Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

23.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52484

⸱

17 marca 2015

 ,  , 
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

Istnieje wiele różnych metod pomiaru pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Przy określaniu najodpowiedniejszej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono dwa protokoły pomiaru EV, wykorzystujące albo indywidualną detekcję, albo podejście oparte na kulkach.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to małe, błonowe pęcherzyki znajdujące się w płynach ustrojowych, które są silnie zaangażowane w komunikację komórka-komórka i pomagają regulować różnorodny zakres procesów biologicznych. Analiza EV za pomocą cytometrii przepływowej (FCM) była niezwykle trudna ze względu na ich niewielkie rozmiary i brak dyskretnych populacji dodatnich dla markerów będących przedmiotem zainteresowania. Metody analizy EV, choć znacznie ulepszone w ciągu ostatniej dekady, są nadal w toku. Niestety, nie ma jednego uniwersalnego protokołu, a przy określaniu najbardziej odpowiedniej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono tutaj kilka różnych technik przetwarzania EV oraz dwa protokoły analizy EV przy użyciu indywidualnego wykrywania lub podejścia opartego na koralikach. Opisane tutaj metody pomogą w wyeliminowaniu agregatów przeciwciał powszechnie występujących w preparatach komercyjnych, zwiększeniu stosunku sygnału do szumu i ustawieniu bramek w racjonalny sposób, który minimalizuje wykrywanie fluorescencji tła. Pierwszy protokół wykorzystuje indywidualną metodę wykrywania, która szczególnie dobrze nadaje się do analizy dużej ilości próbek klinicznych, podczas gdy drugi protokół wykorzystuje podejście oparte na kulkach do wychwytywania i wykrywania mniejszych EV i egzosomów.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to małe, błonowe pęcherzyki znajdujące się w płynach ustrojowych, które są silnie zaangażowane w komunikację komórka-komórka i pomagają regulować różnorodny zakres procesów biologicznych. Analiza EV za pomocą cytometrii przepływowej (FCM) była niezwykle trudna ze względu na ich niewielkie rozmiary i brak dyskretnych populacji dodatnich dla markerów będących przedmiotem zainteresowania. Metody analizy EV, choć znacznie ulepszone w ciągu ostatniej dekady, są nadal w toku. Niestety, nie ma jednego uniwersalnego protokołu, a przy określaniu najbardziej odpowiedniej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono tutaj kilka różnych technik przetwarzania EV oraz dwa protokoły analizy EV przy użyciu indywidualnego wykrywania lub podejścia opartego na koralikach. Opisane tutaj metody pomogą w wyeliminowaniu agregatów przeciwciał powszechnie występujących w preparatach komercyjnych, zwiększeniu stosunku sygnału do szumu i ustawieniu bramek w racjonalny sposób, który minimalizuje wykrywanie fluorescencji tła. Pierwszy protokół wykorzystuje indywidualną metodę wykrywania, która szczególnie dobrze nadaje się do analizy dużej ilości próbek klinicznych, podczas gdy drugi protokół wykorzystuje podejście oparte na kulkach do wychwytywania i wykrywania mniejszych EV i egzosomów.

EVs, znane również jako mikrocząsteczki, to małe, błonowe pęcherzyki znajdujące się w płynach ustrojowych, które biorą udział w komunikacji między komórkami i pomagają regulować różnorodny zakres procesów biologicznych1. Poprzez ekspresję różnych markerów powierzchniowych i/lub bezpośredni transfer materiału biologicznego, EV są w stanie zmienić funkcję komórek biorcy, aby odgrywały role aktywujące lub tłumiące w komunikacji międzykomórkowej 2-4. Klinicznie wiadomo, że EV pochodzące z płytek krwi mają silne działanie przeciwzakrzepowe5, podczas gdy inne wykazują przyczynianie się do szerokiego zakresu schorzeń, od promowania przerzutów nowotworowych6 po ochronę przed chorobą7. EV można podzielić na mniejsze kategorie pęcherzyków pochodzących z komórek, takich jak egzosomy i mikropęcherzyki (MV), w zależności od ich wielkości i mechanizmu generacji8. Nomenklatura subpopulacji pęcherzyków pochodzących z komórek nadal jest tematem toczącej się debaty8,9, jednak egzosomy są ogólnie opisywane jako małe cząstki o długości od 40 do 100 nm pochodzące z endosomalnej fuzji z błoną plazmatyczną, podczas gdy MV to większe cząstki o długości od 100 do 1000 nm powstałe w wyniku zrzucania błony plazmatycznej10. W tym przypadku ogólny termin "EV" będzie używany w odniesieniu do wszystkich typów zewnątrzkomórkowych pęcherzyków biologicznych uwalnianych przez komórki.

