Artykuł metodologiczny

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

24.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52496

⸱

9 lutego 2015

 ,  , 
1Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Zoology, University of Cambridge

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Streszczenie

Jaja były szeroko wykorzystywane do badania rozwoju embrionalnego. Wczesny rozwój embrionalny jest napędzany przez czynniki zmagazynowane przez matkę nagromadzone podczas oogenezy. W celu zbadania roli takich czynników matczynych we wczesnym rozwoju embrionalnym, pożądane jest manipulowanie ich funkcjami od samego początku rozwoju embrionalnego. Konwencjonalne sposoby interferencji genów uzyskuje się poprzez wstrzyknięcie oligonukleotydów antysensownych (oligonukleotydów) lub mRNA do zapłodnionych komórek jajowych, umożliwiając odpowiednio niedostateczną lub nadmierną ekspresję określonych białek. Jednak metody te zwykle wymagają więcej niż kilku godzin, zanim ekspresja białka zostanie zakłócona, a zatem interferencja funkcji genów nie jest skuteczna we wczesnych stadiach embrionalnych. Tutaj wprowadzamy system eksperymentalny, w którym poziomy ekspresji białek matczynych mogą być zmieniane przed zapłodnieniem. Oocyty Xenopus laevis uzyskane z jajników są defllikulowane przez inkubację z enzymami. Oligonukleotydy antysensowne lub mRNA są wstrzykiwane do zdeflkulowanych oocytów na etapie pęcherzyka rozrodczego (GV). Oocyty te są dojrzewające in vitro do komórek jajowych na etapie metafazy II (MII), a następnie następuje docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI). W ten sposób do 10% zarodków ICSI może osiągnąć stadium pływającej kijanki, umożliwiając w ten sposób testy funkcjonalne określonego nokaucji lub nadekspresji genu. Takie podejście może być użytecznym sposobem badania roli czynników przechowywanych przez matkę we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Wprowadzenie

Xenopus laevis jest szeroko stosowanym, potężnym organizmem modelowym do badania rozwoju1. Dzieje się tak, ponieważ jaja Xenopus są niezwykle duże (około 1,2-1,4 mm, w porównaniu do odpowiedników ssaków wynoszące około 0,1 mm) i obfite. Jaja zawierają syntetyzowane i przechowywane przez matkę składniki, które są wystarczające do napędzania rozwoju embrionalnego aż do przejścia w połowie blastuli (MBT, występujące w stadium 8-8,5 z 4 000-8 000 komórek). MBT towarzyszy aktywacja genomu zygotycznego, w wyniku której następnie powstają embrionalne produkty genowe, kierujące dalszym rozwojem.

Liczne badania miały na celu zidentyfikowanie czynników matczynych ważnych dla rozwoju. Wiele badań opiera się na wstrzykiwaniu oligonukleotydów antysensownych (oligonukleotydów), w tym oligonukleotydów morfolino, do zapłodnionych zarodków, w którym to przypadku degradację białek matczynych można zaobserwować w stadiumgastruli 2-4. Alternatywnie, mRNA są wstrzykiwane do zapłodnionych zarodków w celu zakłócenia funkcji genów lub śledzenia losów nadekspresji białek. Jednak wstrzyknięcie do zarodków w stadium jednokomórkowym zwykle nie wpływa na poziom ekspresji białek matczynych w bardzo wczesnych stadiach embrionalnych przed MBT.

Heasman i Wylie ustalili metodę transferu hosta, aby rozwiązać ten problem5. W ich metodzie ręcznie odżelazione oocyty są wstrzykiwane z oligonukleotydami antysensownymi i przenoszone do samic gospodarza6. Białka są regulowane w dół przed zapłodnieniem, dzięki czemu można zbadać rolę obniżonych białek we wczesnym rozwoju embrionalnym. Ta metoda wyczerpania matczynego doprowadziła do zidentyfikowania kilku unikalnych ról rozwojowych białek matczynych, jak omówiono w 7.

W tym raporcie szczegółowo opisujemy naszą ostatnio opracowaną metodę, w której wyczerpanie lub nadekspresja mRNA u matki przed zapłodnieniem jest osiągana bez ręcznej defolkulacji i transferu gospodarza8. Ręczna defolkulacja wymaga dużo czasu, a przeniesienie gospodarza często wymaga umiejętnych technik i specjalnej licencji na chirurgię zwierząt, co utrudnia częste stosowanie metody wyczerpania matek. Defolkulacja i transfer gospodarza są podstawiane odpowiednio przez enzymatyczną defolkulację 9,10 i docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI)11-13. ICSI do jaj był pierwotnie używany do produkcji transgenicznych żab 12. Plemniki i jądra zarodkowe przeszczepiono również do dojrzałych in vitro oocytów 11,14,15. Tutaj pokazujemy naszą metodę krok po kroku wstrzykiwania plemników do dojrzałych komórek jajowych in vitro, którym wstępnie wstrzyknięto oligonukleotydy antysensowne lub mRNA.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty z żabami zostały przeprowadzone zgodnie z wymaganiami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych.

