Artykuł metodologiczny

Przewodnik po generowaniu i wykorzystywaniu NPC pochodzących z hiPSC do badania chorób neurologicznych

DOI:

10.3791/52495

⸱

21 lutego 2015

 ,  , 
1Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak neuronalne komórki progenitorowe mogą być odróżniane od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w celu uzyskania solidnej i replikacyjnej populacji komórek nerwowych, która może być wykorzystana do identyfikacji ścieżek rozwojowych przyczyniających się do patogenezy choroby w wielu zaburzeniach neurologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania pośmiertne chorób neurologicznych nie są idealne do identyfikacji przyczyn inicjacji choroby, ponieważ wiele chorób obejmuje długi okres progresji choroby przed wystąpieniem objawów. Ponieważ fibroblasty pochodzące od pacjentów i osób zdrowych mogą być skutecznie przeprogramowywane w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), a następnie różnicowane w neuronalne komórki progenitorowe (NPC) i neurony w celu badania tych chorób, możliwe jest teraz podsumowanie zdarzeń rozwojowych, które wystąpiły przed wystąpieniem objawów u pacjentów. Przedstawiamy metodę, za pomocą której można skutecznie różnicować hiPSC w NPC, które oprócz tego, że są zdolne do dalszego różnicowania się w funkcjonalne neurony, mogą być również silnie pasażowane, zamrażane i rozmrażane lub przekształcane w neurosfery, umożliwiając szybkie genetyczne badania przesiewowe w celu identyfikacji czynników molekularnych, które wpływają na fenotypy komórkowe, w tym replikację, migrację, stres oksydacyjny i / lub apoptozę. Nanokomórki NPC hiPSC pochodzące od pacjentów to wyjątkowa platforma, idealnie nadająca się do empirycznego testowania komórkowych lub molekularnych konsekwencji manipulowania ekspresją genów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania ekspresji genów neuronów zróżnicowanych in vitro z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) przez nas 1 i innych 2,3 wskazują, że neurony hiPSC przypominają raczej tkankę mózgową płodu niż dorosłego. Obecnie modele oparte na hiPSC mogą być bardziej odpowiednie do badania predyspozycji do chorób neurologicznych, a nie późnych cech choroby. Wcześniej informowaliśmy, że znaczna część sygnatury genów neuronów pochodzących ze schizofrenii hiPSC jest konserwatywna w nerwowych komórkach progenitorowych (NPC) pochodzących ze schizofrenii, co wskazuje, że NPC mogą być użytecznym typem komórek do badania szlaków molekularnych przyczyniających się do schizofrenii 1. My i inni odnotowaliśmy nieprawidłową migrację, zwiększony stres oksydacyjny i reaktywne formy tlenu, wrażliwość na podprogowe stresy środowiskowe i upośledzoną funkcję mitochondriów u NPC hiPSC schizofrenii 1,4-6, a także zmniejszoną łączność neuronalną i funkcję synaps w neuronach hiPSC schizofrenii 5,7-10. Jeśli czynniki molekularne przyczyniające się do nieprawidłowej migracji i/lub stresu oksydacyjnego u NPC hiPSC schizofrenii leżą również u podstaw zmniejszonej łączności neuronalnej w neuronach pochodzących ze schizofrenii hiPSC, NPC mogą być solidną i wysoce replikacyjną populacją neuronalną, za pomocą której można badać mechanizmy odpowiedzialne za chorobę. Ponadto, ponieważ można szybko wygenerować dużą liczbę komórek i nie trzeba czekać tygodniami lub miesiącami na dojrzewanie neuronów, testy oparte na NPC są odpowiednie do badania większych kohort pacjentów i są bardziej podatne na wysokoprzepustowe badania przesiewowe. Uważamy, że NPC hiPSC mogą służyć jako wskaźnik zastępczy dla szlaków rozwojowych potencjalnie przyczyniających się do patogenezy choroby, co zostało już wykazane w zaburzeniach tak różnych, jak schizofrenia 1 i choroba Huntingtona 11.