Izolacja EVs z krwi pełnej jest wieloetapową procedurą i wykazano, że wiele różnych zmiennych przetwarzania wpływa na zawartość EV, w tym temperatura i czas przechowywania11,12, stosowany antykoagulant/konserwant13 i metoda wirowaniastosowana 14. Potrzeba standaryzacji tych zmiennych doprowadziła do zaleceń Komitetu Naukowego i Normalizacyjnego Międzynarodowego Towarzystwa Zakrzepicy i Hemostazy (ISTH SSC) dotyczących prawidłowego przetwarzania krwi i procedur izolacji EV15,16, jednak wśród badaczy nie ma zgody co do optymalnego protokołu do stosowania 12. Większość zgadza się jednak, że ściśle kontrolowane zmienne przedanalityczne mają kluczowe znaczenie dla dokładnych i odtwarzalnych danych.

Aby przeanalizować EVs, badacze wykorzystali różne metody, w tym transmisyjną mikroskopię elektronową17, skaningową mikroskopię elektronową18,19, mikroskopię sił atomowych, dynamiczne rozpraszanie światła20,21 i western blot22,23. Podczas gdy FCM jest metodą wybieraną przez wielu badaczy9,24–26 ze względu na jej wysoką przepustowość, analiza pojazdów elektrycznych wykorzystujących FCM jest niezwykle trudna ze względu na ich rozmiar i brak dyskretnych populacji dodatnich27–32. W porównaniu z analizą komórek, mały rozmiar EV skutkuje 1) mniejszą emitowaną fluorescencją ze względu na mniejszą liczbę antygenów na cząstkę oraz 2) ograniczoną wykonalnością mycia po barwieniu, co jest niezbędne do zmniejszenia fluorescencji tła. Częstymi wyzwaniami dla badaczy są sygnały pochodzące z agregatów immunoglobulin27,28oraz samoagregacja przeciwciał29. Co więcej, długi czas przetwarzania i długie procedury mycia/izolacji stosowane w wielu obecnych protokołach33,34 wymagają wielodniowego zaangażowania czasowego w celu analizy niewielkiej liczby próbek, co sprawia, że są one dalekie od idealnych do zastosowań o dużej przepustowości. Niektórzy badacze całkowicie rezygnują z etapu mycia, co sprawia, że tradycyjnie stosowane kontrole negatywne FCM, takie jak fluorescencja minus jeden (FMO) i izotypy przeciwciał, są bezużyteczne do dokładnej oceny fluorescencjitła 30.

Nasze protokoły rozwiązują trzy powszechne problemy, które mogą utrudniać prawidłową analizę FCM EV: sygnały pochodzące z agregatów przeciwciał i innych niepęcherzyków, trudności w usuwaniu niezwiązanych przeciwciał oraz brak dostrzegalnych pozytywnych populacji. Opisane tutaj techniki pomogą w eliminacji agregatów przeciwciał powszechnie występujących w preparatach komercyjnych, zwiększeniu stosunku sygnału do szumu i ustawieniu bramek w racjonalny sposób, który minimalizuje wykrywanie fluorescencji tła. Przedstawiono tutaj dwie różne metody wykrywania: pierwszy protokół wykorzystuje indywidualną metodę wykrywania, która szczególnie dobrze nadaje się do analizy dużej ilości próbek klinicznych, podczas gdy drugi protokół wykorzystuje podejście oparte na kulkach do wychwytywania i wykrywania mniejszych EV i egzosomów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Następujące protokoły zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu człowieka. Wszystkie próbki pobrane od ludzi zostały przetestowane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję rewizyjną (IRB) i za świadomą zgodą badanych.

