Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Podsumowanie

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Streszczenie

Nabłonek przewodu pokarmowego jest stale odnawiany, gdy się przewraca. Proces ten jest wywoływany przez proliferację jelitowych komórek macierzystych (ISC) i potomstwa, które stopniowo migrują i różnicują się w kierunku czubka kosmków. Procesy te, niezbędne dla homeostazy przewodu pokarmowego, zostały szeroko zbadane przy użyciu wielu podejść. Technologie ex vivo, zwłaszcza pierwotne hodowle komórkowe, okazały się obiecujące dla zrozumienia funkcji nabłonka jelitowego. Stworzono długoterminowy system hodowli pierwotnej krypt jelitowych myszy w celu wygenerowania trójwymiarowych organoidów nabłonkowych. Te struktury nabłonkowe zawierają domeny przypominające krypty i kosmki, przypominające normalny nabłonek jelitowy. Powszechnie nazywane "enteroidami", gdy pochodzą z jelita cienkiego i "kolonoidami", gdy pochodzą z okrężnicy, różnią się od organoidów, które również zawierają tkankę mezenchymy. Ponadto te enteroidy / kolonoidy w sposób ciągły wytwarzają wszystkie typy komórek znajdujące się normalnie w nabłonku jelitowym. Ten system hodowli narządowej in vitro szybko staje się nowym złotym standardem w badaniach biologii jelitowych komórek macierzystych i fizjologii komórek nabłonkowych. Technologia ta została niedawno przeniesiona do badań nad ludzkimi jelitami. Ustanowienie enteroidów nabłonkowych i kolonoidów pochodzenia ludzkiego z jelita cienkiego i okrężnicy było możliwe dzięki wykorzystaniu specyficznych pożywek hodowlanych, które umożliwiają ich wzrost i utrzymanie w czasie. W tym miejscu opisujemy metodę tworzenia systemu kryptograficznego jelita cienkiego i okrężnicy na podstawie całej tkanki ludzkiej lub biopsji. Kładziemy nacisk na metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okrężnic.

Wprowadzenie

Nabłonek wyściółkowy przewodu pokarmowego jest w ciągłej odnowie. Proces ten jest wywoływany przez proliferację jelitowych komórek macierzystych (ISC), które w sposób ciągły wytwarzają potomstwo, które szybko zastępuje nabłonek jelitowy w miarę jego przewracania się. Przedział proliferacyjny, na który składają się ISC, jest ograniczony do dna krypt. ISC dają początek potomstwu, które ostatecznie różnicuje się w linie absorpcyjne lub wydzielnicze. Przemieszczając się z krypty na kosmki lub nabłonek powierzchniowy, komórki różnicują się stopniowo, migrując w górę przed złuszczeniem do światła¹. ISC dają początek wszystkim typom komórek nabłonka jelitowego, w tym enterocytom, komórkom mikrofałdowym, komórkom enteroendokrynnym, komórkom kubkowym, komórkom kępki i komórkom Panetha. Okrężnica charakteryzuje się wydłużonymi kryptami złożonymi głównie z kolonocytów i komórek kubkowych, z rozproszonymi komórkami enteroendokrynnymi i kępkowymi².

Systemy hodowli ex vivo stanowią obiecujące narzędzie do badania utrzymania ISC i homeostazy tkanek jelitowych. Trudno jest jednak polegać na technologiach hodowli tkankowych, ponieważ warunki fizjologiczne nie są w pełni odtworzone, a mikrośrodowisko nabłonkowe często ulega zmianie^3,4. Dużym postępem w dziedzinie ISC było opracowanie technik hodowli tkankowych w celu utrzymania i namnażania poszczególnych mysich ISC przy użyciu zdefiniowanych czynników wzrostu w celu zastąpienia normalnych sygnałów niszy jelitowej. Długoterminowe warunki hodowli zostały opisane przez Sato i wsp., w których pojedyncze krypty lub wyizolowane komórki macierzyste z nabłonka jelitowego rosną, tworząc trójwymiarowe struktury nabłonkowe zawierające wiele domen podobnych do krypt ^5-7. Te trójwymiarowe struktury podlegają zdarzeniom rozszczepienia, aby stale się rozszerzać. Co ciekawe, wszystkie typy komórek jelitowych specyficzne dla tkanki pochodzenia są wytwarzane, a także są wytłaczane do światła⁸. Korzystając z modyfikacji tego systemu, organoidy nabłonkowe mogą być generowane z żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy. Mówiąc dokładniej, organoidy nabłonkowe z jelita cienkiego to enteroidy⁹, a te z okrężnicy to kolonoidy^9,10. Te nabłonkowe systemy hodowli organoidów wykorzystano do przetestowania zdolności izolowanych pojedynczych komórek do funkcjonowania jako komórki macierzyste in vitro, testując w ten sposób "macierzystość" izolowanych komórek^5,6,10-15. Inni badacze używali zarówno enteroidów, jak i kolonoidów do badania funkcji poszczególnych komórek nabłonkowych^16-21. W ten sposób hodowle enteroidów i kolonoidów mogą być wykorzystywane do oceny funkcji zarówno komórek macierzystych, jak i niemacierzystych oraz dostarczają nowych informacji na temat podstawowych interakcji komórkowych w jelitach.

