Method Article

Techniki analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/52484

⸱

March 17th, 2015

 ,  , 
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele różnych metod pomiaru pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Przy określaniu najodpowiedniejszej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono dwa protokoły pomiaru EV, wykorzystujące albo indywidualną detekcję, albo podejście oparte na kulkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to małe, błonowe pęcherzyki znajdujące się w płynach ustrojowych, które są silnie zaangażowane w komunikację komórka-komórka i pomagają regulować różnorodny zakres procesów biologicznych. Analiza EV za pomocą cytometrii przepływowej (FCM) była niezwykle trudna ze względu na ich niewielkie rozmiary i brak dyskretnych populacji dodatnich dla markerów będących przedmiotem zainteresowania. Metody analizy EV, choć znacznie ulepszone w ciągu ostatniej dekady, są nadal w toku. Niestety, nie ma jednego uniwersalnego protokołu, a przy określaniu najbardziej odpowiedniej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono tutaj kilka różnych technik przetwarzania EV oraz dwa protokoły analizy EV przy użyciu indywidualnego wykrywania lub podejścia opartego na koralikach. Opisane tutaj metody pomogą w wyeliminowaniu agregatów przeciwciał powszechnie występujących w preparatach komercyjnych, zwiększeniu stosunku sygnału do szumu i ustawieniu bramek w racjonalny sposób, który minimalizuje wykrywanie fluorescencji tła. Pierwszy protokół wykorzystuje indywidualną metodę wykrywania, która szczególnie dobrze nadaje się do analizy dużej ilości próbek klinicznych, podczas gdy drugi protokół wykorzystuje podejście oparte na kulkach do wychwytywania i wykrywania mniejszych EV i egzosomów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to małe, błonowe pęcherzyki znajdujące się w płynach ustrojowych, które są silnie zaangażowane w komunikację komórka-komórka i pomagają regulować różnorodny zakres procesów biologicznych. Analiza EV za pomocą cytometrii przepływowej (FCM) była niezwykle trudna ze względu na ich niewielkie rozmiary i brak dyskretnych populacji dodatnich dla markerów będących przedmiotem zainteresowania. Metody analizy EV, choć znacznie ulepszone w ciągu ostatniej dekady, są nadal w toku. Niestety, nie ma jednego uniwersalnego protokołu, a przy określaniu najbardziej odpowiedniej metody należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Przedstawiono tutaj kilka r....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Następujące protokoły zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu człowieka. Wszystkie próbki pobrane od ludzi zostały przetestowane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję rewizyjną (IRB) i za świadomą zgodą badanych.

