesinę BMMSC do probówki wirówkowej zawierającej MSCGM. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
    3. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie odessać supernatant.
    4. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml MSCGM i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub cyfrowego licznika komórek, takiego jak celometr.
    5. Komórki nasienne do 75 cm2 kolby hodowlane o gęstości 5 000 - 6 000 komórek na cm2 w 12 ml MSCGM. Zmień podłoże po 24 godzinach za pomocą 12 ml MSCGM. Podawaj komórkom 12 ml MSCGM co 2 - 3 dni.
    6. Pasaż, gdy BMMSC osiąga 70 - 80% zbiegu (patrz punkt 1.4). Komórki wykazują morfologię fibroblastyczną (ryc. 1Aii).
  4. Oddział Komisji Europejskiej i MSC:
    1. Odessać podłoże z 25 cm2 kolby hodowlane. Dodać 2 ml 0,02% EDTA przez około 2 minuty. Odessać EDTA i dodać 2 ml trypsyny (2,5 mg/ml). Oglądaj pod mikroskopem, aż komórki staną się okrągłe.
    2. Stuknij w kolbę, aby odłączyć komórki. Dezaktywować trypsynę, dodając 8 ml pożywki hodowlanej (w zależności od typu komórki; Pożywka EC dla HUVEC, DMEM LG dla WJMSC i MSCGM dla BMMSC) do kolby hodowlanej i przenieść zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    3. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w sposób opisany poniżej.
      1. W celu pasażowania MSC należy ponownie zawiesić osad w 3 ml pożywki hodowlanej. Dodać 11 ml pożywki do trzech oddzielnych kolb hodowlanycho średnicy 75 cm 2. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej kolby hodowlanej (podział 1:3). Pasaż WJMSC i BMMSC 3 razy (p3) przed użyciem w testach kohodowlanych.
      2. Dla wysiewu EC lub MSC w testach adhezji – patrz sekcje 2 i 3.
  5. Zamrażanie MSC:
    1. W przejściu 3 odczepić MSC zgodnie z opisem w sekcji 1.4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 3 ml lodowatego CryoSFM. Odpipetować 1 ml porcji zawiesiny komórkowej do 1,5 ml lodowatych kriowialiów. Umieść kriowiale w pojemniku do zamrażania.
    2. Przechowywać pojemnik w temperaturze -80 °C O/N. Przenieść do ciekłego azotu. Rozmrozić fiolkę MSC (postępuj zgodnie z krokami 1.3.1 - 1.3.6). Zawiesić MSC w 5 ml pożywce hodowlanej (wybrać odpowiednią pożywkę dla WJMSC lub BMMSC) i wysiać nasiona do kolby o średnicy25 cm2.