1. Przygotowanie oocytów Xenopus laevis

  1. Na około tydzień przed pobraniem oocytów należy wstrzyknąć samicom żab 150 j. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) w celu wstępnego przygotowania za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 27 G. Wstrzyknięcie wykonuje się podskórnie do grzbietowego worka chłonnego.
    UWAGA: Optymalne jest użycie żab, które nie składały jaj przez długi czas (co najmniej ponad pół roku) lub które nigdy wcześniej nie składały jaj.
  2. Wstępnie zagruntowane żaby należy przechowywać w zbiorniku na wodę ustawionym na 18 °C w pomieszczeniu z kontrolowanym oświetleniem (7–19: włączone, 19–7: wyłączone).
  3. W dniu pobrania komórek jajowych przygotować 1 l 1x zmodyfikowanego roztworu Bartha (MBS) z 10x MBS bulionu, rozcieńczając wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) i dodać penicylinę i streptomycynę w końcowym stężeniu 10 μg/ml każdy (MBS+P.S.). 10x MBS stock składa się z 880 mM NaCl, 10 mM KCl, 24 mM NaHCO3, 8,2 mM MgSO, 4,7H2O, 3,3 mMCa(NO3)2,4H2O, 4,1mM CaCl2,6H2O, 100 mM HEPES, pH 7,5.
  4. Znieczulić wstępnie przygotowaną żabę przez podskórne wstrzyknięcie 120 mg (w 400 μl) metanosulfonianu trikainy (MS222). Umieść wstrzykniętą żabę w małym zbiorniku z wodą.
  5. Po 10 minutach sprawdź znieczuloną żabę, odwracając ją na drugą stronę, ponieważ skutecznie znieczulone żaby na to nie reagują. Jeśli znieczulenie jest niepełne, dodaj lód do zbiornika i odczekaj kolejne 10 minut.
  6. Podnieś żabę z małego zbiornika i umieść w pozycji leżącej grzbietowej na wilgotnej chusteczce.
  7. Za pomocą kleszczy i małych nożyczek chirurgicznych uszczypnij skórę i wykonaj małe nacięcie (2 cm) w dolnej części brzucha, po bokach do linii środkowej. Wykonaj kolejne nacięcie po drugiej stronie.
  8. Po przecięciu skóry podnieś warstwę mięśniową za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie w warstwie mięśniowej.
  9. Obserwuj jajnik po przecięciu warstwy mięśniowej i wyciągnij jajnik z nacięć za pomocą kleszczy.
  10. Przenieść wyekstrahowany jajnik do 50 ml probówki z roztworem MBS.
    UWAGA: Postaraj się zebrać jak najwięcej jajnika z obu nacięć.
  11. Samicę żaby należy ubić przez wykrwawienie, a następnie zamrozić w celu odpowiedniego usunięcia.
  12. Przepłucz pobrany jajnik kilka razy za pomocą MBS+P.S., aż krew zostanie zmyta. Następnie przenieś jajnik na 9-centymetrową szalkę Petriego zawierającą MBS+P.S.
    UWAGA: W tym momencie sprawdź jakość oocytów pod mikroskopem preparacyjnym. Jeśli oocyty są najwyraźniej złej jakości, na przykład oocyty z nierówną pigmentacją na połowie zwierzęcia (ryc. 1A), nie należy kontynuować procesu i zamiast tego uzyskać nowy jajnik. Idealnie, oocyty powinny mieć równomiernie pigmentowane półkule zwierzęce i być w przybliżeniu równej wielkości.
  13. Rozdrobnij jajnik na małe kawałki (1-2cm2) i zbierz 5 ml oocytów do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  14. Przepłukać kilkakrotnie 5 ml rozerwanego jajnika za pomocą MBS+P.S. i dodać MBS+P.S. do 15 ml.
  15. Dodać 7 jednostek enzymu do deffolikulacji do zawiesiny jajnika (patrz Lista materiałów).
    UWAGA: Rozpuść liofilizowany enzym w 10 ml ddH2O (28 jednostek/ml). Umieścić fiolkę na 30 minut na lodzie, od czasu do czasu delikatnie obracając. Porcja 250 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  16. Inkubować część jajnika z enzymem przez 1 godzinę, delikatnie potrząsając wytrząsarką (prędkość 15 obr/min, co odpowiada około 0,014 x g).
    UWAGA: Aby prawie całkowicie usunąć komórki pęcherzykowe, zwykle potrzebna jest inkubacja z enzymem trwająca od 2 godzin do 2 godzin i 15 minut. Dłuższa inkubacja jest potrzebna do eksperymentu z transferem jądra oocytu16.
  17. Po 1 godzinie inkubacji pobrać niewielką liczbę leczonych oocytów (10-20 oocytów) i przenieść na 6-centymetrową szalkę Petriego zawierającą MBS+P.S. Sprawdź zakres defollikulacji pod mikroskopem preparacyjnym. Jeśli oocyty zostaną oddzielone od siebie i przynajmniej częściowo zdefolikulowane (ryc. 1B), natychmiast przejdź do następnej reakcji zatrzymania (krok 18). Jeśli oocyty są nadal silnie otoczone komórkami pęcherzykowymi, inkubuj przez maksymalnie dodatkowe 15 minut.
  18. Dodać dużo MBS+P.S., aby zatrzymać reakcję i odrzucić supernatant. Powtórz pranie 10 razy.
    UWAGA: Dodać MBS+P.S., przelewając do ścianki probówki o pojemności 50 ml, ale nie bezpośrednio do oocytów. Po zawieszeniu w MBS + P.S. małe niedojrzałe oocyty mają tendencję do unoszenia się na górze bufora myjącego i odrzucania takich małych pływających oocytów.
  19. Po umyciu przenieść na 9-centymetrową szalkę Petriego zawierającą MBS+P.S.
    UWAGA: Począwszy od tego etapu, utrzymuj oocyty w temperaturze 16-18 °C tak długo, jak to możliwe. Można to zrobić, utrzymując naczynie zawierające oocyty w temperaturze kontrolowanej.
  20. Wybrać oocyty VI stopnia zgodnie z klasyfikacją Dumonta do kolejnych zastosowań i przenieść na nową 9 cm szalkę Petriego zawierającą MBS+P.S. Transfer oocytów można wykonać za pomocą szklanej pipety o odpowiednim rozmiarze końcówki (większej niż rozmiar oocytu).
    UWAGA: Dobrej jakości oocyty powinny mieć równomiernie pigmentowaną półkulę zwierzęcą z wyraźnym kontrastem między półkulą zwierzęcą a półkulą roślinną i być w przybliżeniu równej wielkości (ryc. 1C). Oocyty w stadium VI reprezentują w pełni rozwinięte oocyty, które mogą reagować na progesteron (średnica oocytu wynosi około 1,2-1,4 mm).