Aby odróżnić NPC od hiPSC, początkowa indukcja neuronalna jest realizowana przez podwójne hamowanie SMAD (0,1μM LDN193189 i 10μM SB431542) 12. Poprzez antagonizowanie sygnalizacji BMP i TGFβ za pomocą tych małych cząsteczek, specyfikacja endodermy i mezodermy jest blokowana, przyspieszając różnicowanie neuronów i prowadząc do powstania widocznych rozet nerwowych w ciągu tygodnia od posiewu. Wzorce neuronalne pojawiają się na wczesnym etapie tego procesu, prawdopodobnie w okresie tworzenia się rozety nerwowej i bezpośrednio po niej. Wobec braku innych wskazówek, te prymitywne komórki nerwowe przyjmują los podobny do losu przodomózgowia w przedniej części mózgu13. Bezpośrednio po utworzeniu rozety neuronalnej i trwającej przez cały okres ekspansji NPC, NPC przodomózgowia są hodowane z FGF2 8,14. Mają potencjał podwójnej linii i mogą być różnicowane do populacji neuronalnych składających się z 70-80% neuronów βIII-TUBULINA-dodatnich i 20-30% astrocytów glial-fibrylarnych kwaśnych białek fibrylarnych (GFAP) (ryc. 1). Większość neuronów hiPSC w przodomózgowiu jest VGLUT1-dodatnia, a więc przypuszczalnie glutaminergijna, chociaż około 30% neuronów jest GAD67-dodatnich (GABAergicznych) 8.

NPC są rutynowo przepasywane ponad dziesięć razy in vitro, zachowując przy tym spójne profile różnicowania i bez gromadzenia nieprawidłowości kariotypu. Grupy zgłaszały przejście NPC ponad 40 razy 15, jednak okazuje się, że powyżej dziesięciu pasaży NPC wykazują zwiększoną skłonność do różnicowania astrocytów. NPC dobrze tolerują wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie i mogą zostać przekształcone w neurosfery, po prostu hodując je na nieprzylegających płytkach. NPC są skutecznie transdukowane przez wektory wirusowe, co umożliwia szybką ocenę molekularnych i komórkowych konsekwencji zaburzeń genetycznych i można je łatwo rozbudować w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału do badań biochemicznych. Ponadto, ponieważ wektory wirusowe pozwalają na silną nadmierną ekspresję i/lub knockdown genów istotnych dla choroby, zarówno w komórkach nerwowych kontrolnych, jak i pochodzących od pacjenta, można wykorzystać tę platformę do przetestowania wpływu tła genetycznego na te manipulacje. Chociaż NPC nie nadają się do testów synaptycznych lub opartych na aktywności wymagających dojrzałych neuronów, mogą być praktyczną alternatywą dla wielu prostych analiz molekularnych lub biochemicznych komórek nerwowych pochodzących od pacjenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Różnicowanie hiPSC do neuronalnych komórek progenitorowych