2. Ustanawianie śródbłonkowo-mezenchymalnych kokultur komórek macierzystych na mikroszkiełkach Ibidi

  1. Trypsynizować zlewającą się 25 cm 2 kolbę EC (~1,5 x 106 komórek; jak w sekcji 1.4). Ponownie zawiesić EC w 380 μl MSCGM (kolba 1 x 25 cm2 wysiewa dwie 6-kanałowe mikroszkiełka Ibidi (~1,25 x 105 / kanał), do testów adhezyjnych wszystkie typy komórek są hodowane w MSCGM). Dodaj 30 μl zawiesiny EC do każdego kanału (pokryje to obszar wzrostu poprzez działanie kapilarne). Inkubować mikroszkiełko Ibidi w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę.
  2. Dodaj 140 μl MSCGM do każdego kanału, a następnie odessij. Powtórz dwukrotnie, w sumie 3 prania. Dodać 140 μl MSCGM i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 24 godziny.
  3. W przypadku kokultur należy odłączyć MSC (sekcja 1.4). Wykonaj liczenie komórek za pomocą hemocytometru lub celometru. Dostosuj stężenie MSC do 1,5 x 105 komórek/ml.
  4. Odessać nadmiar pożywki z kanałów Ibidi (pozostawiając w pożywce tylko obszar wzrostu kanału). Dodaj 30 μl zawiesiny MSC do kanałów Ibidi. Odessać pożywkę, która została wyrzucona z obszaru wzrostu kanału i dodać kolejne 30 μl zawiesiny MSC. Powtórzyć tę czynność jeszcze raz, a następnie umieścić mikroszkiełko Ibidi w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 1 godzinę.
  5. Dodaj 140 μl MSCGM do każdego kanału, a następnie odessij. Powtórz dwukrotnie, w sumie 3 prania. Dodać końcową objętość 140 μl MSCGM do każdego kanału i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 24 godziny.
  6. Rozmrozić 1 x 105 U/ml TNFα i rozcieńczyć w stosunku 1:1,000 w MSCGM do końcowego stężenia 100 U/ml (co odpowiada ~10 ng/ml). Przeprowadzić rozcieńczenie szeregowe, rozcieńczając 100 U/ml TNFα w stosunku 1:10 w MSCGM, aby uzyskać 10 U/ml. Rozcieńczyć 10 U/ml TNFα w stosunku 1:10 w MSCGM, aby uzyskać 1 U/ml.
  7. Traktować kanały TNFα w temperaturze 37 °C przez 4 godziny przed badaniem. Wahania temperatury podczas leczenia cytokinami zmienią obserwowane wzorce rekrutacji neutrofili. Dodaj nowy MSCGM do nieleczonych kanałów.

3. Ustanawianie śródbłonkowo-mezenchymalnych kokultur komórek macierzystych na filtrach

  1. Odłączyć WJ lub BMMSC zgodnie z opisem w rozdziale 1.4. Zawiesić osad w 1 ml MSCGM. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru lub celometru.
  2. Dostosować objętość tak, aby końcowe stężenie wynosiło 5 x10,5 MSC w 500 μl MSCGM.
  3. Za pomocą sterylnych kleszczy odwróć 6-dołkowe filtry PET Transwell 0,4 μm i umieść je w sterylnym pudełku.
  4. Rozsiać ziarno 5 x 105 MSC na zewnętrznej powierzchni filtrów. Inkubować filtry w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 1 godzinę.
  5. Zbierz media z zewnętrznej powierzchni filtra. Policz liczbę nieprzestrzegających MSC w mediach. Ponownie odwróć filtry za pomocą sterylnych kleszczyków i umieść w pasującej 6-dołkowej płytce zawierającej 3 ml MSCGM.
  6. Dodać 2 ml MSCGM na wewnętrzną powierzchnię filtra (rysunek 1B). Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny. Trypsynizować zlewającą się kolbę EC o długości 25cm2 (Rysunek 1Ai; jak w sekcji 1.4).
  7. Ponownie zawiesić EC w 8 ml MSCGM (kolba 1 x 25 cm2 wysieje cztery 6-dołkowe filtry; ~5 x 105 EC / filtr). Zassać pożywkę od góry i od dołu porowatych filtrów. Dodaj 3 ml świeżego MSCGM do dolnej komory (pod filtrem). Dodać 2 ml zawiesiny EC na wewnętrzną powierzchnię każdego filtra. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  8. Odessać pożywkę, aby zmyć nieprzylegającą EC i zastąpić ją świeżym MSCGM. Ustaw równoległe filtry monokultury EC, wysiewając komórki na wewnętrznej powierzchni bez uprzedniego wysiewu MSC. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  9. Sprawdź, czy monowarstwa EC zlewa się i nie zawiera przerw. Monowarstwy subkonfluentne nie mogą być używane do testów adhezji (rysunek 1B).
  10. Traktować górną i dolną komorę filtrów 1, 10 lub 100 U/ml TNFα (co odpowiada ~10 ng/ml) w temperaturze 37 °C przez 4 godziny przed oznaczeniem (opisanym w sekcji 2).