2. Wstrzykiwanie oligonukleotydów antysensownych lub mRNA do oocytów

UWAGA: Wszystkie kroki w tej sekcji powinny być wykonywane w temperaturze 16-18 °C na stoliku mikroskopowym wyposażonym w wodę obiegową o kontrolowanej temperaturze lub na plastikowym pudełku wypełnionym lodem.

  1. Przenieś 200-300 wybranych oocytów na nową 9 cm szalkę Petriego wypełnioną MBS+P.S., w której zostanie wykonana mikroiniekcja.
    UWAGA: W każdym stanie zwykle używa się 200-300 oocytów. W sumie w jednym eksperymencie wykorzystuje się około 1000 oocytów.
  2. Aby przygotować wstrzyknięcie oligonukleotydów antysensownych lub mRNA, należy wysunąć metalowy tłok mikroiniektora.
  3. Napełnij szklaną kapilę olejem mineralnym za pomocą strzykawki i włóż szklaną kapilarnę wypełnioną olejem do metalowego tłoka mikrowtryskiwacza.
    UWAGA: Szklana kapilara jest ciągnięta za pomocą ściągacza do mikropipet. Igły te są przechowywane w pudełku bez uszkadzających końcówek.
  4. Odetnij końcówkę igły za pomocą małych nożyczek chirurgicznych pod mikroskopem, celując końcówką o jak najmniejszej średnicy do wstrzyknięcia.
    UWAGA: Końcówkę igły można naostrzyć za pomocą mikrokuźni lub ukosownika do mikropipet. Ukosowanie igły pod kątem 25° poprawia zdolność penetracji ściany oocytu.
  5. Umieść mały pasek Parafilmu na stoliku mikroskopu preparacyjnego i dozuj 3 μl kropli antysensownego roztworu oligo lub mRNA.
  6. Wsunąć końcówkę igły do wstrzykiwań w małą kroplę roztworu i napełnić igłę roztworem, który ma być wstrzyknięty.
    UWAGA: Jeśli końcówka igły iniekcyjnej jest zbyt mała, na końcówce metalowego tłoka powinny pojawić się pęcherzyki powietrza. Następnie należy nałożyć większą końcówkę na igłę do wstrzykiwań, aż do momentu, gdy tak się nie stanie.
  7. Oznaczyć igłę do wstrzykiwań w odległości około 0,5 mm od końcówki. Znak ten służy jako wskaźnik głębokości wtrysku.
  8. Włóż końcówkę igły do komórki jajowej wzdłuż granicy równikowej, kierując się do środkowego punktu oocytu (pod pęcherzykiem zarodkowym), delikatnie przytrzymując kleszczami przeciwną stronę oocytu do punktu wstrzyknięcia, aby zapobiec niepożądanemu ruchowi oocytu podczas wstrzyknięcia.
    UWAGA: Znajdź obszar wolny od komórek mieszków włosowych (ryc. 1B) i włóż igłę z tego miejsca, ponieważ nawet cienka igła często nie może przeniknąć przez warstwę komórek mieszków włosowych.
  9. Wyrzuć 4,6 ng/4,6 nl lub 9,2 ng/9,2 nl oligonukleotydów antysensownych lub odpowiednią objętość mRNA (250 pg do 13,8 ng) za pomocą przełącznika nożnego. Szczegóły preparatu oligo antysensownego opisano w punkcie 7.
  10. Przenieś wstrzyknięte oocyty na 6-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną MBS+P.S. uzupełnioną 0,1% BSA (pożywka do inkubacji oocytów; wysterylizuj roztwór za pomocą filtra porowego 0,45 μm).
  11. Inkubować oocyty w temperaturze 16 °C lub 18 °C przez 1-2 dni.
    UWAGA: Wstrzyknięte oocyty można poddać dojrzewaniu in vitro kilka godzin po wstrzyknięciu, w którym to przypadku preferowane jest wstrzyknięcie 4,6 ng oligonukleotydów antysensownych. Ogólna zasada jest taka, że im krótszy jest okres inkubacji, tym lepszy jest późniejszy rozwój embrionalny.