1. METODA A: Indywidualna metoda wykrywania

1.1) Przetwarzanie próbki krwi/izolacja EV

  1. Pobrać krew od dawcy/pacjenta do dwóch szklanych probówek o pojemności 10 ml zawierających 1,5 ml roztworu ACD A lub innego odpowiedniego antykoagulantu i natychmiast (w ciągu maksymalnie 30....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat przetwarzania izolacji i wykrywania pojazdów elektrycznych przy użyciu metody opartej na koralikach lub metody wykrywania indywidualnego. Indywidualne wykrywanie EV za pomocą FCM sprawdza się dobrze w przypadku analizy większych EV, ale większość cytometrów nie jest w stanie indywidualnie wykryć cząstek tak małych jak egzosomy. Podejście oparte na koralikach pozwala na wykrycie małych pojazdów elektrycznych, jednak stosowanie tej metody ma swoje wady, jak przedstawion.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaprezentowano dwa różne protokoły izolacji, leczenia i analizy EV, wykorzystujące metodę indywidualnego wykrywania lub podejście oparte na kulkach. Wybór najodpowiedniejszej metody nie zawsze jest prosty i wymaga zrozumienia badanej próbki, a także poszczególnych subpopulacji, które są przedmiotem zainteresowania. Ponadto przy wyborze najodpowiedniejszej metody należy wziąć pod uwagę czułość cytometru używanego do akwizycji. Często nie ma jednego najlepszego protokołu do użycia, raczej kombinacja metod dostarcza więcej .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Dale'owi Hirschkornowi z Instytutu Badań nad Systemami Krwi za pomoc w ustawieniach cytometru przepływowego. Prace te były wspierane przez granty NIH HL095470 i U01 HL072268 oraz kontrakty DoD W81XWH-10-1-0023 i W81XWH-2-0028.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Laboratoryjny cytometr przepływowy LSR IIBD Biosciences3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm niebieski, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm fioletowy i 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm czerwony)
Oprogramowanie FACS Diva Oprogramowanie BD BiosciencesPC w wersji 6.0
FlowJo Treestar USMac wersja 9.6.1 lub PC wersja 7.6.5
Cząstki fluorescencyjne Sphero RainbowBD Biosciences556298używane do regulacji wszystkich napięć kanałów w celu utrzymania spójności intensywności fluorescencji 
Cząsteczki fluorescencyjne Ultra Rainbow SpherotechURFP-10-5stosowany jako dodatek do kulek SSC Megamix-Plus w celu zapewnienia spójności bramkowania EV z partii na partię
Kulki Megmix-Plus SSCBiocytex7803służy do regulacji napięć FSC i SSC w celu utrzymania  spójności  między cyklami. Może być również używany do monitorowania natężenia przepływu i pokrętła natężenia przepływu w celu zapewnienia, że to samo natężenie przepływu jest używane we wszystkich przebiegach
Zestaw AbC Anti-Mouse BeadTechnologiesA-10344używany do kontroli kompensacji i ujemnych kulek AbC stosowany w metodzie opartej na koralikach
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)Santa Cruz SC-281108Stosowany w indywidualnej metodzie wykrywania wyłącznie do lizy próbek po wstępnym odczycie do wykorzystania jako kontrole ujemne. Wywar można rozcieńczyć w PBS w stosunku 1:10 i przechowywać w lodówce do 1 miesiąca.
Rurki BD TruCOUNTBD Biosciences340334stosowane zawsze, gdy potrzebne są bezwzględne stężenia EV
Ultrafree-MC, GV 0,22 i mikro; m Filtry odśrodkoweMillipore UFC30GVNBsłuży do mycia EV po barwieniu i/lub frakcjonowania EV w zależności od wielkości
Szklane probówki na krew pełną Vacutainer ACD-ABD Biosciences364606
probówki Facs 12x75 polystreneBD Biosciences352058
50 ml Zbiorniki pakowane pojedynczo PhenixRR-50-1s
Green-Pak - 10 i mikro; lKońcówkiRainin GP-L10S
Green-Pak -200 i mikro; l KońcówkiGP-L250S
Green -Pak - 1 000 &mikro; l RaininGP-L1000S
Stabilny stos Końcówki L300 wstępnie sterylizowaneRaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8-kanałowy LTS  Regulowany  Podkładka dystansowa RaininLA8-300XLS
tkankowychE& K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Pożywka (bez Hepes)UCSF Cell Culture FacilityCCFAE001pożywki używane do metody wykrywania opartej na kulkach
Dulbeccos PBS D-PBS, wolne od CaMg, 0,2 i mikro; m filtrowanyUCSF Zakład hodowli komórkowychCCFAL003
Probówka ultrawirówkowa, cienkościenna, ultraprzezroczystaBECKMAN COULTER INC PANEL
I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 & mikro; l
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 i mikro; l
CD16 V450BD Nauki biologiczne5604742 i mikro; l
CD28 FITCbiolegend3029062 i mikro; l
CD152 APCBD Biosciences5558552 i mikro; l
CD19 A700Biolegend3022262 i mikro; l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 i mikro; l
CD62L APCBiolegend3048102 i mikro; l
CD108 PE BD Biosciences5528302 & mikro; l
CD235a FITCbiolegend3491042 i mikro;
l PANEL III
CD11b PE-Cy7Biolegend3013222 i mikro; l
CD62pAPC Biolegend3049102 i mikro; l
CD66b PE Biolegend3051062 i mikro; l
CD15 FITCexalphaX1496M5 i mikro; l
CD9 PEBiolegend555372
CD63 APCBiolegend353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κLegenda biologiczna400230
Końcówki do pipet do pipet do pipet Rainin 96-dołkowe płytki do hodowli 344058

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  2. Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesFlow CytometryBead Based DetectionIndividual DetectionPlatelet Poor PlasmaAntibody StainingCytometer SetupFluorescent ParticlesPolystyrene BeadsForward Scatter

Related Articles