4. Izolacja leukocytów

  1. Pobrać krew żylną od zdrowych ochotników i natychmiast poddzielić ją do probówek EDTA. Delikatnie odwróć probówki, aby wymieszać.
  2. Nałożyć warstwę 2,5 ml Histopaque 1077 na 2,5 ml Histopaque 1119 w 10 ml probówce z okrągłym dnem. Nałóż 5 ml krwi pełnej na gradient histoplastyczny. Wirować przy 800 x g przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Zebrać obwodowe wielojądrzaste neutrofile (PMN) na granicy faz histopaque 1077 i 1119 (powyżej warstwy erytrocytów). Umieścić w 10 ml probówce z okrągłym dnem i uzupełnić do 10 ml PBSA. Delikatnie odwrócić probówkę i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Rozcieńczyć 7,5% roztwór BSA w stosunku 1:50 w 100 ml PBS (z chlorkiem wapnia i magnezu) do końcowego stężenia 0,15% (w/v; PBSA). Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml PBSA. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Zawiesić w 1 ml PBSA. Pobrać 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórek i dodać do 380 μl PBSA (rozcieńczenie 1:20). Policz komórki za pomocą hemocytometru lub celometru. Rozcieńczyć do wymaganego stężenia (1 x 106/ml dla filtrów Transwell i mikroszkiełka Ibidi) w PBSA. Zawiesinę neutrofili należy utrzymać w temperaturze pokojowej do czasu przeprowadzenia testu.

5. Montaż systemu przepływu

  1. Skonfiguruj system przepływu, jak pokazano na rysunku 1C. Włączyć grzałkę i ustawić ją na 37 °C. Podłączyć strzykawkę o pojemności 20 ml (wyjąć tłok) i strzykawkę o pojemności 5 ml do kranu 3-kierunkowego. Przymocuj kran do komory z pleksiglasu za pomocą taśmy Micropore.
  2. Zmierz i wytnij długi kawałek silikonowej rurki o grubości 2/4 mm (grubej), która odpowiada w przybliżeniu odległości między zaworem a kranem 3-drogowym. Wytnij kawałek rurki o długości 8 - 10 mm (cienkiej) i włóż do jednego końca grubej rurki. Przymocuj grubą stronę rurki do kranu 3-kierunkowego.
  3. Podłącz cienki koniec rurki do portu elektronicznego mikrozaworu 3-drogowego. To jest "zbiornik do mycia". Wytnij kawałek grubej i cienkiej rurki o długości 6 - 8 mm.
  4. Włóż cienką rurkę do jednego końca grubej rurki. Umieścić gruby koniec rurki na strzykawce o pojemności 2 ml (wyjąć tłok).
  5. Podłącz cienką końcówkę rurki strzykawki o pojemności 2 ml do portu w elektronicznym mikrozaworze, aby utworzyć "zbiornik na próbkę". Podłącz zawór do komory przepływu filtra, mierząc i przecinając długi kawałek cienkiej rurki, który jest odległością między mikrozaworem a środkiem stolika mikroskopu.
  6. W przypadku modelu z mikroprowadnicą przymocuj kawałek grubej rurki o grubości 8 - 10 mm do końca cienkiej rurki. Umieść łącznik w kształcie litery L na końcu grubej rurki. Spowoduje to połączenie z mikroszkiełkiem. W przypadku modelu filtra podłącz kawałek manometru Portex Blue Line o średnicy 8 - 10 mm, łączący rurkę z końcem cienkiej rurki.
  7. Umieść cienki koniec rurki na mikrozaworze. Jest to wspólne wyjście dla zbiorników do płukania i pobierania próbek. Napełnij zbiorniki PBSA. Zalać rurki, przepływając przez nie PBSA, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
  8. Podłączyć rurkę manometru do szklanej strzykawki o średnicy 29 mm (50 ml). Zalać strzykawkę, napełniając ją 10 ml PBSA. Odwrócić strzykawkę tak, aby koniec połączony z rurką był skierowany do góry i wypchnąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Uzupełnić 5 ml PBSA.
  9. Tylko w przypadku modelu z mikrosuwakiem przymocuj kawałek grubej rurki o grubości 10 - 12 mm do końca rurki manometru prowadzącej do szklanej strzykawki. Umieść łącznik w kształcie litery L na końcu grubej rurki. Umieścić szklaną strzykawkę w pompie strzykawkowej w celu infuzji/pobrania.
  10. Oblicz natężenie przepływu napełniania (Q) wymagane do wygenerowania żądanego naprężenia ścinającego ścianki (τw w Pascalu, Pa) wynoszącego 0,1 Pa (filtry Transwell) lub 0,05 Pa (mikroszkiełka Ibidi) za pomocą następujących wzorów:
    γw = (6.Q) / (w.h2)
    τ = n.γ
    Gdzie w = szerokość wewnętrzna, a h = głębokość wewnętrzna kanału przepływowego. n = lepkość przepływającego roztworu; PBSA wynosi n = 0,7 mPa.s. W przypadku komory przepływowej z filtrem z płytą równoległą szerokość (szer.) wynosi 4 mm, a głębokość (wys.) 0,133 mm. Głębokość komory może się nieznacznie różnić ze względu na różnice w grubości zastosowanej uszczelki Parafilm. W przypadku mikroszkiełek Ibidi szerokość wynosi 3,8 mm, a głębokość 0,4 mm.
    UWAGA: Ze względu na różnice w wymiarach kanału przepływowego i dynamice przechwytywania używamy różnych naprężeń ścinających dla modelu mikrosuwaka w porównaniu z modelem filtra6.