1. METODA A: Indywidualna metoda wykrywania

1.1) Przetwarzanie próbki krwi/izolacja EV

  1. Pobrać krew od dawcy/pacjenta do dwóch szklanych probówek o pojemności 10 ml zawierających 1,5 ml roztworu ACD A lub innego odpowiedniego antykoagulantu i natychmiast (w ciągu maksymalnie 30 minut) przeprowadzić proces przy użyciu następującego 2-stopniowego protokołu wirowania różnicowego.
    UWAGA: Ten protokół da około 10 ml osocza ubogiego w płytki krwi (PPP) z połączonych ~ 17 ml pobranej krwi. Jeśli potrzebna jest większa lub mniejsza ilość PPP, liczba probówek z pobraną krwią może być odpowiednio dostosowana.
  2. Odwirować próbki o masie 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia osocza od kożucha i krwinek czerwonych. Przenieść 1,2 ml podwielokrotności supernatantu osocza do 1,5 ml probówek wirówkowych, uważając, aby nie naruszyć dolnych warstw zawierających kożuszek i krwinki czerwone.
  3. Wirować w temperaturze 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć płytki krwi i duże fragmenty komórek. Ostrożnie przenieś PPP, pozostawiając 200 μl, aby uniknąć naruszenia osadu i dodaj PPP do nowej probówki.
  4. W tym momencie należy natychmiast użyć PPP do analizy lub przenieść w podwielokrotnościach o pojemności 1,0 ml do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do dwóch lat w celu późniejszej analizy (patrz rysunek 1A w celu zapoznania się z przeglądem).
  5. Jeśli do eksperymentów funkcjonalnych potrzebne są oczyszczone EVP, przenieść 6 ml PPP do probówki ultrawirówkowej i dodać 28 ml soli fizjologicznej (PBS) z filtrem fosforanowym o stężeniu 0,2 μm. Wirować przez 60 minut przy 100 000 x g przy temperaturze pokojowej za pomocą ultrawirówki wyposażonej w wahliwy wirnik kubełkowy. Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulat EV w 1,5 ml pożywce.
    UWAGA: Aby uzyskać najwyższą odtwarzalność, próbki krwi powinny być przetwarzane tak konsekwentnie, jak to możliwe, od dawcy do dawcy. Wszelkie różnice w metodzie izolacji pojazdów elektrycznych mogą mieć znaczący wpływ na liczbę i typ wykrywanych pojazdów elektrycznych.

1.2) Przygotowanie próbek do analizy

UWAGA: Od tego momentu, kroki wyjaśniają protokół o wysokiej przepustowości do analizy 12 próbek dla 14 markerów w 3 panelach. Można tu jednak zastosować inne kombinacje przeciwciał; Protokół można dostosować do badania innych populacji EV poprzez zastąpienie sugerowanych markerów tymi, które są przedmiotem zainteresowania.

  1. Wyjąć 12 próbek z zamrażarki (jeśli są przechowywane w temperaturze -80 °C) i rozmrozić w temperaturze 37 °C.
  2. Odpipetuj zawartość w górę i w dół kilka razy, aby wymieszać. Usunąć 320 μl z każdej próbki i dodać do górnego rzędu płytki 96-dołkowej.
    UWAGA: Pipeta wielodołkowa o regulowanej szerokości jest niezwykle pomocna w tym i wielu innych krokach w trakcie testu, szczególnie podczas analizy wielu próbek jednocześnie.