3. Dojrzewanie in vitro (IVM) oocytów

  1. Wieczorem w dniu eksperymentu dojrzewania oocytów pobrać roztwór podstawowy progesteronu (30 mM w etanolu) z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozpuścić osady w temperaturze pokojowej z okazjonalnymi wirami.
    UWAGA: Zapas progesteronu zwykle pozostawia się w temperaturze pokojowej na 30 minut do 1 godziny.
  2. Dodać 5 μl bulionu progesteronu do 50 ml MBS+P.S. (pożywka dojrzewająca; końcowe stężenie progesteronu przy 3 μM) i wstrząsać na wytrząsarce przez 30 minut, aby równomiernie rozprowadzić progesteron w roztworze.
  3. Przygotuj 6 cm pokryte agarozą naczynia do zabiegu dojrzewania in vitro.
    1. Dodaj 1 g agarozy do 50 ml 1x MBS bez magnezu i wapnia.
    2. Rozpuść agarozę przez podgrzanie w kuchence mikrofalowej.
    3. Wlej niewielką objętość roztworu agarozy do 6 cm naczyń, aby przykryć dno naczyń.
    4. Odczekaj co najmniej 30 minut do zestalenia.
    UWAGA: Powłoka agarozowa zapobiega przywieraniu oocytów do szalek. Gdy dojrzałe w warunkach in vitro oocyty zostaną ściśle przytwierdzone do szalek, najprawdopodobniej oocyty zostaną aktywowane przez bodźce, które otrzymują podczas odrywania się od szalek.
  4. Wlej 5-8 ml pożywki do dojrzewania do szalek pokrytych agarozą i przenieś 200-300 oocytów do każdych 6 cm szalek.
    UWAGA: Staraj się przenosić oocyty z minimalną ilością pożywki do inkubacji oocytów.
  5. Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 16 °C.
    UWAGA: Na przykład rozpocznij kurację o godzinie 17 i zakończ o 9 rano następnego dnia.

4. Docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI)

  1. Preparat z mrożonego nasienia
    UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu dojrzewania oocytów należy wykonać następujące przygotowanie nasienia, a zamrożone zapasy nasienia należy przechowywać w temperaturze -80 °C dla ICSI.
    1. Zbierz jądra od samca żaby, wykonując kroki od 1.4 do 1.11, z wyjątkiem wyciągania tłuszczu i jąder z nacięć za pomocą kleszczy i usuwania jąder z tłuszczu.
    2. Umyj jądra w 1x zmodyfikowanym Pierścieniu Marca (MMR, 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7,4).
    3. Usuń tłuszcz i naczynia krwionośne, zwijając umyte jądra na czystej bibułce, a następnie usuwając pozostałe naczynia krwionośne za pomocą kleszczy.
    4. Umieścić każde jądro na szalce Petriego o średnicy 3,5 cm zawierającej 1 ml 1x MMR.
    5. Pokrój wzdłuż cienkimi nożyczkami i rozerwij na małe kawałki kleszczami, aż nie pozostaną żadne duże kawałki.
    6. Pipetować w górę i w dół za pomocą plastikowej końcówki o pojemności 1 ml, której koniec jest przecięty, i załadować 1 ml rozdrobnionego roztworu jądra do szklanego homogenizatora.
    7. Homogenizuj je przez 2-3 pociągnięcia, a następnie wlej roztwór na filtr porowy 50 μm przymocowany do górnej części probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Poczekaj, aż roztwór przejdzie przez filtr.
    8. Powtórzyć krok 4.1.7, ponownie zawieszając pozostałe jądra w 1 ml 1x MMR. Na koniec umyj homogenizator kilka razy 1x MMR i przepuść go przez filtr.
    9. Powtórzyć kroki 4.1.5-4.1.8 dla drugiego jądra i połączyć dwa jądra w jednej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    10. Wirować komórki w temperaturze 800 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    11. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w 2 ml 1x MMR. Następnie przenieś do nowej tuby.
      UWAGA: Upewnij się, że nie ma widocznych komórek krwi.
    12. Przygotować gradient stopniowy w ultra przezroczystej probówce wirówkowej o pojemności 14 ml. Dolna warstwa: 4 ml 30% jodiksanolu. Druga dolna warstwa: 1 ml 20% jodiksanolu. Trzecia dolna warstwa: 5 ml 12% jodiksanolu. Górna warstwa: komórki jądra w 2 ml 1x MMR. Bardzo delikatnie nałóż gradienty za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml (nakładaj powoli, aby nie zakłócić dolnej fazy).
      UWAGA: Tylko jedna warstwa 30% jodiksanolu powinna również działać tylko w przypadku izolacji plemników.
    13. Wirować wirnik SW40 za pomocą ultrawirówki przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut (zwalnianie bez przerwy).
    14. Delikatnie wyjmij probówkę z ultrawirówki. Potwierdź interfejs między każdą warstwą gradientu a granulką na dole.
    15. Zbierz frakcję plemników z osadu.
    16. Ponownie zawiesić osad nasienia w 1x MMR w celu wypłukania jodiksanolu. Wirować w temperaturze 800 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min.
      UWAGA: Jeśli po wirowaniu w zawiesinie nadal pozostaje dużo plemników, należy ponownie odwirować supernatant w temperaturze 3 220 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut i zebrać granulowane plemniki.
    17. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad plemnika w 1 ml 1x buforu do przygotowania jądrowego (NPB; 250 mM Sacharozy, 0,5 mM trichlorowodorku spermidyny, 0,2 mM Tetrachlorowodorek sperminy, 1 mM EDTA, 15 mM HEPES, pH 7,7)13. Następnie przenieś do probówki Eppendorfa.
    18. Dodać 50 μl 10 mg/ml roztworu digitoniny do 1x NPB (Zawiesić digitoninę w proszku w DMSO w stężeniu 50 mg/ml i zamrozić podwielokrotności w temperaturze -80 °C. Przed użyciem rozcieńczyć porcję 50 mg/ml do 10 mg/ml 1x NPB. Niewykorzystane 10 mg/ml digitoniny można zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C i użyć ponownie) do 1 ml roztworu nasienia.
    19. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    20. Sprawdź szybkość przepuszczalności przez barwienie DAPI (0,3 μg/ml DAPI jako stężenie końcowe). Jeśli mniej niż 95% komórek jest przepuszczalnych, inkubuj nieco dłużej.
      UWAGA: Czasami, jeśli inkubuje się zbyt wiele plemników w tym samym czasie (zwłaszcza gdy plemniki są pobierane z wielu jąder), trudno jest przeniknąć, w takim przypadku może być konieczne dodanie dodatkowej niewielkiej ilości digitoniny; na przykład, jeśli 20% plemników nie jest przepuszczalnych, dodaje się dodatkowe 20 μl digitoniny.
    21. Zatrzymaj przepuszczalność, dodając 10% BSA do 3% stężenia końcowego.
    22. Wirować komórki w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Staraj się jak najmniejszą prędkość wirowania, zaczynając od 100 x g przez 5 minut. Jeśli to nie wystarczy, zwiększ prędkość i/lub czas.
    23. Przemyć komórki 0,3% BSA w 1x NPB i odwirować z tą samą prędkością, co w kroku 4.1.22. W międzyczasie przygotuj bufor do przechowywania plemników (SSB; 2 ml 2x NPB, 120 μl 10% BSA, 1,2 ml autoklawizowanego glicerolu, 680 μlH2O).
    24. Dodać 500 μl SSB do osadu nasienia. Pipetować kilka razy w górę i w dół, aby ponownie zawiesić za pomocą odciętej końcówki, aby nie uszkodzić komórek.
    25. Pozostawić do zrównoważenia przez noc w temperaturze 4 °C.
    26. Kilkakrotnie pipetuj komórki w górę i w dół za pomocą odciętej końcówki.
    27. Rozcieńczyć kilka mikrolitrów 10 razy w 1x MMR lub w 1x PBS, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
    28. Zamrażać w postaci podwielokrotności w ilości 30 000 plemników/μl (lub wyższej) bezpośrednio w temperaturze -80 °C i przechowywać w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach jednorazowego użytku.
  2. ICSI do oocytów dojrzałych in vitro
    UWAGA: Wszystkie procesy z udziałem oocytów powinny odbywać się w temperaturze 16-18 °C.
    1. Przygotuj szklaną pipetę do przenoszenia dojrzałych oocytów.
      UWAGA: Szklana pipeta musi być wystarczająco szeroka, aby pomieścić oocyty bez ściskania.
    2. Szesnaście godzin po przeniesieniu oocytów do pożywki zawierającej progesteron, dojrzałe oocyty przenieść do 6 cm naczynia pokrytego agarozą wypełnionego MBS+P.S. do mycia.
      UWAGA: Co ważne, dojrzałe oocyty muszą być traktowane niezwykle ostrożnie. Nieostrożne traktowanie oocytów może wywołać spontaniczną aktywację przed wstrzyknięciem plemników.
    3. Policz dojrzałe oocyty, potwierdzając pojawienie się białych plam, co sugeruje rozpad pęcherzyków rozrodczych (ryc. 2). Jeśli tempo dojrzewania jest mniejsze niż 80%, jest mało prawdopodobne, aby uzyskano wystarczającą liczbę zarodków, które przeżyły, do dalszych analiz.
      UWAGA: Pozostałe komórki pęcherzykowe są złuszczane po dojrzewaniu oocytów (ryc. 2).
    4. Przenieś oocyty z mycia MBS do nowego, pokrytego agarozą naczynia o średnicy 6 cm wypełnionego podłożem do iniekcji (przygotuj 500 ml: 30 g Ficollu (6%), 20 ml 10x MMR i 500 μl 1,000x bulionu PS).
    5. Inkubować przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem ICSI.
    6. Ustaw mikrowtryskiwacz zgodnie z opisem w krokach 2.2-2.4.
      UWAGA: Rozmiar końcówki igły do wstrzykiwań powinien być jak najmniejszy, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.6. Średnica igły wynosi 20-40 μm. Ukosowanie końcówki igły zgodnie z opisem w kroku 2.4 może umożliwić skuteczne wstrzyknięcie.
    7. Pobrać porcję nasienia i rozcieńczyć zawiesinę nasienia w buforze do rozcieńczania plemników (SDB; 250 mM Sacharozy, 75 mM KCl, 0,5 mM Spermidyna, 0,2 mM Spermina, 200 μM HEPES pH 7,5).
      UWAGA: Rozcieńczenie może być różne w zależności od rozmiaru igły i tak dalej. Rozcieńczyć 120 razy z 30 000 plemników/μl jako pierwszą próbę i w razie potrzeby dostosuj dalej.
    8. Umieść mały pasek Parafilmu na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Wymieszaj roztwór do wstrzykiwań nasienia przez pipetowanie i dozuj kilka μl kropli roztworu nasienia.
    9. Zassać rozcieńczoną zawiesinę nasienia do igły, wstrzyknąć 4,6 nl do 10 kolejnych kropli zawierających 0,3 μg/ml DAPI na szkiełku mikroskopowym i szybko policzyć liczbę plemników dostarczonych w jednym wstrzyknięciu pod mikroskopem fluorescencyjnym.
      UWAGA: Celuj w 1-2 plemniki na wstrzyknięcie. W razie potrzeby należy bardziej rozcieńczyć roztwór do wstrzykiwań nasienia i ponownie sprawdzić liczbę plemników w każdym wstrzyknięciu, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia.
    10. Wysunąć testowy roztwór do wstrzykiwań i napełnić nowy roztwór do wstrzykiwań nasienia o odpowiednim stężeniu.
    11. Wstrzyknąć 4,6 nl roztworu nasienia do 100 dojrzałych oocytów.
      UWAGA: Ważne jest, aby wstrzykiwać roztwór w sposób ciągły. Najpierw określ czas potrzebny do wyrzucenia 4,6 nl (zwykle 1-2 sekundy). Powtórz następujący proces; Wstrzyknąć do komórki jajowej, odczekać kilka sekund, usunąć igłę i pozorować wstrzyknięcie w roztworze do wstrzykiwań, odczekać kilka sekund, wstrzyknąć komórkę jajową. To ciągłe wstrzykiwanie zapobiega również blokowaniu końcówki igły. Alternatywnie można zastosować metodę z użyciem pompy13.
    12. Po około 100 wstrzyknięciach wyrzuć pozostały roztwór nasienia i ponownie napełnij roztwór nasienia (użyj tego samego roztworu nasienia, ale przed dozowaniem pipetuj w górę i w dół).
      UWAGA: Jeśli igła nie zasysa dobrze roztworu nasienia, odetnij końcówkę igły. Jeśli to nie poprawi sytuacji, przygotuj nową igłę.
    13. Powtarzaj proces wstrzykiwania, aż wszystkie oocyty zostaną wstrzyknięte.
      UWAGA: Jeśli jakość oocytów jest dobra, a wstrzyknięcie się powiedzie, skurcz wstrzykniętych oocytów jest widoczny w ciągu 20 minut od czasu wstrzyknięcia.
    14. Przenieść wstrzykiwane naczynia do inkubatora o temperaturze 16 °C lub 18 °C.
    15. 4-5 godzin po wstrzyknięciu sprawdź stopień rozszczepienia zarodków ICSI.
      UWAGA: Bruzdy rozszczepienia tych zarodków mogą nie być tak wyraźne, jak u normalnych zarodków zapłodnionych. Niektóre zarodki wykazują również nieprawidłowe rozszczepienia, które mogą być spowodowane wielokrotnym wstrzyknięciem plemników.
    16. Przenieść rozszczepione zarodki, w tym nieprawidłowo rozszczepione zarodki, do podłoża inkubacyjnego (Przygotuj 500 ml: 20 g Ficollu (4%), 5 ml 10x MMR i 500 μl 1,000x P.S.).
    17. Inkubować zarodki w inkubatorze w temperaturze 16 °C lub 18 °C przez noc.
    18. Następnego ranka przenieś zarodki do 0,1x MMR i policz zarodki, które przeżyły.
    19. Średnio około 10% oocytów wstrzykniętych plemnikom może rozwinąć się do stadium pływającej kijanki (ryc. 3A).