6. Ustawianie równoległej komory przepływu płyt z filtrami

  1. Wytnij kawałek Parafilmu (tego samego rozmiaru co szklane szkiełko nakrywkowe) za pomocą metalowego szablonu. Wytnij szczelinę o wymiarach 20 x 4 mm w Parafilmie (aby utworzyć kanał przepływowy) za pomocą metalowego szablonu. Użyj uszczelki, aby zaznaczyć kanał przepływu na szklanym szkiełku nakrywkowym.
  2. Dopasuj krawędzie 6-dołkowego filtra do szklanego szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że filtr zakrywa oznaczenia kanału przepływowego. Ostrożnie wytnij filtr za pomocą skalpela typu 10A.
  3. Ostrożnie przykryj filtr uszczelką Parafilm, upewniając się, że szczelina kanału przepływu znajduje się pośrodku filtra (Rysunek 1D). Użyj kawałka czystej chusteczki i wypchnij wszelkie bąbelki.
  4. Umieść szkiełko nakrywkowe we wgłębieniu dolnej płyty komory przepływowej z pleksiglasu. Umieść górną płytkę z pleksiglasu na górze uszczelki i skręć płytki ze sobą (Rysunek 1D).
  5. Przekręć kran 3-kierunkowy, aby umożliwić przepływ buforu myjącego (PBSA) przez zawór. Podłącz rurkę manometru do portu wlotowego górnej płyty Persex. Przeprowadź PBSA przez kanał przepływowy, aby umożliwić przejście pęcherzyków.
  6. Podłącz rurkę manometru z pompy strzykawkowej do portu wylotowego płytki pleksiglasowej. Ustawić pompę strzykawkową na napełnienie i nacisnąć przycisk uruchom. Wyczyść wszystkie PBSA, które kapały na górną płytę komory.
  7. Umieść komorę na stoliku mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym. Dostosuj ostrość, aby zwizualizować EC nad filtrami (Rysunek 1B).

7. Ustawianie mikroslajdów dla przepływu

  1. Umieść mikroszkiełko na stoliku mikroskopu kontrastowego z odwróconymi fazami. Podłącz złącze w kształcie litery L do portu wlotowego kanału. Uruchom PBSA przez kanał przepływu.
  2. Umieść złącze w kształcie litery L z pompy strzykawkowej w porcie wylotowym kanału. Ustawić pompę strzykawkową na napełnienie i nacisnąć przycisk uruchom. Wyczyść wszystkie PBSA, które kapały na mikroszkiełko. Dostosuj ostrość, aby zobrazować monowarstwę EC.