1.3) Barwienie próbek EV

  1. Przed barwieniem należy przefiltrować wszystkie przeciwciała (Abs), aby usunąć agregaty, które mogą powodować sygnały pozytywne.
    1. Połącz przeciwciała, które mają być użyte w każdym z 3 paneli, w oddzielne odśrodkowe probówki filtracyjne 0,22 μm i odwiruj za pomocą wirówki jednobiegowej o stałym kącie (~750 x g) przy RT przez 2 minuty lub do momentu, gdy cała mieszanina Ab przejdzie przez filtr i na powierzchni filtra nie pozostanie płyn przeciwciała. Przechowuj koktajle Ab w lodówce do dwóch tygodni, ale za każdym razem ponownie filtruj przed użyciem.
  2. Dodać odpowiednią ilość przefiltrowanej mieszaniny Ab do każdego dołka w rzędzie 2 (np. próbki w panelu I barwi się 2 μl każdego Ab, więc do każdego dołka dodaje się łącznie 12 μl przefiltrowanego koktajlu Ab na studzienkę). Patrz rysunek 1B, aby zapoznać się z zarysem sugerowanej mapy tablic. Powtórz te dodatki do rzędów poniżej, jeśli uruchomionych jest więcej paneli (tutaj dodaj 8 μl/studzienkę koktajlu Panelu II do rzędu 3 i 11 μl/studzienkę koktajlu Panelu III do rzędu 4; patrz Lista materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje o panelu).
  3. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszać próbki PPP w rzędzie 1 w górę i w dół i przenieść 100 μl z dołków w rzędzie 1 do studzienek w rzędzie 2. Mieszaj w górę iw dół. Zmień końcówki i powtórz, przenosząc 100 μl z rzędu 1 do rzędów 3 i 4. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.

1.4) Mycie próbek MV

  1. Wyjąć 96-dołkową płytkę z 4 °C i przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 220 μl PBS/studzienkę do rzędów 6-8 (do użycia do płukania/mycia studzienek zawierających zabarwiony PPP).
  2. Przenieś zawartość każdej studzienki do wstępnie znakowanych odśrodkowych probówek filtracyjnych za pomocą wielokanałowej pipety o regulowanej szerokości (dla 12 próbek, z 3 panelami przeciwciał, potrzebne będzie 12 x 3 = 36 probówek filtracyjnych). Używając tych samych końcówek, usuń 200 μl PBS z rzędów mycia i dodaj do odpowiednich studzienek, z których właśnie usunięto PPP.
  3. Mieszać w górę i w dół, aby przepłukać studzienki i przenieść roztwór płuczący do tych samych filtrów, do których wcześniej dodano PPP. Zamknij górne części filtrów odśrodkowych. Zmień wskazówki.
  4. Powtarzaj ten proces z pozostałymi barwionymi próbkami, aż wszystkie barwione próbki PPP zostaną przeniesione wraz z ich roztworami płuczącymi do filtrów odśrodkowych.
  5. Przenieść filtry odśrodkowe do wirówki ze stałym wirnikiem i wirować z prędkością 850 x g przez 3 minuty przy RT.
    UWAGA: Upewnij się, że na pokrywach filtrów nie pozostał żaden płyn. Po odwirowaniu filtr powinien wydawać się "suchy", bez widocznej warstwy płynu na wierzchu. Chociaż jest to mało prawdopodobne, niektóre próbki PPP mogą wymagać dłuższego czasu wirowania, aby skutecznie przejść przez filtr.
  6. Wyjmij odśrodkowe rurki filtracyjne i wróć do komory bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pipety wielokanałowej ponownie zawiesić górne części filtrów w 300 μl PBS. Przenieś ponownie zawieszoną zawartość do wstępnie oznakowanych probówek w celu natychmiastowej analizy FCM.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby siła i liczba wgłębień tłoka pipety były spójne między próbkami, aby uniknąć różnic między próbkami. Najlepiej byłoby to zrobić za pomocą pipety elektronicznej, która została zaprogramowana do pipetowania w górę i w dół określonej objętości (np. 280 μl) dokładnie tyle razy (np. 8 razy) dla każdej próbki.