W 2011 roku Sato i współpracownicy stworzyli długoterminową hodowlę organoidów nabłonkowych pochodzących z ludzkiego jelita cienkiego i okrężnicy^22,23. Oprócz różnic w składzie pożywki, ludzkie enteroidy nabłonkowe i kolonoidy wykazują te same cechy, co ich mysi odpowiedniki. Ponadto mogą być generowane z chorych tkanek, takich jak przełyk Barretta, gruczolak lub gruczolakorak oraz mukowiscydoza^22,24. Ludzkie enteroidy stanowią cenny system do badania biologii jelitowych komórek macierzystych i nabłonkowej błony śluzowej oraz służą jako nowy system eksperymentalny do badania zarówno prawidłowej, jak i nieprawidłowej fizjologii przewodu pokarmowego³.

Tutaj opisujemy metody tworzenia enteroidów i kolonoidów z ludzkich krypt jelita cienkiego i okrężnicy (Rysunek 1). W niniejszym przeglądzie metodologicznym kładziemy nacisk na zbiór krypt z całych tkanek i biopsji. Podsumowujemy modalności hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i kolonoidów oraz możliwe strategie eksperymentalne przeprowadzane przez ten model.

Protokół

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Wszystkie eksperymenty z użyciem tkanek ludzkich opisane tutaj zostały zatwierdzone przez IRB w CCHMC (IRB #2012-2858; #2014-0427). Świadomą zgodę na pobranie, przechowywanie i wykorzystanie próbek uzyskano od dawców z CCHMC.

1. Przygotowanie do kultury

UWAGA: Wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli 1.

1. Przygotować roztwór podstawowy EDTA w następujący sposób: przygotować 0,5 M kwas etylenodiaminotetraoctowy o pH 8 (EDTA) w ultraczystym_H2O, przefiltrować wysterylizowany filtrem 0,22 μm. Opcjonalnie roztwór podstawowy EDTA należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony.
2. Przygotować bufor chelatujący w następujący sposób: zmieszać 2% sorbitolu, 1% sacharozy, 1% albuminy surowicy bydlęcej frakcji V (BSA) i 1x roztwór gentamycyny/amfoterycyny w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco bez Ca²⁺ i Mg²⁺ (DPBS), przefiltrować wysterylizowany filtrem 0,22 μm. Przygotować bufor chelatujący na świeżo.
3. Przygotować pożywkę kondycjonowaną Wnt-3A w następujący sposób: Pożywka kondycjonowana Wnt-3A jest wytwarzana we własnym zakresie przy użyciu linii komórkowej L Wnt-3A zgodnie z instrukcjami producenta (ATCC, CRL-2647). Uzupełnij pożywkę 2 mM glutaminą, 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny, 100 g/ml streptomycyny, 1 suplementem N2, 1 suplementem B27, 1% BSA i przefiltruj wysterylizowany filtrem 0,22 μm.
   UWAGA: Przetestuj każdą partię pod kątem aktywności Wnt za pomocą testu TOPflash. Użyj stabilnej linii komórkowej HEK293 TOPflash (laboratorium Hansa Cleversa) z zestawem do oznaczania lucyferazy Renilla zgodnie z instrukcjami producenta. Znormalizować test TOPflash za pomocą 100 ng/ml ludzkiego rekombinowanego Wnt-3A. Potwierdzić co najmniej 10-krotną zmianę aktywności kondycjonowanego podłoża w porównaniu z kontrolą. Podziel świeżą pożywkę kondycjonowaną Wnt-3A na 10 ml podwielokrotności w 15 ml stożkowych probówkach i zamrażaj w temperaturze -20°C przez okres do 6 miesięcy. Rozmrożone porcje należy przechowywać do 5 dni w temperaturze 4°C bez utraty aktywności.
4. Przygotuj ludzkie podłoże dla minijelit w następujący sposób: Uzupełnij zaawansowaną pożywkę DMEM/F12 z 2 mM glutaminy, 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny, 100 g / ml streptomycyny, 1 suplementem N2, 1 suplementem B27, 1% BSA i filtrem sterylizowanym filtrem 0,22 μm.
   UWAGA: Podziel świeżą ludzką pożywkę z minijelita na 10 ml porcji w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i zamrażaj w temperaturze -20°C przez okres do 3 miesięcy. Rozmrożone porcje należy przechowywać do 5 dni w temperaturze 4°C bez utraty aktywności.
5. Przygotować kompletną pożywkę dla ludzkiego minijelita w następujący sposób: przygotować świeże podłoże przed hodowlą krypt lub zmianą pożywki na pożywkę dla ludzkiego minijelita (patrz 1.4) uzupełnioną 50% pożywką kondycjonowaną Wnt-3A (patrz 1.3), 1 μg/ml R-spondyny 1 (rozcieńczenie 1:1 000 1 mg/ml podstawy), 100 ng/ml Noggin (rozcieńczenie 1:1 000 100 g/ml podstawy), 50 ng/ml EGF (rozcieńczenie 1:10 000 500 μg/ml podstawy), 500 nM A-83-01 (rozcieńczenie 1:1 000 dla 500 M zapasów), 10 μM SB202190 (1:3 000 rozcieńczenie dla 30 mM zapasów), 10 nM [Leu]15-Gastrin 1 (rozcieńczenie 1:10 000 dla 100 μM), 10 mM nikotynamidu (1:100 rozcieńczenie 1 M zapasu) i 1 mM N-acetylocysteiny (1:1 000 rozcieńczenie 1 M zapasu).
   UWAGA: Przechowuj kompletne ludzkie podłoże minijelitowe do 2 dni w temperaturze 4°C bez utraty aktywności.