  1. Hoduj i rozszerzaj hiPSC w pożywkach z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HES) (Tabela 1) współhodowanych na warstwie zasilającej mysi fibroblast embrionalny (mEF), aż duże (ale subkonfluentne) kolonie będą gotowe do różnicowania neuronalnego za pomocą pośredniej postaci ciała zarodka (EB) (ryc. 2). Rutynowe warunki hodowli hiPSC są dobrze opisane w innym miejscu 16,17; krótko mówiąc, hoduj hiPSC w pożywce HES na warstwie zasilającej mEF aż do zlewania się, a następnie enzymatycznie pasażuj z kolagenazą (1 mg / ml w DMEM) i rozszerzaj się około 1: 3 co 7 dni.
  2. Aby przygotować płytki pokryte poli-L-ornityną/lamininą, pokryj płytki 10 μg/ml poli-L-ornityny w sterylnej wodzie dla powierzchni plastikowych (50 μg/ml dla powierzchni szklanych) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3-24 godziny. Umyj co najmniej raz sterylną wodą, a następnie pokryj 5 μg/ml Lamininy w sterylnym PBS w temperaturze pokojowej przez 3-24 godz.
    UWAGA: W przypadku zapakowania w folię talerze można przechowywać do sześciu miesięcy w temperaturze -20 ºC.
  3. W dniu 1 enzymatycznie podkonfluwające się hiPSC (zwykle hodowane na mEF lub hiPSC hodowane w określonych pożywkach, takich jak TeSR 18 na Matrigel) z płytki jako duże kolonie za pomocą 1 mg / ml Kolagenazy IV w DMEM / F12.
    UWAGA: Po 1-2 godzinach inkubacji w temperaturze 37 ºC, kolonie będą unosić się w naczyniu.
  4. Delikatnie przemyć kolonie hiPSC (przez osiadanie, nie odwirowywanie) 1-2x DMEM/F12, ponownie zawiesić w 2 ml / studzience pożywki N2 / B27 (Tabela 1) i przenieść do nieprzylegających naczyń 6-dołkowych (połączyć 3 dołki w 1 dołku) 19,
    UWAGA: W ciągu nocy kolonie utworzą unoszące się w powietrzu kuliste skupiska zwane "ciałami embrionalnymi" (EB). Spodziewaj się znacznej śmierci komórkowej.
  5. W dniu 2 przechyl płyty i pozwól EB się osadzić. Ostrożnie usuń media i umyj raz za pomocą DMEM/F12, aby usunąć zanieczyszczenia. Podawać pożywką N2/B27 uzupełnioną podwójnymi inhibitorami SMAD (0,1 μM LDN193189 i 10 μM SB431542) 12.
  6. W dniach 3-7 neuralizacja nastąpi w kontekście podwójnego hamowania SMAD; sprawdź, czy EB są okrągłe, ale nie torbielowate. Podawać EB co drugi dzień pożywką N2/B27 uzupełnioną o 0,1 μM LDN193189 i 10 μM SB431542.
  7. W dniach 7-14, po posiewie EB na płytkach pokrytych poli-L-ornityną/laminą, sprawdź za pomocą mikroskopu jasnego pola, czy rozety nerwowe zaczynają pojawiać się w ciągu kilku dni (scharakteryzowane jako okrągłe skupiska komórek neuroepitelialnych o polaryzacji apiko-podstawnej; Rysunek 1). Kontynuuj podawanie przylegających EB co drugi dzień pożywką N2/B27 uzupełnioną 0,1 μM LDN193189, 10 μM SB431542 i 1 μg/ml lamininy.

2. Zbiór rozet nerwowych

UWAGA: Zalecamy, aby rozety neuronalne były zbierane enzymatycznie za pomocą odczynnika Neural Rosette Selection 20 lub podobnego odczynnika selekcyjnego. Chociaż rozety neuronowe można ręcznie pobrać na 6-dołkową płytkę pokrytą poli-L-ornityną/laminą, opanowanie tej metodologii wymaga intensywnego szkolenia i, w zależności od umiejętności użytkownika, może wymagać drugiej rundy zbierania w 20 dniu, aby jeszcze bardziej wzbogacić NPC i zubożyć typy komórek nienerwowych.