1.5) Ustawienia cytometru

  1. Otwórz oprogramowanie FCM. Przed konfiguracją eksperymentu należy przeprowadzić codzienną kalibrację i konfigurację przyrządu za pomocą koralików do konfiguracji przyrządu (zgodnie z instrukcjami producenta).
  2. Jeżeli próbki EV zostały wybarwione więcej niż jednym przeciwciałem i ma być mierzonych wiele fluorochromów jednocześnie, należy obliczyć wartości kompensacji w następujący sposób:
    1. Dodaj 2 krople kulek kompensacyjnych do wstępnie znakowanych probówek (1 probówka na każde przeciwciało sprzężone z fluorochromem) i dodaj zalecaną ilość przeciwciała. Dodaj 2 krople ujemnych koralików kompensacyjnych do innej probówki, aby użyć ich jako niezabarwionej kontroli kompensacji.
    2. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, przemyć PBS i ponownie zawiesić w 400 μl PBS.
    3. Korzystając z oprogramowania cytometru przepływowego dołączonego do przyrządu, uruchom każdą rurkę kompensacyjną i dostosuj napięcia fluorescencyjne, aby umieścić każdy pik na poziomie około 104 w skali logarytmicznej 5 dekad. Upewnij się, że pik fluorescencji jest najwyższy (najjaśniejszy) we własnym kanale fluorescencyjnym w porównaniu ze wszystkimi innymi kanałami i w razie potrzeby ponownie dostosuj napięcia parametrów fluorescencji. Uruchom każdą indywidualnie poplamioną probówkę comp i przechwyć co najmniej 5,000 zdarzeń na probówkę.
    4. Wybierz zakładkę "Eksperyment", następnie wybierz "Kompensacja", a następnie wybierz "Oblicz kompensację", aby zastosować wartości kompensacji do wszystkich próbek.
  3. Ustaw parametry napięcia rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC) na skalę logarytmiczną i wybierz najniższe progi dozwolone przez cytometr (FSC=200 i SSC=200) dla każdego z nich.
  4. Pracując na lampie PBS z filtrem 0,22 μm, dostosuj napięcia FSC i SSC do najwyższych wartości, które wykluczają większość szumów tła (tj. tuż poniżej progu napięcia, przy którym częstotliwość zdarzeń przekracza 5 zdarzeń na sekundę).
  5. Następnie uruchom probówkę zawierającą kulki 0,2 μm – 1,0 μm, w razie potrzeby rozcieńczone w PBS. Na wykresie FCS vs. SSC narysuj bramkę wokół populacji ściegów, aby uchwycić zdarzenia z zakresu od 0,2 μm do 1,0 μm. Alternatywnie, w histogramie SSC-H, narysuj bramkę, aby uwzględnić wszystkie zdarzenia mniejsze niż koraliki 1,0 μm.
  6. Ustaw natężenie przepływu cytometru na "Lo" (około 8-12 μl/min). Za pomocą rurki z kulkami (lub innej probówki zawierającej znane stężenie kulek) wyreguluj pokrętło natężenia przepływu na cytometrze, aż szybkość zdarzeń osiągnie około 200 zdarzeń / s. Odczytaj wszystkie probówki z próbkami przy tym samym natężeniu przepływu i użyj tego samego stężenia kulek w przyszłych eksperymentach, aby upewnić się, że natężenia przepływu pozostają stałe między cyklami.
  7. Uruchom probówkę z tęczowymi cząstkami fluorescencyjnymi rozcieńczonymi w PBS. Zdobądź 5 000 wydarzeń. Zapisz średnie wartości intensywności dla FSC, SSC i każdego kanału koloru. Użyj tych wartości, aby dostosować napięcia w przyszłych eksperymentach, aby zapewnić, że intensywność fluorescencji pozostanie spójna między eksperymentami.

1.6) Przykładowy odczyt

  1. Ustaw natężenie przepływu cytometru na "Lo" (około 8-12 μl/min) i uruchom każdą próbkę dokładnie przez 1 lub 2 minuty.
  2. Po pierwszym odczycie dodaj 20 μl 10% NP-40 do każdej próbki, pipetuj w górę i w dół i ponownie czytaj przez ten sam czas (1 lub 2 minuty), aby umożliwić odjęcie pozytywnych zdarzeń wykrytych w lizie próbce w równym przedziale czasowym.
    UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby próbki były mieszane za pomocą pipety, a nie wiru. Z naszego doświadczenia wynika, że wirowanie może powodować samoagregację niektórych przeciwciał, co prowadzi do pozytywnych zdarzeń naśladujących EV.
  3. Po odczytaniu wszystkich próbek wyeksportuj wszystkie pliki .fcs do osobnego pliku, który zostanie wykorzystany do dalszej analizy za pomocą oprogramowania do analizy FCM.

