Method Article

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

DOI:

10.3791/52487

⸱

December 22nd, 2014

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Saarland School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anatomiczne śledzenie ścieżek ma kluczowe znaczenie dla rozszyfrowania związku między mózgiem a zachowaniem. Rozwikłanie zagadki powstawania obwodów nerwowych podczas embrionalnego dojrzewania mózgu jest jednak wyzwaniem technicznym, ponieważ większość opracowanych do tej pory metod śledzenia transsynaptycznego opiera się na wstrzyknięciu znacznika stereotaktycznego. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy binarną strategię genetyczną warunkowego genetycznego śledzenia transsynaptycznego w mózgu myszy. W tym celu wygenerowaliśmy dwa komplementarne szczepy myszy knock-in, aby selektywnie eksprymować dwukierunkową transsynaptyczną lektynę jęczmienia znacznikowego (BL) i wsteczny transsynaptyczny znacznik transsynaptyczny fragment toksyny tężcowej C z locus ROSA26 po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Specyficzna dla komórki produkcja znacznika u tych myszy jest zakodowana genetycznie i nie zależy od mechanicznego wstrzyknięcia znacznika. Dlatego nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia obwodów nerwowych w embrionalnym mózgu myszy. Ponadto, ponieważ przenoszenie znacznika między synapsami zależy od aktywności synaptycznej, te szczepy myszy mogą być wykorzystywane do analizy komunikacji między genetycznie zdefiniowanymi populacjami neuronów podczas rozwoju mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół śledzenia transsynaptycznego w zarodkach myszy przy użyciu nowych rekombinowanych alleli ROSA26. Wykorzystaliśmy tę eksperymentalną technikę w celu nakreślenia obwodów neuronalnych leżących u podstaw dojrzewania osi rozrodczej w rozwijającym się mózgu samicy myszy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anatomiczne śledzenie ścieżek jest jednym z najczęściej używanych narzędzi do rozszyfrowywania związku między mózgiem a zachowaniem1. Postęp w technologiach śledzenia obwodów neuronowych umożliwił neuronologom śledzenie obwodów neuronowych z genetycznie zidentyfikowanych populacji neuronów u myszy2. Pomimo tych postępów technicznych, nadal wyzwaniem pozostaje rozwikłanie zagadki powstawania obwodów neuronalnych, zwłaszcza podczas dojrzewania embrionalnego. Dzieje się tak, ponieważ większość opracowanych do tej pory metod śledzenia opiera się na stereotaktycznym wstrzykiwaniu znaczników transsynaptycznych lub genetycznie zmodyfikowanych wirusów ne....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez komitet ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu w Hamburgu i Uniwersytetu Kraju Saary.