  1. W celu enzymatycznej selekcji rozet nerwowych w dniu 14, odessać pożywkę z przylegających EB i dodać 1 ml odczynnika do wyboru rozety neuronalnej na dołek dla płytki 6-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  2. Za pomocą pipetmana P1000 delikatnie usuń enzym z każdej studzienki. Dodaj 1 ml DMEM/F12 na studzienkę do przemycia.
  3. Za pomocą P1000 zbierz 1 ml DMEM/F12 i szybko wyrzuć DMEM/F12 z powrotem do studzienki, odrywając w ten sposób rozety od płytki. Zbierz rozety do probówki sokoła.
  4. Odpipetować kolejny 1 ml DMEM/F12 i szybko wypuścić do tego samego dołka, aby odłączyć pozostałe rozety. (Nie rozcierać. Staraj się nie rozbijać agregatów rozety). Zbierz rozety neuronalne do tej samej rurki sokoła.
  5. W razie potrzeby powtórz krok 2.4. Jeśli rozety nie odklejają się łatwo, dodaj więcej enzymu i powtórz proces (kroki 2.1-2.4)
  6. Wiruj komórki w odległości 300 x g przez 3 min. Odessać płuczkę i ponownie zawiesić rozety w 2 ml pożywki NPC (Tabela 1). Przenieś komórki (1:1) do 6-dołkowej płytki pokrytej poli-L-ornityną/laminą.
  7. Od 15 do 21 dni rozety nerwowe będą się rozszerzać; karmić rozety co drugi dzień pożywką NPC.
  8. Oceń jakość rozet nerwowych i upewnij się, że płaskie komórki podobne do fibroblastów nie rozszerzają się w hodowli.
    UWAGA: Jeśli nie ma rozet, kultura NPC może czasami zostać uratowana przez ręczne wybieranie, wybierając tylko najlepsze z wybranych rozet do Accutase. Dysocjacja trwa 15 minut w temperaturze 37 ºC. Osadzanie, mycie i płytkowanie w pożywce NPC na 24-dołkowej płytce pokrytej poli-L-ornityną/laminą.

3. Ekspansja nerwowych komórek progenitorowych

UWAGA: NPC hiPSC mogą być uprawiane na płytkach pokrytych Matrigelem lub Poli-L-Ornityną/Lamininą. Zazwyczaj używamy płytek Matrigel, ponieważ można je przygotować szybciej i przy niższych kosztach.