1.7) Analiza danych

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy FCM. Zaimportuj wszystkie pliki .fcs do nowego pliku eksperymentu.
  2. Otwórz rurkę z samymi koralikami. Na wykresie FSC-A vs. SSC-A narysuj bramkę wokół wszystkich koralików o rozmiarach od 0,2 μm do 1,0 μm. To jest brama EV. Przeciągnij, aby dodać do wszystkich próbek.
  3. Wykorzystując lizowane próbki jako kontrole ujemne, narysuj bramki na krawędzi fluorescencji tła w każdym użytym kanale fluorescencyjnym. Przeciągnij bramki fluorescencyjne do bramki EV każdej odpowiedniej próbki niepoddanej lizie.
    UWAGA: W tym miejscu przydatne jest również zbadanie wykresów dwuparametrowych podwójnej fluorescencji. Kształty rakiet w podwójnie dodatnim kwadrancie (patrz ryc. 8), szczególnie jeśli wiadomo, że markery znajdują się na niepowiązanych typach komórek, mogą wskazywać na artefakt z agregacji lub innych zdarzeń naśladujących pęcherzyki.
  4. Dla każdego markera fluorescencyjnego odejmij liczbę zdarzeń w próbce poddanej lizie od liczby zdarzeń w próbce niepoddanej lizie. Opcjonalnie podziel tę liczbę przez całkowitą liczbę EV w niezlizowanej bramce EV, aby uzyskać % wartości dodatnich.

2. METODA B: Metoda koralików

2.1) Przetwarzanie próbki krwi/izolacja EVs

  1. Odnieść się do metody przetwarzania krwi opisanej w metodzie A (sekcja 1.1).

2.2) Przygotowanie próbek do analizy

  1. W razie potrzeby frakcjonować PPP lub ultrawirowane EV na egzosomy i mikropęcherzyki. Dodać 250 μl PPP lub ultrawirówek EV do filtrów odśrodkowych 0,22 μm i przenieść do wirówki ze stałym wirnikiem i wirować z prędkością 750 x g przez 2 minuty przy RT.
    UWAGA: Upewnij się, że na pokrywach filtrów nie pozostał żaden płyn. Po odwirowaniu filtr powinien wydawać się "suchy", bez widocznej warstwy płynu na wierzchu. Chociaż jest to mało prawdopodobne, niektóre próbki mogą wymagać nieco dłuższego czasu wirowania, aby płyn mógł skutecznie przejść przez filtr.
  2. Umyj niepowlekane kulki polistyrenowe 6 μm (np. kulki ujemnego AbC) 2x za pomocą pożywki RPMI i ponownie zawieś w 2 ml. Dodaj 6 000 kulek do każdej probówki FACS. Do probówki kontroli ujemnej dodać 400 μl samej pożywki RPMI do kulek. Do wszystkich pozostałych probówek dodać 200 μl PPP lub ultrawirówek EV (lub ich frakcji) i 200 μl pożywki RPMI.
  3. Doprowadzić końcową objętość wszystkich probówek do 400 μl z pożywką i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
  4. Następnego ranka umyj koraliki 2 ml podłoża. Odessać supernatant.
  5. Blokować 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w pożywce (400 μl) przez 3 godziny w temperaturze 4 °C na shakerze.
  6. Umyj koraliki 2 ml pożywki. Odessać i ponownie wymieszać osad w 100 μl podłoża.

2.3) Barwienie próbek EV

  1. Przefiltruj wszystkie przeciwciała. Użyć tych samych paneli przeciwciał, które są używane w metodzie A lub, jeśli jest to pożądane, stworzyć inną kombinację przeciwciał, o ile ich fluorochromy są ze sobą zgodne.
  2. Połącz wszystkie przeciwciała, które mają być użyte w jednym panelu, w odśrodkowej probówce filtracyjnej o średnicy 0,22 μm. Wirować za pomocą wirówki jednobiegowej o stałym kącie przez 2 minuty lub do momentu, gdy cała mieszanina Ab przejdzie przez filtr i na powierzchni filtra nie pozostanie płynne przeciwciało.
  3. Dodać odpowiednią objętość przefiltrowanego koktajlu przeciwciał do wszystkich probówek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Przepłukać kulki 2 ml pożywki, ponownie zawiesić w 400 μl pożywki i natychmiast uruchomić (lub w ciągu tego samego dnia) na cytometrze przepływowym.