2. Izolacja krypty od całej tkanki

UWAGA: Z pobrania tkanek ważne jest, aby utrzymać próbkę w soli fizjologicznej. Zaleca się trzymanie tkanki na lodzie podczas transportu. Przygotowanie próbki do izolacji krypty powinno być wykonane jak najszybciej.
UWAGA: Wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli 1, narzędzia, sprzęt i materiały eksploatacyjne są wymienione w Tabeli 2.

1. Przygotuj wszystkie odczynniki przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie i wstępnie inkubować 24-dołkową płytkę w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37°C.
   UWAGA: Alternatywnie należy wykonać cienką warstwę matrycy membrany podstawnej, używając 15 μl/dołek w środku płytki 24-dołkowej i umieścić ją w inkubatorze CO_{2 w} temperaturze 37°C. Ten fakultatywny krok utrzymuje macierz błony podstawnej jako kroplę podczas polimeryzacji.
2. Umyj tkankę lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco bez Ca²⁺ i Mg²⁺ (DPBS). Kontynuuj, aż zawartość DPBS będzie jasna.
3. Za pomocą szpilek o średnicy 0,2 mm zabezpiecz chusteczkę na szklanej szalce Petriego pokrytej silikonem wypełnionej lodowatym DPBS. Rozciągnij i przypnij tkankę płasko stroną śluzówkową skierowaną do góry.
4. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń leżącą błonę śluzową z błony podśluzowej i tkanki łącznej za pomocą nożyczek do mikropreparowania i kleszczyków z drobnym zakrzywionym punktem (ryc. 2A, B).
5. Rozciągnij i przypnij rozciętą błonę śluzową płasko na szklanej szalce Petriego pokrytej silikonem, stroną z błoną śluzową skierowaną do góry. Pozostałą błonę podśluzową i tkankę łączną można wyrzucić lub wykorzystać do dalszych eksperymentów (ryc. 2C).
6. Delikatnie zeskrob powierzchnię błony śluzowej zakrzywionymi kleszczami. Ten krok jest konieczny, aby poprawić jakość preparatu.
   1. W przypadku jelita cienkiego delikatnie zeskrob błonę śluzową, aby usunąć kosmki.
   2. W przypadku okrężnicy delikatnie zeskrob błonę śluzową, aby usunąć śluz i zanieczyszczenia.
7. Umyj błonę śluzową 3-4 razy lodowatym buforem chelatacyjnym, aby usunąć kosmki i zanieczyszczenia.
8. Przykryj błonę śluzową świeżo przygotowanym 2mM buforem chelatacyjnym EDTA (200 μl 0,5 M EDTA w 49,6 ml buforu chelatacyjnego).
9. Umieść szalkę Petriego na lodzie i delikatnie potrząsaj przez 30 minut na poziomym wytrząsarce orbitalnej.
10. Umyj tkankę 3-4 razy lodowatym buforem chelatacyjnym bez EDTA. Po umyciu pozostaw błonę śluzową w lodowatym buforze chelatacyjnym.
11. Przetwarzaj błonę śluzową pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą zakrzywionych i cienkich kleszczy. Delikatnie zeskrob błonę śluzową, aby uwolnić krypty jelitowe za pomocą zakrzywionych kleszczy.
12. Delikatnie usunąć zawiesinę krypty z płytki Petriego za pomocą pipety i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: sprawdź tkankę, aby upewnić się, że prawie wszystkie krypty zostały usunięte z błony śluzowej.
13. Przefiltruj zawiesinę krypt przez siatkę 150 μm 2 razy.
    UWAGA: sprawdzić przepływ pod kątem wzbogacenia krypty pod mikroskopem (rysunek 2D).
14. Odwirować zawiesinę krypty przez 5 minut w temperaturze 50 xg, 4°C. Odrzucić supernatant.
15. Zawiesić osad w 5 ml lodowatego buforu chelatacyjnego.
16. Policz liczbę krypt na 10 μl kropli z zawiesiny z kroku 2.15. Przenieść liczbę krypt potrzebną do poszycia do probówki okrągłodennej o pojemności 5 ml. Użyj od 200 do 500 krypt na studzienkę 24-dołkowego naczynia, aby ustalić enteroidy lub kolonoidy.
17. Odwirować frakcję krypty przez 10 minut w temperaturze 150 g w temperaturze 4°C. Usunąć supernatant.
18. Wykorzystaj krypty do późniejszej kultury.