Wyniki

Zbadano rozwój embrionalny zarodków ICSI z oocytów dojrzewających in vitro (Rycina 3A). Wskaźniki dojrzewania oocytów w stadium GV do stadium MII są zmienne i w dużej mierze zależą od jakości oocytów. W pomyślnych eksperymentach prawie 100% oocytów GV reaguje na progesteron i wykazuje oznaki dojrzewania, ostatecznie stając się komórkami jajowymi w stadium MII. Wszystkie dojrzałe oocyty poddano procedurze ICSI, a około 25% wstrzykniętych komórek jajowych uległo podziałowi (Rycina 3A, n = 13 dla oocytów wstrzykniętych z kontrolnym oligo-scrambled oraz n = 7 dla oocytów bez wstrzykniętego oligo). Około 60% lub 80% podzielonych zarodków, otrzymanych odpowiednio z oocytów wstrzykniętych z kontrolnym oligo lub oocytów niewstrzykniętych, osiągnęło stadium blastuli/gastruli. Wśród zarodków w stadium blastuli/gastruli, około połowy w próbkach z wstrzykniętym oligo była dobrej jakości (prawie brak oznak nieprawidłowego podziału i apoptozy), podczas gdy w próbkach niewstrzykniętych 82% zarodków w stadium blastuli/gastruli było dobrej jakości (Rycina 3A). Ostatecznie odpowiednio 41% i 11% podzielonych zarodków w próbkach z wstrzykniętym oligo osiągnęło stadium reakcji mięśniowej oraz stadium pływającego kijanki, podczas gdy w próbkach niewstrzykniętych odpowiednio 60% i 29% podzielonych zarodków osiągnęło te stadia (Rycina 3A). Zarodki ICSI stanowią mieszaninę zarodków prawidłowych i nieprawidłowych (Rycina 3B). Niektóre z nich przechodzą metamorfozę i rozwijają się w dorosłe żaby8. Wyniki te sugerują, że wstrzyknięcie oligosomów antysensownych do oocytów GV, a następnie IVM i ICSI, pozwala na efektywny wczesny rozwój embrionalny. Chociaż samo wstrzyknięcie oligosów antysensownych obniża tempo rozwoju embrionalnego, nadal jesteśmy w stanie uzyskać wystarczającą liczbę zarodków do wielu celów eksperymentalnych, takich jak sprawdzanie tempa rozwoju, RT-PCR, western blot i inne.