2.4) Konfiguracja cytometru i odczyt próbki

  1. Otwórz oprogramowanie FCM. Przed konfiguracją eksperymentu należy przeprowadzić codzienną kalibrację i konfigurację przyrządu za pomocą koralików do konfiguracji przyrządu (zgodnie z instrukcjami producenta).
  2. Jeżeli próbki EV zostały wybarwione więcej niż jednym przeciwciałem i ma być mierzonych wiele fluorochromów jednocześnie, należy obliczyć wartości kompensacji w następujący sposób:
    1. Dodaj 2 krople kulek kompensacyjnych do wstępnie znakowanych probówek (1 probówka na każde przeciwciało sprzężone z fluorochromem) i dodaj zalecaną ilość przeciwciała. Dodaj 2 krople ujemnych koralików kompensacyjnych do innej probówki, aby użyć ich jako niezabarwionej kontroli kompensacji. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, przemyć PBS i ponownie zawiesić w 400 μl PBS.
    2. Korzystając z oprogramowania FCM, uruchom każdą rurkę kompensacyjną i dostosuj napięcia fluorescencyjne, aby umieścić każdy pik na poziomie około 104 w skali logarytmicznej 5 dekad. Upewnij się, że pik fluorescencji jest najwyższy (najjaśniejszy) we własnym kanale fluorescencyjnym w porównaniu ze wszystkimi innymi kanałami i w razie potrzeby ponownie dostosuj napięcia parametrów fluorescencji. Uruchom każdą indywidualnie poplamioną probówkę comp i przechwyć co najmniej 5,000 zdarzeń na probówkę.
    3. Wybierz zakładkę "Eksperyment", następnie "Kompensacja", a następnie "Oblicz kompensację", aby zastosować wartości kompensacji do wszystkich próbek.
  3. Zmień parametry napięcia FSC i SSC na skalę logarytmiczną i wybierz najniższe progi dozwolone przez cytometr (FSC = 200 i SSC = 200) dla każdego z nich.
  4. Uruchom próbki, przelej populację koralików singletowych i zdobądź 2,000 zdarzeń w tej bramce. Eksportuj pliki .fcs.
  5. Użyj oprogramowania do analizy FCM, aby przeanalizować pliki .fcs. Bramka na koralikach podkoszulkowych. Obliczyć średnią geometryczną intensywności fluorescencji (MIF) dla każdego fluorochromu i porównać z MIF kontroli ujemnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat postępowania w celu izolacji i detekcji EV przy użyciu metody opartej na koralikach lub metody detekcji pojedynczej. Pojedyncza detekcja EV za pomocą FCM sprawdza się w analizie większych EV, jednak większość cytometrów nie jest w stanie indywidualnie wykrywać cząstek tak małych jak egzosomy. Podejście oparte na koralikach umożliwia detekcję małych EV, niemniej jednak wiąże się ono z pewnymi wadami, które przedstawiono w Tabeli 1. Zazwyczaj izolację E...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zaprezentowano dwa różne protokoły izolacji, leczenia i analizy EV, wykorzystujące metodę indywidualnego wykrywania lub podejście oparte na kulkach. Wybór najodpowiedniejszej metody nie zawsze jest prosty i wymaga zrozumienia badanej próbki, a także poszczególnych subpopulacji, które są przedmiotem zainteresowania. Ponadto przy wyborze najodpowiedniejszej metody należy wziąć pod uwagę czułość cytometru używanego do akwizycji. Często nie ma jednego najlepszego protokołu do użycia, raczej kombinacja metod dostarcza więcej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dale'owi Hirschkornowi z Instytutu Badań nad Systemami Krwi za pomoc w ustawieniach cytometru przepływowego. Prace te były wspierane przez granty NIH HL095470 i U01 HL072268 oraz kontrakty DoD W81XWH-10-1-0023 i W81XWH-2-0028.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laboratoryjny cytometr przepływowy LSR IIBD Biosciences3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm niebieski, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm fioletowy i 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm czerwony)
Oprogramowanie FACS Diva Oprogramowanie BD BiosciencesPC w wersji 6.0
FlowJo Treestar USMac wersja 9.6.1 lub PC wersja 7.6.5
Cząstki fluorescencyjne Sphero RainbowBD Biosciences556298używane do regulacji wszystkich napięć kanałów w celu utrzymania spójności intensywności fluorescencji 
Cząsteczki fluorescencyjne Ultra Rainbow SpherotechURFP-10-5stosowany jako dodatek do kulek SSC Megamix-Plus w celu zapewnienia spójności bramkowania EV z partii na partię
Kulki Megmix-Plus SSCBiocytex7803służy do regulacji napięć FSC i SSC w celu utrzymania  spójności  między cyklami. Może być również używany do monitorowania natężenia przepływu i pokrętła natężenia przepływu w celu zapewnienia, że to samo natężenie przepływu jest używane we wszystkich przebiegach
Zestaw AbC Anti-Mouse BeadTechnologiesA-10344używany do kontroli kompensacji i ujemnych kulek AbC stosowany w metodzie opartej na koralikach