3. Izolacja krypty od biopsji

1. Przygotuj wszystkie odczynniki przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie i wstępnie inkubować 24-dołkową płytkę w inkubatorze CO_{2 w} temperaturze 37°C.
2. Przemyć biopsję lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem Dulbecco bez Ca²⁺ i Mg²⁺ (DPBS).
3. Za pomocą szpilek o średnicy 0,1 mm zabezpiecz biopsję na pokrytej silikonem szklanej szalce Petriego wypełnionej lodowatym DPBS. Rozciągnij i przypnij błonę śluzową płasko stroną błony śluzowej skierowaną do góry (ryc. 2E).
4. Delikatnie zeskrob powierzchnię błony śluzowej zakrzywionymi kleszczami, aby usunąć kosmki i zanieczyszczenia. Ten krok jest konieczny, aby poprawić jakość preparatu.
5. Umyj biopsję 3-4 razy lodowatym buforem chelatacyjnym, aby usunąć kosmki i zanieczyszczenia.
6. Przykryj biopsję świeżo przygotowanym buforem chelatacyjnym 2mM EDTA (200 μl 0,5 M EDTA w 49,8 ml buforu chelatacyjnego).
7. Umieść szalkę Petriego na lodzie i delikatnie potrząsaj przez 30 minut na poziomym wytrząsarce orbitalnej.
8. Przemyj biopsję 3-4 razy lodowatym buforem chelatacyjnym bez EDTA. Po umyciu pozostaw biopsję w lodowatym buforze chelatacyjnym.
9. Wykonaj biopsję pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą zakrzywionych i cienkich kleszczy. Delikatnie zeskrob błonę śluzową, aby uwolnić krypty jelitowe za pomocą zakrzywionych kleszczy.
10. Delikatnie usunąć zawiesinę krypty z płytki Petriego za pomocą pipety i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: sprawdź tkankę, aby upewnić się, że prawie wszystkie krypty zostały usunięte z błony śluzowej.
11. Przefiltruj zawiesinę krypty przez nylonową siatkę 150 μm 2 razy.
    UWAGA: sprawdzić przepływ pod kątem wzbogacenia krypty pod mikroskopem.
12. Odwirować zawiesinę krypty przez 5 minut w temperaturze 50 xg, 4°C. Odrzucić supernatant.
13. Zawiesić osad w 1 ml lodowatego buforu chelatacyjnego. Przenieść zawiesinę krypty do probówki o pojemności 1,5 ml do mikrofuge.
14. Odwirować frakcję krypty przez 10 minut w temperaturze 150 x g, 4°C. Usunąć supernatant.
15. Wykorzystaj krypty do późniejszej kultury.

4. Kultura krypty w matrycy błony podstawnej

1. Używając wstępnie schłodzonych końcówek pipet, ponownie zawiesić osad krypty (z kroku 2.18 lub 3.15) w matrycy błony podstawnej (200 do 500 krypt/50 μl matrycy błony podstawnej).
2. Na wstępnie podgrzaną płytę nanieść 50 μl zawiesiny krypty w matrycy błony podstawnej na studzienkę. Powoli wysuń matrycę membrany podstawnej na środku studni.
3. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C i 5% CO₂ na 30 minut, aby umożliwić pełną polimeryzację matrycy błony podstawnej.
4. Na matrycę błony podstawnej nałożyć 500 μl kompletnego ludzkiego podłoża minijelitowego uzupełnionego 2,5 μM CHIR99021 (rozcieńczenie 1:4 000 10 mM zapasu) i 2,5 μM tiazowiwiny (rozcieńczenie 1:4 000 10 mM).
5. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO_{2 .}
6. Co 2 dni należy wymieniać pożywkę na świeżą, kompletną pożywkę z ludzkiego minijelita.

5. Pasażowanie hodowanych enteroidów i kolonoidów.

UWAGA: Enteroidy pasażowe i kolonoidy co 7 do 10 dni po początkowym posiewie. Ogólnie rzecz biorąc, podziel jedną studnię na 3 do 4 dołków.

1. Przygotuj wszystkie odczynniki przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozmrozić matrycę błony podstawnej na lodzie i wstępnie inkubować 24-dołkową płytkę w inkubatorze CO_{2 w} temperaturze 37°C.
2. Usuń podłoże za pomocą sterylnych końcówek i nałóż 1 ml lodowatego DPBS.
3. Pipetować tam i z powrotem za pomocą końcówki o pojemności 1 000 μl. Przenieść roztwór do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
4. Na 1 ml pożywki dodać 2 ml ludzkiego podłoża dla minijelit uzupełnionych 5% FBS.
5. Odwirowywać roztwór przez 5 minut w temperaturze 50 x g, 4°C. Odrzucić supernatant.
6. Zawiesić osad z 2 ml enzymu dysocjacji komórek uzupełnionego 10 μM Y-27632 (rozcieńczenie 1:1,000 10 mM zapasu). Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37°C w łaźni wodnej.
7. Oddzielić grudki komórek za pomocą strzykawki Luer-Lock o pojemności 3 ml wyposażonej w igłę 18 G do napełniania/napełniania. Delikatnie odpipetować roztwór w tę i z powrotem za pomocą strzykawki 10 razy.
8. Odwirowywać zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 500 x g, 4°C. Odrzucić supernatant.
9. Używając wstępnie schłodzonych końcówek pipet, ponownie zawiesić osad komórkowy w matrycy błony podstawnej.
10. Na wstępnie podgrzaną płytę nanieść 50 μl zawiesiny krypty w matrycy błony podstawnej na studzienkę. Powoli wysuń matrycę membrany podstawnej na środku studni.
11. Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO₂ na 20 minut, aby umożliwić pełną polimeryzację matrycy błony podstawnej.
12. Na matrycę błony podstawnej nałożyć 500 μl kompletnego ludzkiego podłoża dla minijelit uzupełnionego 10 μM Y-27632 (rozcieńczenie 1:1,000 10 mM zapasu).
13. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO_{2 .}
14. Po 2 dniach zastąp pożywkę świeżą, kompletną pożywką dla ludzkiego minijelita uzupełnioną 10 μM Y-27632 (rozcieńczenie 1:1,000 10 mM bulionu). Następnie co drugi dzień należy zastępować pożywkę świeżą, kompletną pożywką z ludzkiego minijelita.

6. Zamrażanie hodowanych enteroidów i kolonoidów

UWAGA: Zazwyczaj zamraża się jeden dobrze w 2-3 kriowiałach.