  1. Aby przygotować płytki powlekane Matrigelem, należy szybko rozmrozić i ponownie zawiesić 1 mg zamrożonej porcji Matrigelu w 24 ml zimnego DMEM/F12 i natychmiast rozprowadzić 2 ml do każdego dołka z dwóch sześciodołkowych płytek. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Matrigel należy jedynie zassać, a nie umyć, bezpośrednio przed użyciem.
  2. Karmić NPC co drugi dzień i utrzymywać bardzo wysokie zagęszczenie, w przeciwnym razie spontanicznie różnicują się w neurony.
    UWAGA: Chociaż bardziej doświadczeni NPC są zazwyczaj dzieleni 1:4 co tydzień, NPC o bardzo niskim przejściu mogą być dzieleni 1:2 tak rzadko, jak raz na dwa tygodnie.
  3. Aby podzielić, najpierw odessać pożywkę i dodać 1 ml ciepłej Accutase (1X) na dołek 6-dołkowej płytki. Inkubować w temperaturze 37 ºC przez 10-15 minut.
  4. Delikatnie przenieś oderwane komórki do 15 ml probówki zawierającej DMEM/F12 przy jak najmniejszym obciążeniu mechanicznym. Nie miareczkować komórek w enzymie. Granulki przez wirowanie z prędkością 1 000 x g przez 5 min.
  5. Odessać płuczkę i ponownie zawiesić NPC w ~1 ml pożywki NPC na oryginalną studzienkę 6-dołkową.
    UWAGA: Spodziewaj się, że zlewająca się studzienka z 6-dołkowej płytki ma 5-10 milionów komórek; Można to potwierdzić, licząc 10 μl podwielokrotności komórek za pomocą hematocytometru przed ponownym posiewem.
  6. Po ponownym zawieszeniu, ponownie umieść NPC jako NPC, neurony lub neurosfery. Aby utrzymać NPC, płytkuj około 1-2 miliony komórek na dołek 6-dołkowej płytki. Skuteczność tworzenia neurosfery może się różnić w zależności od eksperymentów i linii komórkowych, ale generalnie występuje najlepiej, jeśli od 200 000 do 1 000 000 komórek zostanie wysianych na studzience nieprzylegającej płytki 6-dołkowej; Jeśli dojdzie do zlepiania się neurosfer, zmniejsz liczbę wysiewanych komórek. Aby różnicować się do neuronów, umieść około 200 000 komórek na dołku na 6-dołkowej płytce, zastępując pożywkę NPC pożywką Neuron
    7. .
  7. Immunohistochemicznie zwaliduj każdą ustaloną linię NPC. Po namnażeniu wystarczającej ilości materiału komórkowego oznacz NPC przeciwciałami przeciwko NESTIN i SOX2. Zwalidowane linie NPC powinny być również różnicowane w neurony przez 4-6 tygodni i znakowane przeciwciałami przeciwko βIII-TUBULINIE i MAP2AB.
    1. Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie w PBS w temperaturze 4°C przez 10 min. Utrwal NPC w RT przez 15 min w 1,0% Triton w PBS, a następnie zablokuj 5% surowicę osła 0,1% Tritonem w RT przez 30 min.
    2. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w 5% surowicy osła z 0,1% Tritonem, przez noc w temperaturze 4°C.
      UWAGA: Zalecamy następujące przeciwciała: kozioł anty-Sox2, 1:200; mysz anty-ludzka Nestin, 1:200; królicza anty-βIII-tubulina, 1:500; mysia anty-βIII-tubulina, 1:500; mysz anty-MAP2AB, 1:200. (Rysunek 2).
    3. Po przemyciu PBS inkubować komórki przeciwciał drugorzędowych z odpowiednim sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym dla kozy, myszy lub królika w stosunku 1:300, w 5% surowicy osła z 0,1% Tritonem przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej. Aby uwidocznić jądra, wybarwić komórki 0,5 μg/ml DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol), a następnie zamontować za pomocą Vectashield.

4. Transdukcja NPC

  1. Stosować spinfection (wirowanie płytek do hodowli komórkowych w obecności wirusa w dawce 1,000 x g przez 1 godzinę) w celu zwiększenia odsetka transfekowanych komórek 21. Odessać pożywkę i zastąpić odpowiednimi nadekspresjami (lub kontrolą) lentiwirusy (lub retrowirusy), o pożądanej wielokrotności infekcji (MOI) (zwykle 1-10), rozcieńczone w pożywce NPC. Użyć 1,5 ml objętości na dołek płytki 6-dołkowej (lub odpowiednio przeskalowanej objętości dla innych rodzajów płytek do hodowli tkankowych). Wirować w temperaturze 1.000 x g i temperaturze 37 ºC przez 1 godzinę w wirówce płytkowej.
    UWAGA: Najlepiej jest transdukować NPC za pomocą wektorów lentiwirusowych lub retrowirusowych w ciągu 1-2 dni od rozszczepienia. Niezależnie od tego, czy używasz wirusów komercyjnych, czy przygotowanych laboratoryjnie, pomocne może być odpowiednie mianowanie partii wirusa z wyprzedzeniem poprzez seryjne rozcieńczanie. (Rysunek 3).
  2. Aby zmniejszyć śmierć komórkową, wymień pożywkę w ciągu 8 godzin od infekcji.
    UWAGA: Integracja wirusa i ekspresja transgenu powinny być wykrywalne w ciągu 24 godzin przez fluorescencję genu reporterowego. (Jeśli wirus nie ma fluorescencyjnego reportera, jest to trudniejsze do oceny; udana transfekcja może być najlepiej zweryfikowana za pomocą immunoblot, immunohistochemii lub qPCR dla produktów nadekspresji). Pełne odciągnięcie może zająć 3-7 dni; Wielokrotne infekcje dodatkowym wirusem mogą być wymagane w celu zwiększenia odsetka transfekowanych komórek. Nawracające infekcje mogą występować codziennie, ale nie muszą być tak częste. Idealnie, jeśli używasz reportera fluorescencyjnego, >80% komórek powinno być oznakowanych.