8. Perfuzja leukocytów nad komórkami śródbłonka

  1. Wsypać 2 ml oczyszczonych neutrofili do zbiornika na próbkę i pozostawić do ogrzania na 2 minuty. Przemyć śródbłonek PBSA przez 2 minuty.
  2. Przekręć zawór, aby perfuzjonować neutrofile nad śródbłonkiem. Dostarczyć bolus granulochłonny przez 4 minuty. Wyłącz zawór i wylej PBSA ze zbiornika do płukania przez pozostałą część eksperymentu.
  3. Upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie przechodzą przez kanał przepływowy w żadnym momencie podczas testu, ponieważ spowoduje to zakłócenie monowarstwy EC i spowoduje oderwanie przylegających neutrofili.

9. Rejestrowanie wychwytywania i zachowania neutrofili

  1. Rejestruj rekrutację neutrofili podczas przepływu neutrofili lub po perfuzji.
  2. Wykonaj wszystkie nagrania cyfrowe z co najmniej 5 - 10 pól w środku kanału przepływowego. Zidentyfikuj środek kanału, przesuwając cel na krawędź kanału w porcie wlotowym i identyfikując środek portu.
    1. W celu zarejestrowania podczas przepływu neutrofili, rób zdjęcia pojedynczego pola co 10 sekund przez 1 minutę. Poruszaj się wzdłuż kanału i nagrywaj kolejne pole przez 1 minutę. Powtórz tę czynność przez cały czas trwania bolusa.
    2. Aby zarejestrować po perfuzji, wykonaj 10-sekundowy zapis 5-10 pól w dół środka kanału przepływowego w celu oceny zachowania leukocytów (zwykle 2 minuty po zakończeniu bolusa neutrofilowego). Rób zdjęcia co sekundę w odstępie 10 sekund. Daje to wystarczająco dużo czasu na wychwycenie z przepływu i analizę zachowania przylegających neutrofili.
    3. Rejestruj pojedyncze pole zawierające co najmniej 10 transmigrujących neutrofili przez 5 minut, wykonując zdjęcia co 30 sekund. Można to wykorzystać do obliczenia prędkości migrowanych komórek (powyżej lub pod śródbłonkiem).
    4. Nagraj kolejną serię 10-sekundowych pól (zwykle 9 minut po perfuzji). Dzięki temu neutrofile mają czas na migrację przez monowarstwę śródbłonka.
    5. Zatrzymać pompę strzykawkową i wyjąć rurkę. Zdemontuj komorę przepływową i przepłucz zbiornik na próbkę oraz przewody. Powtórz dla kolejnych filtrów/kanałów mikroszkiełkowych.