1. Powtórz kroki od 5.1 do 5.8.
2. Ponownie zawiesić granulat zimnym środkiem zamrażającym. Przenieść 1 ml roztworu zamrażającego do oznakowanego kriowialu. Umieść kriowial w pojemniku do zamrażania zawierającym 500 ml alkoholu izopropylowego.
3. Przenieś pojemnik do zamrażania do zamrażarki o temperaturze 80°C na 24 godziny, a następnie przenieś kriowial do przechowywania ciekłego azotu.
   UWAGA: Enteroidy i kolonoidy należy przechowywać przez okres do 1 roku.

Wyniki

Rycina 2D przedstawia typowy przykład świeżo wyizolowanych krypt z całej tkanki (Rycina 2D). Liczba krypt wyizolowanych z biopsji jest niższa niż w przypadku całej tkanki. Używając standardnych kleszczy biopsyjnych z igłą, zazwyczaj pobieramy dwa fragmenty biopsji podczas jednego przejścia. Każdy fragment biopsji daje powierzchnię 10 mm² ze średnią liczbą od 50 do 100 krypt na biopsję (Rycina 2F).

Po hodowli w macierzy błony podstawnej krypty zaokrąglają się, tworząc enterosfery w przypadku jelita cienkiego oraz kolonosfery w przypadku okrężnicy. Pączkowanie krypt zazwyczaj następuje w ciągu 5 do 6 dni po wysianiu. Niemniej jednak nie jest rzadkością obserwowanie tworzenia się sfer przez enteroidy (enteroids) lub kolonoidy (colonoids) w macierzy błony podstawnej (Rycina 3A-C; Film 1). Pasażowanie można przeprowadzić po 7 dniach, w zależności od wielkości enteroidów. Enteroidy lub kolonoidy otrzymane z biopsji przechodzą taki sam rozwój w hodowli. Jednak ze względu na mniejszą gęstość krypt podczas wysiewania, pasażowanie zazwyczaj wykonuje się po 10 do 12 dniach hodowli (Rycina 4a,b). Hodowle enteroidów i kolonoidów powiększają się w sposób powtarzalny.

Zarówno enteroidy, jak i kolonoidy posiadają stronę światłową i są wyścielone nabłonkiem (Rycina 5A, B). W obrębie enteroidów można zaobserwować komórki proliferujące, które znajdują się w wierzchołkach pączków (Rycina 5C, D). Obrazowanie konfokalne enteroidów barwionych na E-kadherynę (Ecad) ukazuje komórki nabłonkowe (Rycina 5E).

Zarówno enteroidy, jak i kolonoidy mogą być hodowane z tkanek pobranych od pacjentów z zaburzeniami genetycznymi/wrodzonymi. Rysunek 6 przedstawia reprezentatywne enteroidy pochodzące od pacjenta z mukowiscydozą (Rysunek 6A) oraz enteroidy z tufting enteropathy wynikającej z wrodzonej mutacji w genie cząsteczki adhezyjnej komórek nabłonkowych (EpCAM) (Rysunek 6B). Poza defektem genetycznym enteroidy nie wykazują różnic w stanie podstawowym.

Rycina 1. Schemat dysocjacji krypt oraz generowania ludzkich enteroidów i kolonoidów w hodowli. Krypty (z ludzkiego jelita cienkiego lub grubego) są izolowane poprzez chelatowanie EDTA. Hodowane krypty tworzą enteroidy w przypadku jelita cienkiego oraz kolonoidy w przypadku jelita grubego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 2. Proces preparowania w celu izolacji krypt. (A) Próbka jelita cienkiego zostaje rozciągnięta i przypięta na płasko w szalce Petriego powleczonej silikonem. (B) Błona śluzowa zostaje oddzielona od leżącej pod nią błony podśluzowej. (C) Preparowana błona śluzowa zostaje rozciągnięta i przypięta na płasko w szalce Petriego powleczonej silikonem. (D) Po chelatacji EDTA krypty zostają wyizolowane z tkanki. (E) Jedna biopsja zostaje rozciągnięta i przypięta na płasko w szalce Petriego powleczonej silikonem. (F) Po chelatacji EDTA krypty zostają wyizolowane z biopsji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3. Hodowla krypt oraz generowanie ludzkich enteroidów i kolonoidów z tkanki całkowitej. (A) Krypty jelita czczego wysiane w macierzy błony podstawnej po izolacji. Krypty zamykają się po 3 do 4 hr, a po tym czasie zaczynają pęcznieć, tworząc enterosfery. W 7 dniu powstają enteroidy jelita czczego. (B) Po izolacji i hodowli krypty jelita krętego zachowują się podobnie do krypt jelita czczego i tworzą enteroidy jelita krętego. (C) Krypty jelita grubego wysiane w macierzy błony podstawnej po izolacji. Krypty zamykają się i po 7 dniach tworzą kolonoidy (Paski skali: 100 µm). Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4. Hodowla krypt oraz generowanie ludzkich enteroidów i kolonoidów z biopsji. (A) Krypty dwunastnicy wysiane w macierzy błony podstawnej po izolacji. Krypty zamykają się po 3 do 4 hr, a następnie zaczynają pęcznieć, tworząc enterosfery. W 7 dniu formują się enteroidy. (B) Po izolacji i hodowli krypty okrężnicy są wysiewane w macierzy błony podstawnej. Krypty zamykają się, tworząc kolonosfery, a po 7 dniach kolonoidy (Paski skali: 100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5. Linie komórkowe jelita w ludzkich enteroidach. (A) Ludzki enteroid po 6 dniach hodowli. (B) Przekroje enteroidów z (A) barwione hematoksyliną i eozyną wykazują wyściółkę nabłonkową (Paski skali: 100 µm). (C-D) Obrazowanie konfokalne enteroidów po barwieniu EdU (magenta) wykazuje obecność komórek proliferujących. (E) Obrazowanie konfokalne enteroidów wykazuje obecność: E-kadheryny dla komórek nabłonkowych (ECAD, zielony) (Pasek skali: 50 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 6. Hodowla krypt i generowanie ludzkich enteroidów z tkanki chorobowej. (A) Enteroidy uzyskane z preparatu pacjenta z mukowiscydozą. (B) Enteroidy uzyskane z preparatu pacjenta z wrodzoną enteropatią kępkową (Paski skali: 100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Film 1. Tworzenie ludzkiego enteroidu z enterosfery w kulturze. Film z przyspieszonym zapisem z 32 godzin przedstawia enterosferę wyhodowaną z ludzkiego jelita cienkiego, która kurczy się, tworząc enteroid w kulturze. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