5. Test migracji neurosfery

UWAGA: Neurosfery tworzą się spontanicznie, po enzymatycznej dysocjacji NPC (w sposób identyczny jak w przypadku ekspansji NPC - kroki 3.3-3.6), jeśli komórki są hodowane w zawiesinie w pożywce NPC.

  1. Krótko mówiąc, hoduj zdysocjowane NPC w pożywkach NPC przez 48 godzin na nieprzylegających płytkach, aby wygenerować neurosfery. (Rysunek 4).
  2. W przypadku migracji neurosfery przygotuj świeże płytki Matrigel przy użyciu zimnych pożywek NPC, a nie DMEM, na 96-dołkowej płytce, 1-2 godziny przed pobraniem neurosfery. Nie odsysaj Matrigelu ze studzienek.
  3. Jak pierwotnie opublikowano dla embrionalnych neurosfer pochodzących z komórek macierzystych 22, ręcznie wybierz neurosfery pochodzące z NPC pod mikroskopem, po jednokrotnym umyciu w pożywce NPC w celu usunięcia resztek komórkowych. Przenieś jedną neurosferę do każdej studzienki 96-dołkowej płytki pokrytej Matrigelem.
  4. Dodaj dodatkowe 0,5 mg Matrigel, rozcieńczonego w zimnym pożywce NPC, do neurosfer w każdej 96-dołkowej płytce.
  5. Ręcznie wyśrodkuj każdą pojedynczą neurosferę w środku studzienki za pomocą końcówki pipety.
    UWAGA: Ważne jest, aby wybrać neurosfery o podobnej wielkości, aby zmniejszyć zmienność wyników.
  6. Pozwól na migrację przez 48 godzin, a następnie utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu i wybarwij pożądanymi markerami immunohistochemicznymi.
  7. Jeśli ma być określona migracja radialna, sfotografuj neurosfery w całości za pomocą obiektywu mikroskopowego 4x. Wyklucz z analizy wszelkie neurosfery stykające się z krawędzią studzienki lub drugą neurosferą.
    UWAGA: Jeśli migracja trwa dłużej niż 48 godzin, wynikająca z niej migracja promieniowa będzie prawdopodobnie zbyt duża, aby można ją było sfotografować za pomocą obiektywu 4x.
  8. Zmierz średnią migrację z każdej neurosfery za pomocą oprogramowania NIH ImageJ (ryc. 5). Można tego dokonać za pomocą jednej z metod analizy opisanych poniżej:
    1. Migracja promieniowa:
      1. Ręcznie obrysuj krawędź najdalej migrujących komórek za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego, a następnie użyj funkcji Zmierz (Ctrl+M), aby obliczyć obszar wynikowego kształtu. Przed pomiarem powierzchni upewnij się, że pole jest zaznaczone w oknie Ustaw pomiary znajdującym się w zakładce Analizuj. Użyj wartości pomiaru powierzchni i równania dla pola pola okręgu (A=πr2), aby określić promień (zewnętrzny).
      2. Śledź krawędź oryginalnej neurosfery, zmierz obszar i oblicz promień (wewnętrzny) w ten sam sposób. Oblicz całkowitą migrację promieniową jako różnicę między promieniem zewnętrznym i wewnętrznym.
    2. Największa migracja komórkowa:
      1. Zmierz odległość przebytą przez pięć najdalszych komórek od krawędzi wewnętrznej neurosfery za pomocą narzędzia do zaznaczania w linii prostej, a następnie funkcji Zmierz (Ctrl+M).