Obraz mikroskopowy mikroiniekcji w komórkach embrionalnych, ilustrujący wczesne etapy podziału komórkowego.
Rysunek 1: Typowe przykłady oocytów Xenopus laevis dobrej lub złej jakości do eksperymentów z dojrzewania in vitro. (A) Przykład oocytów złej jakości. Na przykład oocyty wykazujące niejednorodną pigmentację nie są wykorzystywane w dalszych eksperymentach. Każdy oocyt Xenopus laevis ma średnicę około 1,2-1,4 mm. (B) Częściowo defolikulowany oocyt. Prawa połowa oocytu jest pokryta komórkami treścifolikularnymi, co można rozpoznać po obecności naczyń krwionośnych. Strzałka wskazuje obszar wolny od komórek treścifolikularnych, w który wprowadzana jest igła do iniekcji. (C) Przykład oocytów dobrej jakości, które mają jednakowe rozmiary i wykazują równomiernie pigmentowane półkule zwierzęce z wyraźnym kontrastem między półkulą zwierzęcą a roślinną.

Proces dojrzewania oocytów; obraz mikroskopowy przedstawia oocyty przed i po dojrzewaniu.
Rysunek 2: Xenopus laevis oocyty przed i po dojrzewaniu. Po dojrzewaniu oocytów na szczycie półkul zwierzęcych pojawiają się wyraźne białe plamki, a komórki pęcherzyka ulegają złuszczeniu. Każdy oocyt Xenopus laevis ma średnicę około 1 mm.

Wykres rozwoju embrionów z obrazami kijankami; porównuje tempo podziałów, blastulę oraz dane dotyczące odpowiedzi mięśniowej.
Rysunek 3: Rozwój embrionów ICSI powstałych z oocytów dojrzałych in vitro. (A) Podsumowanie rozwoju embrionów ICSI do poszczególnych stadiów. Oocyty wstrzyknięto z kontrolnymi, przetasowanymi oligonukleotydami antysensownymi (wstrzyknięcie oligo kontrolnego) lub pozostawiono bez wstrzykiwania (brak wstrzyknięcia), a następnie przeprowadzono IVM i ICSI. Odpowiednia liczba embrionów w każdym stadium jest podana nad słupkami. Przedstawiono średnią ± SEM. N = 4-13 niezależnych eksperymentów/różnych samic. (B) Przykłady przeżywających embrionów ICSI. Embriony w stadium guzka ogonowego powstały w jednym eksperymencie, w którym jako materiał wyjściowy wykorzystano około 200 oocytów.

Dyskusja

Szczegółowo opisujemy tutaj nową metodę wyczerpywania czynników matczynych lub nadmiernej ekspresji czynników egzogennych przed zapłodnieniem. System ten wymaga dwóch mikroiniekcji, ale zamiast tego pomija operację żab, stosowaną w metodzie transferu gospodarza7,17. Optymalne jest usunięcie etapu operacji żaby z punktu widzenia opieki nad zwierzętami. Co więcej, w eksperymentach transferowych nie musimy brać pod uwagę jakości samic żab żywicielskich, co oznacza, że możemy pozbyć się jednego czynnika biologicznego, który wpływa na powodzenie eksperymentów. Dlatego w tym systemie jakość oocytów uzyskanych od żab zaszczepionych PMSG jest głównym czynnikiem biologicznym, który ma kluczowe znaczenie dla udanych eksperymentów. Jakość oocytów można ocenić po pobraniu jajnika lub po deffolikulacji. Jeśli na tych etapach zaobserwuje się jakiekolwiek nieprawidłowości, optymalne jest pobranie kolejnego jajnika od nowej żaby. Kolejnym punktem, w którym można sprawdzić jakość oocytów, jest okres po dojrzewaniu oocytów. Jeśli mniej niż 80% oocytów leczonych progesteronem wykazuje oznaki dojrzewania, możesz nie być w stanie uzyskać wystarczającej liczby zarodków do dalszych analiz. Zastosowanie defoliacji enzymatycznej zamiast ręcznej defolkulacji jest również kolejną zaletą stosowania tego systemu w celu zmniejszenia nakładu pracy wymaganego do defoglikulacji. Jednak nadal możliwe jest, że ręczna defolkulacja może dać lepszy rozwój niż leczenie enzymatyczne.