1. Przygotowanie i utrwalenie tkanki embrionalnej

  1. Zorganizuj cały sprzęt potrzebny do wypreparowania zarodków i przygotuj roztwory do późniejszego utrwalenia tkanki przed złożeniem zwierząt w ofierze.
    UWAGA: Zawsze przygotuj świeży 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) (4% PFA w 0,1 M buforowanej soli fizjologicznej (PBS) w fosforanie, dostosuj pH do 7,4).
  2. Eutanazja ciężarnej samicy myszy w czasie za pomocą etycznie zatwierdzonej procedury.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta sekcja pokazuje reprezentatywne wyniki, które można uzyskać, pracując z allelami R26-BIZ (B, L-I, RES-τlac, Z) i R26-GTT (G, FP-TT, C). Tutaj używamy alleli R26-BIZ i R26-GTT do analizy dojrzewania obwodów nerwowych regulujących oś rozrodczą. Rozmnażanie u kręgowców jest centralnie kontrolowane przez niewielki podzbiór neuronów w podwzgórzu, które wydzielają hormon u.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja znaczników transsynaptycznych jako transgenów w celu śledzenia obwodów neuronalnych genetycznie zdefiniowanych populacji neuronów ma kilka zalet w porównaniu ze stereotaktycznym wstrzykiwaniem znaczników lub wirusów neurotopowych. Po pierwsze, znacznik jest wytwarzany jako białko endogenne i dlatego nie wywołuje żadnej odpowiedzi immunologicznej, a selektywna ścieżka neuronalna może być analizowana u różnych zwierząt z wysoką odtwarzalnością. Po drugie, ponieważ jest to metoda nieinwazyjna, można ją wykorzystać.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Michaelowi Candlishowi za krytyczne uwagi na temat rękopisu. Projekt ten został wsparty grantami Deutsche Forschungsgemeinschaft BO1743/6 oraz SFB/TRR 152 P11 i Z02 dla Ulricha Boehma.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bisbenzimid (barwnik Hoechst 33258)Sigma14530-100MG
EtanolSigma32205-1L
Forma kriogeniczna (Peel-a-way)Polyscience Inc.18646A-122 x 22 x 20 mm
DMSOSigmaD8418-100ML
Dimetyloformamid (DMF)VWR Chemicals23470,293
EGTAROTH3054.3
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Aldehyd glutarowySigmaG5882-50ML
Nadtlenek wodoruSigma34988-7
Izopentan (metylo-2-butan)SigmaM32631-2.5L
Kaiser's glicyna żelatynaMerck1092420100
MetanolSigma494437-1L
MgCl2SigmaM2670-100G
NaClROTHHN00.2
NBTSigma298-83-9
Nonidet P40 substytutFluka743.85
OCTLeica14020108926
PAP długopisDakoS2002
ParafarmaldehydSigmaP6148-1KG
Deoksycholan soduSigmaD6750-25G
SacharozaSigmaS7903-1KG
Zjeżdżalnie SuperfrostZestaw Thermo ScientificFT4981GLPLUS
TSAZestaw PerkinElmerNEL700
TSA plus zestawPerkinElmerNEL749A001KT
TrisROTHAE15.2
Triton-X 100ROTH3051.2
Tween 20ROTH9127.1
X-galROTH2315.1
Mikroskop CryostatLeicana
Light wyposażony w obrazowanie DICZeissAxioskop2 wyposażony w oprogramowanie
Mikroskop FluroscenceZeissAxioskop2 wyposażony w oprogramowanie
PhotoshopAdobePS6
Goat anty-WGA (rozpoznaje BL)Wektor LaboratoriaAS-2024
Biotinylaid koń anty-kozi IgGWektor LabatoriaBA-9500
Biotynylowane kozy anty-królicze IgGVector LaboatoriaBA-1000
Królik anty-GFP (rozpoznaje GTT)InvitrogenA11122
Królik anty-GnRHAffinity Bio ReagentPA1-121
Dylight488-osioł anty-królicze IgGThermo ScientificSA5-10038
SA-Alexa Fluor 546Life TechnologiesS-11225
Primers
BL Fwd (do genotypowania BIZ)Eurofins MWG OperonATGAAGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (do genotypowania BIZ)Eurofins MWG OperonAGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (do genotypowania Cre)Eurofins MWG OperonGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (do genotypowania Cre)Eurofins MWG OperonCCAGGCTAAGTGCCTTCTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (do genotypowania GTT)Eurofins MWG OperonAGCAAGGGCGAGCTGTT
TTC Rev (do genotypowania GTT)Eurofins MWG OperonGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (do genotypowania płci)Eurofins MWG OperonTGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (do genotypowania płci)Eurofins MWG OperonCCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 FwdEurofins MWG OperonCGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 RevEurofins MWG OperonGCAGATGGAGCGGGAGAAT
SA RevEurofins MWG OperonCGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
Axio VisionAxio Vision

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
  2. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Conditional Genetic TracingTranssynaptic TracingEmbryonic Mouse BrainNeural Circuit FormationCre Mediated RecombinationROSA26 AllelesBarley Lectin TracerTetanus Toxin Fragment CSingle Cell ResolutionReproductive Axis Maturation

Related Articles