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)Santa Cruz SC-281108Stosowany w indywidualnej metodzie wykrywania wyłącznie do lizy próbek po wstępnym odczycie do wykorzystania jako kontrole ujemne. Wywar można rozcieńczyć w PBS w stosunku 1:10 i przechowywać w lodówce do 1 miesiąca.
Rurki BD TruCOUNTBD Biosciences340334stosowane zawsze, gdy potrzebne są bezwzględne stężenia EV
Ultrafree-MC, GV 0,22 i mikro; m Filtry odśrodkoweMillipore UFC30GVNBsłuży do mycia EV po barwieniu i/lub frakcjonowania EV w zależności od wielkości
Szklane probówki na krew pełną Vacutainer ACD-ABD Biosciences364606
probówki Facs 12x75 polystreneBD Biosciences352058
50 ml Zbiorniki pakowane pojedynczo PhenixRR-50-1s
Green-Pak - 10 i mikro; lKońcówkiRainin GP-L10S
Green-Pak -200 i mikro; l KońcówkiGP-L250S
Green -Pak - 1 000 &mikro; l RaininGP-L1000S
Stabilny stos Końcówki L300 wstępnie sterylizowaneRaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8-kanałowy LTS  Regulowany  Podkładka dystansowa RaininLA8-300XLS
tkankowychE& K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Pożywka (bez Hepes)UCSF Cell Culture FacilityCCFAE001pożywki używane do metody wykrywania opartej na kulkach
Dulbeccos PBS D-PBS, wolne od CaMg, 0,2 i mikro; m filtrowanyUCSF Zakład hodowli komórkowychCCFAL003
Probówka ultrawirówkowa, cienkościenna, ultraprzezroczystaBECKMAN COULTER INC PANEL
I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 & mikro; l
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 i mikro; l
CD16 V450BD Nauki biologiczne5604742 i mikro; l
CD28 FITCbiolegend3029062 i mikro; l
CD152 APCBD Biosciences5558552 i mikro; l
CD19 A700Biolegend3022262 i mikro; l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 i mikro; l
CD62L APCBiolegend3048102 i mikro; l
CD108 PE BD Biosciences5528302 & mikro; l
CD235a FITCbiolegend3491042 i mikro;
l PANEL III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 i mikro; l
CD62pAPC Biolegend3049102 i mikro; l
CD66b PE Biolegend3051062 i mikro; l
CD15 FITCexalphaX1496M5 i mikro; l
CD9 PEBiolegend555372
CD63 APCBiolegend353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κLegenda biologiczna400230
Końcówki do pipet do pipet do pipet Rainin 96-dołkowe płytki do hodowli 344058

Bibliografia

  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  2. Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
  3. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
  5. Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  6. Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
  7. Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  8. Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23(2013).
  9. Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
  10. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  11. Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
  12. Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  13. Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
  14. Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
  15. Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
  16. Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
  17. Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
  18. Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
  19. Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
  20. Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
  21. György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  22. Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
  23. Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
  24. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
  25. Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
  26. Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
  27. György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726(2012).
  28. György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
  29. György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
  30. Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
  31. Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
  32. Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
  33. Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
  34. Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  35. Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Detekcja oparta na kuleczkachdetekcja pojedynczaosocze ubogie w płytki krwibarwienie przeciwciałamikonfiguracja cytometrucząstki fluorescencyjnekuleczki polistyrenowerozproszenie przednie
Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.