Nazwa odczynnika	Firma	Numer katalogowy	Rozpuszczalnik	Stężenie roztworu stokowego	Stężenie końcowe	Komentarz
bufor solny fosforanowy Dulbecco z jonami wapnia (DPBS Ca)2+, Mg2+ wolny od (DPBS)	Technologie życia; Gibco	14190-144	-	-	1x
Etylenodiamina kwas etylenodiaminooctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	431788	ultraczysta woda destylowana2O	0,5 M	2 mM
Sorbitol	Fischer Scientific	BP439-500	DPBS	Proszek	2%
Sacharoza	Fischer Scientific	BP220-1	DPBS	Proszek	1%
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) frakcja V	Fischer Scientific	BP1600-100	DPBS	Proszek	1%
Roztwór gentamycyny/amfoterycyny B	Technologie życia; Gibco	R-015-10	-	500x	1x
pożywka warunkowana Wnt-3A	wewnętrzny	-	-	-	-
Advanced DMEM/F12	Technologie życia; Gibco	12634-028	-	-	-
HEPES 1M	Technologie życia; Gibco	15630-080	-	1 M	10 mM
GlutaMAX (glutamina)	Technologie życia; Gibco	35050-061	-	100X	1X
penicylina-streptomycyna (10 000 J/ml)	Technologie życia; Gibco	15140-148	-	100X	1X
Suplement N2	Technologie życia; Gibco	17502-048	-	100X	1X
Suplement B27	Technologie życia; Gibco	17504-044	-	50X	1X
N-acetylocysteina	Sigma-Aldrich	A9165-5G	DPBS	1 M	1 mM
Nikotynamid	Sigma-Aldrich	N0636	DPBS (bufor fosforanowy z dodatkiem dekstrozy)	1 M	10 mM
Matrigel, GFR, bez fenolu (matryca błony podstawnej)	Corning	356231	-	-	-	WYMAGANE
rekombinowany ludzki Noggin	R&D	6057-NG/CF	DPBS	100 μg /ml	100 ng/ml	Inni dostawcy: R&D; Anaspec i Preprotech
ludzka rekombinowana R-spondyna	Preprotech	120-38	DPBS	1 mg/ml	1 μg/ml
rekombinowany ludzki EGF	Sigma-Aldrich	E9644-.2MG	DBPS	500 μg/ml	50 ng/ml
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503-1MG	DPBS	10 mM	10 μM
A-83-01	Tocris	2939	DMSO	500 μM	500 nM
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067-5MG	DMSO	30 mM	10 μM
ludzka [Leu]15-gastryna 1	Sigma-Aldrich	G9145-.1MG	DPBS	100 μM	10 nM
CHIR99021	Stemgent	04-0004	DMSO	10 mM	2.5 μM
Tiazowiwina	Stemgent	04-0017	DMSO	10 mM	2.5 μM
Enzym TrypLE Express (1X), czerwień fenolowa (enzym do dysocjacji komórek)	Technologie życia; Gibco	12605-010	-	-	-	Do pasażowania
Płodowa surowica bydlęca	Technologie życia; Gibco	10082-147	-	-	-	Do pasażowania
Podłoże CTS Synth-a-Freeze (podłoże do mrożenia)	Technologie życia; Gibco	A13713-01	-	-	-	Do zamrażania
linia komórkowa L Wnt-3A	ATCC	CRL-2647	-	-	-	Produkcja pożywki warunkowanej Wnt-3A
Test luminescencyjny lucyferazy Renilla	Promega	E2710	-	-	-	Aktywność pożywki warunkowanej Wnt-3A
rekombinowane ludzkie białko Wnt-3A	R&D	5036-WN/CF	DPBS (bufor fosforanowo-cukrowy)	100 μg /ml	100 ng/ml	Aktywność pożywki warunkowanej Wnt-3A
linia komórkowa HEK293 TOPflash	-	-	-	-	-	Aktywność medium warunkowanego Wnt-3A; dar z laboratorium Hansa Cleversa

Tabela 1. Szczegółowa lista odczynników z preferowanym producentem i numerem katalogowym.