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozety neuronalne można zidentyfikować morfologicznie, używając mikroskopu jasnego pola, po ich charakterystycznym wyglądzie jako okrągłe skupiska komórek neuroepitelialnych o polaryzacji apiko-bazalnej (Rysunek 1). Chociaż NPC są zwykle hodowane w bardzo dużej gęstości komórek, bezpośrednio po pasażowaniu widoczna jest lekko piramidalna struktura somy i dwubiegunowych neurytów (ryc. 1D). Zwalidowane NPC eksprymują NESTIN i SOX2 w większości komórek, chociaż barwienie βIII-TUBULINY jest ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy metody, za pomocą których różnicuje się hiPSC w NPC, typ komórek nerwowych, w którym znaczna część sygnatury genowej neuronów pochodzących z hiPSC jest zachowana i która może służyć jako wskaźnik zastępczy dla szlaków rozwojowych potencjalnie przyczyniających się do patogenezy choroby 8,11. Dodatkowo, jak już szczegółowo opisaliśmy, NPC są solidnie replikującą się i łatwą do transdukcji populacją neuronalną, która naszym zdaniem może być odpowiednia do molekularnych i biochemicznych badań predyspozy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kristen Brennand jest badaczką Fundacji Komórek Macierzystych w Nowym Jorku. Laboratorium Brennanda jest wspierane przez Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 oraz New York Stem Cell Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/F12Life Technologies#11330dla mediów HES
DMEM/F12Life Technologies#10565dla ośrodków neuronowych
KO-Serum ReplacementLife Technologies#10828Musi być przetestowany
GlutamaxLife Technologies#35050
NEAALife Technologies #11140
N2Life Technologies #17502-048Musi być testowany
seryjnie B27-RALife Technologies #12587-010Musi być testowany
FGF2Life Technologies#13256-029Ponowne zawieszenie w PBS + 1% BSA
LDN193189Stemgent#04-0074
SB431542Stemgent#04-0010
BDNFPeprotech#450-02Ponowne zawieszenie w PBS + 0,1% BSA
GDNF Peprotech #450-10Ponowne zawieszenie w PBS + 0,1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMPSigma #D0627Ponowne zawieszenie w PBS + 0,1% BSA
Kwas L-askorbinowySigma#A0278Ponowne zawieszenie w H20
STEMdiff Odczynnik do wyboru rozety neuronowejStemcell Technologies #05832
AccutaseInnowacyjny Technologie komórkoweAT-104
Kolagenaza IVLife Technologies#17104019
CF1 mEFsMilipore#PMEF-CF
Poli-L-OrnitynaSigmaP3655
Laminina, naturalna mysz 1 mgLife Technologies#23017-015
BD MatrigelBD#354230Zawiesić na lodzie w zimnym DMEM w stężeniu 10 mg/ml, użyć 1 mg na dwie równoważne płytki 6-dołkowe
Płytki 6-dołkowe poddane hodowli tkankowejCorning3506
Płytki 6-dołkowe o ultra niskim nasadceCorning3471
kozia anty-Sox2 Santa Cruzsc­ 17320zastosowanie w stosunku 1:200
mysi anty-ludzki NestinMilliporeMAB5326użycie w 1:200
królików anty-β III-tubulinaCovancePRB­ Użycie 435Pw 1:500
myszy anty-β III-tubulinaCovanceMMS&nieśmiały; 435Pzastosowanie w 1:500
mysz anty-MAP2ABSigmaM1406użycie w 1:200
Wirówka płytkowaBeckman CoulterBeckman Coulter Allegra X-14 (z nośnikiem płyty SX4750)
seryjnie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. , (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. , (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. , (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630(2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

hiPSC Derived NPCsNeural Progenitor CellsDual SMAD InhibitionNeural RosettesLentiviral TransductionNeurosphere FormationCell Migration AssayOxidative Stress AnalysisApoptosis MeasurementNestin SOX2 Expression

Powiązane artykuły