10. Analiza rekrutacji i zachowania leukocytów

  1. Policz liczbę neutrofili w każdym polu podczas 10-sekundowych zapisów w 2-minutowym punkcie czasowym. Wszystkie komórki muszą być obecne w pierwszym drugim polu, aby mogły zostać policzone. Komórki, które znajdują się częściowo w polu po 2 stronach (np. górna/prawa granica) pola widzenia, są uwzględniane w zliczaniach, o ile pozostają w polu przez pełne 10 sekund.
  2. Obliczyć średnią liczbę przylegających neutrofili na pole. Zmierz długość i szerokość rejestrowanego pola. Oblicz powierzchnię pola. Oblicz, ile pól znajduje się w 1 mm2. Pomnóż średnią liczbę neutrofili przez liczbę pól w 1 mm2.
  3. Obliczyć całkowitą liczbę perfuzji neutrofili, mnożąc ilość perfuzji neutrofili (np. 2 x 106/ml*Q [np. 0,0999 ml/min dla komory z przepływem na płytkach równoległych]) przez czas trwania bolusa (np. 4 min).
  4. Podziel liczbę neutrofili/mm2 przez całkowitą liczbę perfuzji neutrofili, aby określić całkowitą liczbę komórek, które uległy przyłączenia (komórki przylegające/mm2 / 106 perfundowane).
  5. Oceń, czy przylegające neutrofile toczą się, mocno przylegają lub są transmigrowane (Dodatkowe wideo 1 i 2).
    1. Toczący się neutrofile ma jasną fazę i powoli przemieszcza się wzdłuż monowarstwy śródbłonka (1 - 10 μm/s; Film uzupełniający 1).
    2. Mocno przylegające komórki są jasne fazowo i związane z powierzchnią EC, albo pozostają nieruchome (tj. nie poruszają się podczas rejestracji), albo uległy zmianie kształtu i migrują po powierzchni EC (Rysunek 1Ei).
    3. Transmigrujący neutrofile są ciemne w fazie i znajdują się poniżej warstwy EC (ryc. 1Eii).
  6. Oblicz procent przylegających komórek, które są toczące się, nieruchome i transmigrujące. Alternatywnie, zachowanie neutrofili można wyrazić jako całkowitą liczbę komórek, które wykazują różne zachowania, stosując ten sam wzór, który służy do obliczania całkowitej adhezji (jak opisano w krokach 10.6 - 10.7).
    1. Zaznacz krawędź czołową toczącego się neutrofilu. Zaznacz krawędź wiodącą tej samej komórki na końcu 10-sekundowej sekwencji. Narysuj linię między tymi 2 punktami i zmierz odległość, jaką przebyła komórka.
    2. Podziel tę wartość przez czas trwania nagrania, w którym toczy się komórka (tj. 10 sekund). Spróbuj wybrać neutrofile, które są w terenie przez cały 10-sekundowy interwał.
  7. Aby obliczyć prędkość neutrofili migrujących nad powierzchnią (kształt, zmieniona faza, jasna) lub pod śródbłonkiem (ciemna faza), skorzystaj z 5-minutowego nagrania (Dodatkowe wideo 2).
    1. Narysuj kontur migrowanych komórek na początku sekwencji i śledź ich ruchy w całej sekwencji. Zanotuj pozycje X i Y środka ciężkości w każdym 1-minutowym interwale dla każdej komórki. Odejmij wartości pozycji X i Y od pierwszego obrazu sekwencji od wartości na drugim obrazie. Opiera się to na twierdzeniu Pitagorasa.
    2. Odejmij wartości od drugiego obrazu od trzeciego obrazu. Zrób to dla wszystkich obrazów w sekwencji. Podnieś wartości X i Y do kwadratu i dodaj je do siebie.
    3. Pierwiastek kwadratowy z wynikowej wartości. Oblicz prędkość dla każdej komórki, uśredniając prędkości obliczone dla każdego interwału minutowego. Śledź 10 migrujących neutrofili i oblicz średnią prędkość.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wstępnie przeanalizowano wpływ stymulacji EC za pomocą TNFα na rekrutację neutrofili z przepływu z wykorzystaniem modelu mikropreparatów Ibidi (Sekcja 7 - 9). W przypadku braku TNFα do monowarstwy śródbłonka przylegało niewiele lub wcale neutrofili (Rysunek 2A). Było to spodziewane, ponieważ nieleczone/spoczynkowe EC nie wykazują ekspresji niezbędnych cząsteczek adhezyjnych (selektyn) ani chemokin wspierających wiązanie25,26. W przeciwieństwie do tego, stymulacja cytokinami zn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj opisujemy dwa "naczyniowe" modele in vitro do badania rekrutacji krążących neutrofili przez stan zapalny śródbłonka. Główną zaletą tych modeli jest możliwość analizowania każdego kroku w kaskadzie adhezji leukocytów w kolejności, tak jak miałoby to miejsce in vivo. Wcześniej zaobserwowaliśmy zależny od dawki wzrost adhezji neutrofili i transmigracji przez stymulowany TNFα EC9,29. Opisujemy również, w jaki sposób oba modele można dostosować do badania wpływu komórek zrębu na rekrutację l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Pępowiny zostały pobrane dzięki pomocy Birmingham Women's Health Care NHS Trust. HMM był wspierany przez Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) oraz Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagenaza typu IaSigmaC2674Rozcieńczyć w 10 ml PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w podwielokrotnościach 1 ml.