Sprzęt	Materiały eksploatacyjne	Narzędzia
Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza	probówki stożkowe 15 i 50 ml	standardowa pęseta Dumont #5 (F.S.T.; #11251-20)
Tlenek węgla (II)2 Inkubator	Probówki do mikrowirówki	pinceta zakrzywiona precyzyjna Dumont #7 (F.S.T.; #11274-20)
Stereomikroskop	płytki 24-dołkowe	Precyzyjne nożyczki (F.S.T.; #14060-09)
Wirówka	0.22 μm filtry (Sartorius)	nożyczki sprężynowe Vannasa (F.S.T.; #15018-10)
Inkubator wytrząsowy	Pipety serologiczne	piny minutien o średnicy 0,2 mm (F.S.T.; #26002-20)
Pojemnik do mrożenia (Nalgene)	Końcówki do mikropipet	piny minutien o średnicy 0,1 mm (F.S.T.; #26002-10)
Silikon Sylgard 184 (Dow Corning)	150 μm oczka siatki, sito nylonowe (Dynamic Aqua-supply)
Szklana szalka Petriego	polipropylowe probówki z dnem okrągłym o pojemności 5 ml (Falcon)
Pipeta serologiczna	igła stępiona do napełniania 18G (BD)
Mikropipeta	strzykawki 3 ml z końcówkami Luer-Lock (BD)
	Probówki kriogeniczne

Tabela 2. Szczegółowy wykaz materiałów eksploatacyjnych, narzędzi i sprzętu niezbędnych do izolacji i hodowli krypt.

Dyskusja

Metoda ta zapewnia kompletny system odtwarzający linie nabłonka jelitowego i dynamikę nabłonka, które stanowią przydatne narzędzie do badania biologii nabłonka jelitowego. Przedstawiona tutaj metoda została zaadaptowana z oryginalnego badania na myszach przeprowadzonego przez Sato i Cleversa²² , które skutecznie prowadzi do ludzkich enteroidów i okrężnic. Tutaj ręcznie podnieśliśmy krypty przez mikrodysekcję, aby uniknąć jakichkolwiek zanieczyszczeń komórkowych. Ta metoda pozwala na bezpośrednią wizualizację krypt i prowadzi do spójności w miarę upływu czasu w porównaniu z oryginalną kolekcją krypt poprzez "potrząsanie". Inne grupy opracowały podobne techniki, stosując nieco inne podejścia, zwłaszcza zastępując chelatację przez EDTA kolagenazą²⁵. Oprócz różnic w zbieraniu krypt, techniki te wykorzystują określoną pożywkę, która jest wymagana do hodowli ludzkich enteroidów w kulturze²². Aby zwiększyć efektywność wzrostu podczas wysiewu krypt, dodajemy inhibitor GSK3 (CHIR99021) przez pierwsze dwa dni ¹².

Obchodzenie się z tkanką lub biopsjami jest ważne, a izolacja krypty powinna być wykonana zaraz po przybyciu tkanki do laboratorium. Jednak opóźniona izolacja krypty i hodowla mogą być przeprowadzone do 24 godzin po pobraniu tkanki (dane nie pokazane), jak opisano wcześniej dla tkanki myszy²⁶. Tkanka jelitowa powinna być umieszczona w stożkowej probówce całkowicie wypełnionej DPBS, aby uniknąć uszkodzenia tkanek i powinna być utrzymywana w temperaturze 4°C. Opóźnione przygotowanie pozwala na wysyłkę tkanek, ale podczas transportu należy unikać wahań temperatury. Całkowity czas potrzebny na wstępne poszycie krypty wynosi około 2 godzin, z czego 15 do 30 minut zajmuje przetworzenie tkanki i 1 do 2 godzin izolacja i płytka krypty. Mikrodysekcja tkanki jest krytycznym wyznacznikiem i predykatem czystego preparatu krypty. Jednak uwolnienie krypty przez uścisk dłoni, jak opisano w różnych protokołach, jest możliwe^22,23.

Pomimo podobieństw do mysiego układu enteroidów (enteroidów), ludzkie enteroidy wymagają określonych cząsteczek, aby zwiększyć i utrzymać ich wzrost w czasie. Czynniki wzrostu, Egf, Noggin, R-spondyna są stosowane podobnie jak organoidy nabłonka myszy. Jednak użycie Wnt-3A ma kluczowe znaczenie. Zauważyliśmy, że zarówno tworzenie, jak i wydajność wzrostu są większe przy użyciu pożywki kondycjonowanej Wnt-3A niż ludzkiego białka rekombinowanego. Jednocześnie wykazano poprawę warunków hodowli przy użyciu inhibitora kinazy syntazy glikogenu 3 (CHIR99021)¹². Rekombinowane czynniki wzrostu mogą zostać zastąpione przez Wnt-3A, R-spondynę i pożywki kondycjonowane przez Noggin. Linia komórek L z ekspresją Wnt-3A jest dostępna na rynku (ATCC). Inne grupy rozwinęły linie komórkowe z ekspresją R-spondyny ^1-23,27, ^Noggin-19 i Wnt-3A / R-spondyny3 / Noggin-28. W pożywce hodowlanej stosuje się dwa małocząsteczkowe inhibitory, które są niezbędne do utrzymania kultury²⁹. A-83-01 jest selektywnym inhibitorem transformującego czynnika wzrostu β i receptorów aktywinowo-węzłowych (kinaza aktywinopodobna 4, 5, 7) i jest SB202190 inhibitorem kinazy białkowej aktywowanej mitogenem p38 (MAPK). Oba inhibitory były stosowane odpowiednio do podtrzymania samoodnawiania się ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz do tworzenia ludzkich naiwnych pluripotencjalnych komórek macierzystych^30-32. Również nikotynamid, prekursor dinukleotydu nikotynamidoadeninowego, jest niezbędny do utrzymania ekspansji enteroidów i kolonoidów w sposób długotrwały^22,29.