Jak pokazano na rycinie 3, prawie 10% dojrzałych komórek jajowych in vitro może osiągnąć stadium pływającej kijanki. Dane te zostały zebrane z 13 niezależnych eksperymentów, w tym z 8 i nowych eksperymentów z iniekcjami. Metoda transferu gospodarza wymaga 75-150 oocytów w każdym zabiegu, aby uzyskać znaczące dane, ponieważ 30-60% przenoszonych oocytów może osiągnąć stadiumneuruli 17. Nasza metoda zwykle zaczyna się od 200-300 oocytów w każdej grupie eksperymentalnej, ponieważ około 40-60% rozszczepionych zarodków może osiągnąć etap odpowiedzi mięśniowej. Dane te sugerują, że obie metody wspierają rozsądne tempo rozwoju. Do tej pory uzyskaliśmy 10 żywych żab z kontrolnych oocytów, którym wstrzyknięto mRNA i kontrolne oligocyty wstrzyknięte antysensownym oligocytom przy użyciu tej techniki, co wskazuje, że takie podejście wspiera rozwój poprzez metamorfozę.

Nasza metoda manipulacji oocytami – ICSI daje możliwość zbadania roli czynników matczynych podczas bardzo wczesnego rozwoju embrionalnego, wkrótce po zapłodnieniu. Ponadto nadekspresja czynników modyfikujących chromatynę przed zapłodnieniem może umożliwić przebudowę matczynej chromatyny przed zapłodnieniem w celu zrozumienia matczynych stanów chromatyny niezbędnych do rozwoju. Strategia ta może również dobrze działać z obecnymi systemami edycji genów, takimi jak nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji (TALEN)18,19 i CRISPR/CAS920,21 , ponieważ mogą one ulegać ekspresji nawet przed zapłodnieniem. Dlatego nasze nowe podejście ma potencjał, aby w przyszłości znaleźć zastosowanie w wielu aplikacjach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni członkom laboratorium Gurdon za pożyteczną dyskusję. K.M. jest pracownikiem naukowym w Wolfson College i jest wspierany przez Herchel Smith Postdoctoral Fellowship oraz Great Britain Sasakawa Foundation. Laboratorium Gurdon jest wspierane przez granty Wellcome Trust (RG69899) i MRC dla J.B.G.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Gonadotropina surowicy klaczy w ciąży (PMSG) MSD Animal HealthVm 01708/4309PMSG-Intervet 5000iu proszek i rozpuszczalnik do roztworu do wstrzykiwań
Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (MS222)SigmaA5040Do znieczulenia
Liberase TM Research GradeRoche05 401 127 001Do defoliulacji oocytów. Przechowywać w temperaturze -20  °C.
Drummond NanojectDrummond Scientific Company3-000-205/206Do szklanej kapilary mikroiniekcyjnej
 Laboratoria Alpha7" Drummond #3-000-203-G/XLmikropipet do mikroiniekcji
 SUTTER InstrumentModel D-97Do mikroiniekcji
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500Do dojrzewania in vitro i ICSI
14 ml ultra-przezroczysta probówka wirówkowa Beckman Coulter United Kingdom Ltd344060Do oczyszczania plemników
OptiPrep Density Gradient Medium (Jodixanol)SigmaD1556Do oczyszczania plemników
DigitoninaSigmaD141Odczynnik do przenikania komórek
ShakerHybaid HB-SHK-1do defolikulacji oocytów
(mikroskop stereoskopowy z zoomem)ZEISSSemi SV6Do pobierania oocytów i mikroiniekcji
50 μ m filtr porówCellTrics04-0042-2317Do oczyszczania nasienia
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima L-100XPDo oczyszczania nasienia
50 ml probówka wirówkowaCellstar Greiner Bio-One227261 lub 210261Reakcja pobierania i defolkulacji oocytów
15 ml Probówka wirówkowaFALCON352097Do oczyszczania plemników
90 mm Petri danie Thermo Scientific101VR20/C
Easy-Grip Naczynie do hodowli komórkowych, 60  x  15 mmNaczynie do353004
Easy-Grip, 35  x  15 mmFALCON351008
Do ściągacza do Do mikroskopu preparacyjnego hodowli komórkowych FALCON

Bibliografia

  1. Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).
  2. Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).
  3. Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos. Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).
  4. Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus. Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).
  5. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).
  6. Heasman, J., et al. Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos. Cell. 79 (5), 791-803 (1994).
  7. Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes. Methods. 51 (1), 75-81 (2010).
  8. Miyamoto, K., et al. Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development. Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).
  9. Halley-Stott, R. P., et al. Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming. Methods. 51 (1), 56-65 (2010).
  10. Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter. Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).
  11. Amaya, E., Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).
  12. Kroll, K. L., Amaya, E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).
  13. Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection. Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).
  14. Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis. Cell. 4 (3), 269-274 (1975).
  15. Smith, L. D., Ecker, R. E. Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens. Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).
  16. Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes. Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).
  17. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis). Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Sakane, Y., et al. Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases. Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).
  20. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  21. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wstrzykiwanie oligonukleotyd w antysensownychstadium p cherzyka zarodkowegostadium metafazy IIfrakcja naczyniowo stromalnacytometria przep ywowamikroskopia konfokalnaWestern blot
Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.