Dulbecco's PBSSigmaD8662Z chlorkiem wapnia i magnezu. Przechowywać w sterylnym miejscu i przechowywać w temperaturze RT.
1X Średni M199Gibco31150-022Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
Siarczan gentamycynySigmaG1397Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Dodać do butelki M199 o pojemności 500 ml.
Ludzki naskórkowy czynnik wzrostuSigmaE9644Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w 10 i mikro; l podwielokrotności.
Surowica płodu cielęcego (FCS)SigmaF9665FCS musi być testowana partiami w celu zapewnienia wzrostu i żywotności wyizolowanego EC. Inaktywować termicznie w temperaturze 56 °C. Przechowywać w 10 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
Amfoterycyna BGibco15290-026Silna i staje się toksyczna w ciągu tygodnia, dlatego co tydzień należy przygotowywać świeżą, kompletną pożywkę HUVEC. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w podwielokrotnościach 1 ml.
HydrokortyzonSigmaH0135Zapas jest w etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w 10 i mikro; l podwielokrotności.
Kolagenaza typu IISigmaC6885Rozcieńczyć materiał w PBS do końcowego stężenia 100 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w 100 i mikro; l podwielokrotności.
HialuronidazaSigmaH3631Rozcieńczyć materiał w PBS do końcowego stężenia 20 000 U/ml. Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w 100 i mikro; l podwielokrotności.
100 &mikro; m sitko do komórek do probówki o pojemności 50 mlScientific Lab Supplies (SLS)352360Można również stosować inne dostępne na rynku sitka komórkowe (np. Greiner bio-one).
BiosuraLM-D1102/500niskiej zawartości glukozyCiepła w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
Mieszanina penicyliny/streptomycynySigmaP4333Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C w podwielokrotnościach 1 ml.
Kolba do hodowli tkankowych o pojemności 25 mlSLS353109
Kolba do hodowli tkankowych o pojemności 75 mlSLS353136
Fiolka z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi szpiku kostnegoLonzaPT-2501Po przybyciu przechowywać w ciekłym azocie. Komórki znajdują się w przejściu 2 po przybyciu, ale są oznaczone jako przejście 0. Pobrać do przejścia 3 i przechowywać w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania.
Mezenchymalne podłoże do wzrostu komórek macierzystych (MSCGM)LonzaPT-3001Ciepłe w 37 & stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem. Do barwienia Cell Tracker Green użyj podłoża bez FCS.
Roztwór EDTA (0,02%)SigmaE8008Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ciepło w temperaturze 37 stopni; C kąpiel wodna przed użyciem.
Roztwór trypsynySigmaT4424Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C w podwielokrotnościach 2 ml. Rozmrozić w temperaturze pokojowej i natychmiast zużyć.
CryovialsGreiner bio-one2019-02Przechowywać na lodzie przed dodaniem przed dodaniem zawiesiny komórkowej.
Mr. Frosty Pojemnik do zamrażaniaNalgene5100-0001Sklep w RT. Podczas dodawania kriowiali z komórkami przechowywać w temperaturze -80 & deg; C przez 24 godziny przed przeniesieniem komórek do ciekłego azotu.
Ibidi u-Slide VI (0,4), poddany obróbce T/C, sterylnyIbidiIB-80606Alternatywne modele obejmują szklane kapilary, biochipy Cellix (www.cellixltd.com), płytki BioFlux (www.fluxionbio.com/bioflux/) i komory z równoległym przepływem płytek GlycoTech (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker zielony barwnikLife technologiesC2925Sklep w 5 i mikro; l podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć w 5 ml podgrzanego roztworu (w temperaturze 37 °C; C) MSCGM.
Komory do liczenia komórekNexcelomSD-100Alternatywnie można użyć hemocytometru.
Celometr automatyczny licznik komórek T4NexcelomAuto T4-203-0238
Czynnik martwicy nowotworu i alfa; (TNF&alfa;)R& D Systems210-TA-100Rozcieńczyć materiał w PBS do końcowego stężenia 100 000 U/ml. Przechowywać w temperaturze -80 ° C w 10 i mikro; l podwielokrotności.
6-dołkowy, 0,4 i mikro; m Filtry PET TranswellSLS353090
K2-EDTA w tubkach 10mlSarstedtSklep w RT.
Histopaque 1119Sigma11191Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przed użyciem ogrzać do RT.
Histopaque 1077Sigma10771Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przed użyciem rozgrzać do temperatury RT.