Chelatacja EDTA jest ważnym krokiem, ponieważ decyduje o wydajności preparatu krypty. Odnieśliśmy sukces w leczeniu 2 mM EDTA. Jednak stężenie EDTA można modyfikować z 2 mM do 15 mM w zależności od rodzaju tkanki. W takim przypadku czas inkubacji musi być określony empirycznie. Po wstępnym poszyciu krypta zaokrągla się i ostatecznie tworzy enteroidy. Jednak enteroidy lub kolonoidy często wykazują fenotyp "macierzysty", tworząc kule z niewielką ilością zróżnicowanych komórek lub bez nich. W takim przypadku różnicowanie można zainicjować poprzez odstawienie Wnt-3A, nikotynamidu i inhibitora p38 MAPK. Stosowanie inhibitora Notch, takiego jak DAPT lub DBZ, pomaga zwiększyć różnicowanie w enteroidach²².

Model ten podsumowuje fizjologię jelit z ciągłymi zdarzeniami pączkowania krypt wynikającymi z przedziału komórek macierzystych, a także domen nabłonka przypominających kosmki, zawierających zarówno absorpcyjne, jak i wydzielnicze zróżnicowane linie. Co ciekawe, system ten nie zawiera żadnych komórek mezenchymalnych i wykorzystuje określone warunki pożywki, aby spełnić wymagania dotyczące sygnału niszowego.

Podobnie jak model mysi, ludzkie enteroidy mogą być generowane z izolowanych komórek nabłonka jelitowego w celu przetestowania zdolności tych komórek do funkcjonowania jako komórka macierzysta. W kilku badaniach wykorzystano klaster markerów różnicowania (CD44, CD24 lub CD166) i komórki EPHB2 dodatnie w celu wzbogacenia komórek o właściwościach macierzystych^12,23,33. Łącznie badania te wykazują przydatność ludzkich kultur enteroidów do testowania pnia. Inni badacze używają tego modelu do badania chorób jelit, takich jak zakaźne choroby biegunkowe, mukowiscydoza lub rak jelita grubego ^22,34-37. Badania te pokazują, że ludzkie enteroidy stanowią wiarygodny model choroby człowieka z możliwością przejścia na spersonalizowane badania przesiewowe. Ludzkie enteroidy mogą być genetycznie modyfikowane za pomocą transfekcji DNA lub zakażenia cząstkami wirusa³⁸. Stanowi to potężne narzędzie do badania funkcji specyficznych dla genów w organoidach ludzkiego nabłonka lub korygowania mutacji genetycznych. Niedawno Schwank i współpracownicy zademonstrowali możliwość edycji genomu za pomocą systemu CRISPR/Cas9 i skorygowania mutacji w genie CFTR powodującej mukowiscydozę²⁴. Ludzkie enteroidy stanowią cenny system do badania biologii jelitowych komórek macierzystych i nabłonkowej błony śluzowej oraz służą jako nowatorski system eksperymentalny do badania zarówno prawidłowej, jak i nieprawidłowej fizjologii przewodu pokarmowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Ca2+, Mg2+ free (DPBS)	Technologie życia; Gibco	14190-144
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	431788
Sorbitol	Fischer Scientific	BP439-500
Sacharoza	Fischer Scientific	BP220-1
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) frakcja V	Fischer Scientific	BP1600-100
Gzntamycyna/amfoterycyna B roztwór	Technologie życiowe; Pożywka kondycjonowana Gibco	R-015-10
Wnt-3A	we własnych
DMEM/F12	Life; Gibco	12634-028
HEPES 1M Life	technologie; Gibco	15630-080
GlutaMAX (glutamina)	Technologie życia; Gibco	35050-061
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Technologie życia; Gibco	15140-148
N2 Suplement	Life technologie; Gibco	17502-048
B27 Technologie Suplement	Life; Gibco	17504-044
N-acetylocysteina	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nikotydamid	Sigma-Aldrich	N0636
Matrigel, GFR, bez fenolu (matryca błony podstawnej)	Corning	356231
ludzki rekombinowany Noggin	R& D	6057-NG/CF
ludzka rekombinowana R-Spondin	Preprotech	120-38
ludzka rekombinowana EGF	Sigma-Aldrich	E9644-.2MG
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503-1MG
A-83-01	Tocris	2939
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067-5MG
człowiek [Leu]15- Gastrin 1	Sigma-Aldrich	G9145-.1MG
CHIR99021	Stemgent	04-0004
Tiazovivin	Stemgent	04-0017
TrypLE Express Enzyme (1X), czerwień fenolowa (enzym dysocjacji komórek)	Technologie życia; Gibco	12605-010
Technologie życia płodowej surowicy bydlęcej	; Gibco	10082-147
CTS Synth-a-Freeze Medium (medium zamrażające)	Technologie życia; Gibco	A13713-01
L Linia komórkowa Wnt-3A	ATCC	CRL-2647
Test lucyferazy Renilla	Promega	E2710
ludzka rekombinowana Wnt-3A	R& Linia ogniw D	5036-WN/CF
HEK293 TOPflash