10 ml probówka z okrągłym dnemAppleton WoodsSC211 142 AS
7,5% BSA Fraction V solutionLife technologies15260-037Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Strzykawki Plastipak 20 mlBD falcon300613
5 ml Strzykawki PlastipakBD falcon302187
2 ml Strzykawki PlastipakBD falcon300185
3M hipoalergiczna taśma chirurgiczna 9 m x 2,5 cmMicropore1530-1Służy do mocowania strzykawki do ścianki komory z pleksiglasu.
Rurka z gumy silikonowej, średnica wewnętrzna/średnica zewnętrzna (ID/OD) 1/3 mm (cienka rurka)Fisher ScientificFB68854Przytnij rurkę silikonową do odpowiedniego rozmiaru. Wszystkie rurki prowadzące bezpośrednio do mikrozaworu elektronicznego muszą być cienkie.
Rurka z gumy silikonowej ID/OD 2/4 mm (gruba rurka)Rurka
Portex Blue LineSmiths200/495/200Rurka prowadząca do pompy strzykawkowej.
3-drogowy kranBOC Ohmeda AB
Szklana strzykawka 50 ml do pompyPopper Micromate550962Przed użyciem należy go zagruntować, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza.
Szkiełko nakrywkoweszklane Raymond A Lamb26 x 76 mm na zamówienie. Numer działki 2440980.
Uszczelka parafilmowaAmerican National Can CompanyWytnij kawałek parafilmu o wymiarach 26 x 76 mm za pomocą aluminiowego szablonu i wytnij w nim szczelinę o wymiarach 20 x 4 mm za pomocą skalpela 10a. Grubość uszczelki wynosi około 133 &mikro;m.
Dwie równoległe płyty z pleksiglasuTechnologii Stosowanej WolfsonSpecjalnie zaprojektowana komora składająca się z równoległych płyt połączonych ze sobą za pomocą 8. Dolna płyta ma wyciętą pośrodku szczelinę obserwacyjną oraz płytkie wgłębienie wyfrezowane tak, aby zapewnić miejsce na szkiełko nakrywkowe, filtr i uszczelkę. Górna płyta z pleksiglasu ma otwór wlotowy i wylotowy umieszczony nad kanałem przepływowym.
Elektroniczny mikrozawór 3-drogowy z minimalną martwą przestrzeniąLee Products Ltd.LFYA1226032HElektronicznie podłączony do 12-woltowego zasilacza prądu stałego.
Pompa strzykawkowa do infuzji/pobierania (PHD2000)Aparat Harvard70-2001Ustaw średnicę na 29 mm i szybkość napełniania (przepływu).
Łącznik w kształcie litery LLabhutLE876Do podłączenia do portów wlotowych i wylotowych na kanale mikrosuwakowym Ibidi.
Kamera wideoQimaging01-QIC-F-M-12-CPodłączona do komputera, który umożliwia nagrywanie cyfrowych filmów.
Image-Pro Plus 7.0Media Cybernetics41N70000-61592Do analizy danych. Ręcznie oznacz komórki, wyświetlając różne zachowania. Śledź komórki do analizy prędkości toczenia i migracji.
Zapoznaj się z kartami katalogowymi produktów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zagrożeń związanych z używaniem opisywanych tutaj odczynników.
DMEM o manometru Fisher Scientific FB68855 Laboratorium

Bibliografia

  1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
  4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
  5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
  6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
  7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
  8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
  9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
  10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
  11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
  12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
  13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
  14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177(2009).
  15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
  16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
  17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
  18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
  19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
  20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
  21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
  22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
  23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
  24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
  25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
  26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
  27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
  28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
  29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
  30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rekrutacja leukocyt wmezenchymalne kom rki macierzystekom rki r db onkatest adhezji w przep ywieadhezja neutrofilistymulacja TNF alfamodel mikropreparatowymodel filtracyjnymikroskopia kontrastowa

Powiązane artykuły